（分析化学专业论文）高灵敏度电容型免疫传感器的研制.pdf

复旦土学硕士学位论文高灵敏度电容型免疫传威器的研制 摘要 免疫传感器是利用抗原抗体之间存在特异性互- * 1 - 结构的特性而制得的新型 生物传感器。该传感器具有高度的特异选择性和极低的检测限，可广泛应用于临 床诊断、药物筛选、环境监控及食品分析等诸多领域。在众多的免疫分析方法， 电容免疫分析法利用抗原抗体结合后电极表面生物膜厚度增加将引起电极电容 值变化的原理，直接监控免疫反应发生程度，具有较高的灵敏度；同时该方法操 作简单易行，无需对目标物质进行标记，因此成为近几年免疫分析研究的热点。 我国是肝病多发地区。肝纤维化作为肝病变的重要阶段，是诸多慢性肝炎向 肝硬化发展的必经阶段，也是慢性肝炎的共同病理特征。灵敏的探测血清中肝纤 维化标志物的含量对于肝病早期诊断具有重要价值。实验中选定肝纤维化标志物 一透明质酸和层胶粘蛋白抗原及其相关受体分子一透明质酸结合蛋白作为目标 模型，采用金电极自组装法及溶胶凝胶法固定抗体分子，构建高灵敏度电容型免 疫传感器用于联合测定抗原分子。 论文分为三个部分： 一免疫传感器概述 分别从免疫传感器原理、免疫传感器的制备、免疫分析方法、电容免疫分析 法、电容测定方法及本论文的意义等六个方面对该领域研究概况进行评述。 二 基于金电板组装技术构建电容型免疫传感器 实验中利用金电极自组装技术，采用e d c n h s 胶联剂共价固定抗体分子在 羧基修饰的金电极表面，构建电容型免疫传感器。在施加电位脉冲后，该传感器 电流呈现指数衰减，证明构建的电极体系接近于理想r c 模型，可采用电位阶跃 法在毫秒级时间内测定传感器电容值，以监控其对不同浓度抗原的响应。结果表 明，在5 5 0 0 n g m l 抗原浓度范围内，免疫传感器对目标抗原有良好的线性响 应，对其它非特异性抗原响应较小，显示构建的传感器具有较高的灵敏度乖较好 的选择j 生。增加组装抗体分子巯基化合物链的长度，传感器灵敏度下降，表明较 厚的生物膜将减小抗原抗体结合后产生的电极电容变化，劣化传感器性能。 为使抗体分子能够固定在胺基自组装表面以扩展金电极自组装方法构建免 复旦大学硕士学位论文高灵敏度电容型屯疲传感器晴研嘲 疫传感器应用范围，实验中引入戊二醛胶联剂固定抗体分子，成功构建电容型免 疫传感器。由于戍二醛的引入，组装生物膜的厚度增大，使得该免疫传感器的灵 敏度为1 0 n g m l ，检测范围为1 0 2 0 0 n g m l 。两种方法构建的电容型免疫传感 器在1 0 1 0 0 m mp b s 溶液中绝缘膜没有被破坏，具有较好的稳定性。降低溶液 d h 值至4 ，绝缘生物膜表面开始出现针孔，使得基于以上方法制备的免疫传感 器再生性较差。 由于组装过程中使用多晶金电极表面具有一定的粗糙度，将使电容型免疫传 感器表面生物绝缘膜存在非电容性。实验中引入恒相位元件的物理模型，基于 r ( r q ) 电路，采用交流阻抗技术证实该非电容性的存在。升高表面生物膜电阻值 将减小其非电容性现象。通过引入恒相位元件精确描述该体系，该传感器的灵敏 度可有效提高到5 0 p g m l 。 三基于纳米溶胶，凝胶体系的电容型免疫传感器的构建 为简化电极制备过程，并保持固定生物分子的活性，本文合成超薄a 1 2 0 3 凝 胶膜( 2 0 4 0 r i m ) 用于包埋抗体分子，构建电容型免疫传感器。由于该层膜处 于r i m 级，因此抗原抗体反应进行程度可采用电位阶跃法测定电极体系电容值加 以监控；辅以多通道采点体系，可实现多通道免疫分析。实验中构建的免疫阵列 对于1 2 0 0 n g m li g g 抗原分子具有良好的线性响应，优于基于s i 0 2 凝胶体系 构建的免疫传感器。同时该体系具有较高的特异选择性，能够对透明质酸及层粘 连蛋白的混合抗原溶液进行联合测定，分别在l 1 0 0 n g m l ，0 5 1 0 0 n g m l 范 围内对特异性结合蛋白有良好的线 生响应。由溶液中存在的非特异性蛋白引起的 测定误差小于1 5 ，表明该传感器有望应用于临床检测。 关键词：电容型免疫传感器肝纤维化标志物金电极自组装技术溶胶凝胶体系 i i 复旦大学硕士学位论文高灵敏度电容型免疫传感器的研制 a b s t r a c t i m m u n s e n s o r sh a v ed r a w nm u c ha t t e n t i o nw i t hah i g hs e l e c t i v i t ya n ds e n s i t i v i t y f o rt h eh i g hs p e c i f i c i t ya n da f f i n i t yo fa na n t i b o d yw i t hi t sa n t i g e n t h e yh a v eb e e n s u c c e s s f u l l ya p p l i e di n c l i n i c a la n dp h a r m a c e u t i c a lc h e m i s t r y ，f o o dm o n i t o r i n ga n d b i o c h e m i s t r ya n a l y s i sa sw e l la sc o n t a m i n a n t si nt h ee n v i r o n m e n t a la r e a a m o n ga l l i m m u n o a s s a y s ，c a p a c i t i v ei r n m t m o a s s a yh a da r r a c t e dm o r ei n t e r e s t sr e c e n t l yf o ra h i g h e rs e n s i t i v i t y , d i r e c ta n a l y s i sa n dl e s sc o m p l i c a t e di n s t r u m e n t a t i o n ，w h i c hw a s b a s e do nt h et h i c k n e s si n c r e a s eo ft h eb i o c o m p o s i t el a y e rc a u s e db yt h ei n t e r a c t i o n i n b e t w e e na n t i g e na n da n t i b o d y a g - a b l i v e rc a n c e ri sar a t a ld i s e a s ei nc h i n a t h ed i a g n o s i so f1 i v e rf i b r o s i s a n e c e s s a r ys t a g ef r o mt h ee a r l i e r - h e p a t i cc a r c i n o m at ol i v e rc i r r h o s i s ，i si m p o r t a n tf o r t h ec l i n i c a l a n a l y s i s h e r e ，h y a l u r o n a n ( h a ) a n dl a m i n i n ( l n ) a n t i g e n s ，t w o i m p o r t a n tm a r k e r so fl i v e rf i b r o s i s ，a n dh y a l u r o n a n - b i n d i n gp r o t e i n s ( h a b p s ) ，a n i m p o r t a n ts t r u c t u r a lc o m p o n e n t so fe x t r a c e l l u l a rm a t r i c e st oa d j u s tt h ec o n c e n t r a t i o n o fh a w e r ec h o s e na sm o d e la n t i g e n s s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r st e c h n o l o g ya n d s o l g e lm e t h o dw e r et r i e dt oi m m o b i l i z et h ea n t i b o d i e so nt h ee l e c t r o d et of a b r i c a t e t h ec a p a c i t i v ei m m u n o s e n s o r s t h r e e p a r t s a r ei n c l u d e di nt h et h e s i sa sf o l l o w i n g ： 1 t h ei n t r o d u c t i o no ft h ei m m u n o s e n s o r t h i sp a r td e s c r i b e ds o m ei n f o r m a t i o na b o u tt h ei m m u n o s e n s o rf r o ms i xa s p e c t s ： t h e p r i n c i p l e o ft h ei m m u n o s e n s o r s ，t h ef a b r i c a t i o n so ft h ei m m u n o s e n s o r s ，t h e i m m u n o a s s a y s ，t h ec a p a c i t i v ei m m u n o a s s a y , t h em e a s u r e m e n t so ft h ei m m u n o s e n s o r c a p a c i t a n c e a n dt h ec o n c l u s i o no f t h i st h e s i s 2 c a p a c i t i v ei m m u n o s e n s o r sf a b r i c a t e dw i t hs e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r t e c h n o l o g y ( s a m s ) i nt h ee x p e r i m e n t s ，w ef a b r i c a t e dt h e c a p a c i t i v ei m m u n o s e n s o ro nt h eg o l d e l e c t r o d ew i t hs e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e rt e c h n o l o g y e d c n h sw a si n t r o d u c e dt o c o v a l e n t l yb o n dt h ea n t i b o d i e sw i t hc a r b o x y lg r o u po ft h es a m s w h e nap o t e n t i a l i i i 复冀大学硕出学位论文鸯灵敏度电容型免癜德藏器婚竹趟 s t e pw a sa p p l i e do nt h ei m m u n o s e n s o nt h ec u r r e n td e c r e a s e de x p o n e n t i a l l y , w h i c h i n d i c a t e dt h a tt h ee l e c t r o d es y s t e mw a ss i m i l a rt ot h es u p p o s e dr cm o d ea n dt h u st h e q u i c k e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o dc o u l db eu s e dt om e a s u r et h ei m m u n o s e n s o r c a p a c i t a n c ei n m i c r o s e c o n d s 。i nt h er a n g eo f5 - 5 0 0 n 晷m l ，t h ef o r m e dc a p a c i t i v e i m m u n o s e n s o rs h o w e dag o o dl i n e a rr e s p o n s et ot h es p e c i f i c a n t i g e n n oo b v i o u s r e s p o n s e t ot h e u n s p e c i f i c i n t e r a c t i o nw a s o b s e r v e d ，w h i c hi m p l i e dt h a t t h e i m m u n o s e n s o rh a da h i g hs e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t y i n c r e a s i n gt h ec h a i nl e n g t ho ft h e t h i o l s a m s ，t h es e n s i t i v i t yo ft h ei m m u n o s e n s o rw a sp o o r e r t h i sp r o v e dt h a ta t h i c k e rs a m s l a y e rw o u l dd e c r e a s et h et h i c k n e s sc h a n g ec a u s e db yt h ei n t e r a c t i o no f a g a b 。 t oi m m o b i i i z et h ea n t i b o d yo ns a m sw i t ht h ea m i n eg r o u p ，a n o t h e r r e a g e n t ， g l u t a r a l d e h y d e ( g a ) ，w a su s e dt or e a c tw i t ht h ea n t i b o d ya n dt h ea m i n eg r o u p t h e f o r m e di m m u n o s e n s o rc o u l dd e t e c tt h ea n t i g e ni n1 0 - 2 0 0 n g m lw i t h t h es e n s i t i v i t yo f 10 n g m l t h es e n s i t i v i t yw a ss t i l lp o o r e rb e c a u s et h ei n t r o d u c t i o no fg a w o u l da l s o i n c r e a s et h et h i c k n e s so ft h eb i o c o m p o s i t el a y e ra n dt h u sd e c r e a s et h ec o r r e s p o n d i n g c a p a c i t a n c ec h a n g e + t h ef o r m e dt w ok i n d so ft h ei m m u n o s e n s o rs h e w e dag o o d s t a b i l i t yi naw i d ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f t h ee l e c t r o l y t e h o w e v e lw h e nt h ev a l u eo f p h o f t h es o l u t i o nw a sl e s st h a n4 ，t h ei n s u l t i n g l a y e rw a sd e s t r o y e da n dl i t t l ep i n h o l e s c o u l db e o b s e r v e d ，w h i c hm a d et h er e g e n e r a t i o no f t h ei m m u n o s e n s o r i m p o s s i b l e b e c a u s et h eg o l de l e c t r o d eu s e di nt h ee x p e r i m e n t sh a dar o u g hs u r f a c e 。w h i c h c a u s e dt h e i n s u l a t i n gl a y e rt o s h o wan o n - c a p a c i t y t o e x a c t l yc h a r a c t e r i z e t h e n o n c a p a c i t y , t h ec a p a c i t a n c e s h o u l db e r e p l a c e db y c p e t h e i m p e d a n c e s p e c t r o s c o p yo ft h ei m m u n o s e n s o rp r o v e dt h ec i r c u i ts h o u l db er 承q ) m o d ea n d t h u st h ee x i s t e n c eo fc p e w h e nt h er e s i s t a n c e o f 也e l a y e r i n e r e a s e d t h e n o n - c a p a c i t yo f t h el a y e rd e c r e a s e d + e x p o s e dt ot h ea n t i g e n ，t h es e n s i t i v i t yo ft h e i m m u n o s e n s o rc o u l db ei n c r e a s e dt o5 0 p g m l b y t h ee x a c tc h a r a c t e r i z a t i o n 3 - t h ef a b r i c a t i o no fu l t r a w t h i n a 1 2 0 ss o l g e l d e r i v e d c a p a c i t i v e i m m u n o s e n s o r t os i m p l i f yt h ef a b r i c a t i o np r o c e s sa n d k e e pt h ei n t e g r i t ya n dh o m o g e n e i t yo f t h e p r o t e i n ，a nu l t r a - t h i na t 2 0 3g e l ( 2 0 * 4 0 r i m ) w a su s e dt oe n c a p s u l a t et h ea n t i b o d y t of o r mac a p a c i t i v ei m m u n o s e n s o r t h eu l t r a - t h i nf i l mm a d et h et h i c k n e s sc h a n g e 复旦大学硕士学位论文高灵敏度电容型免疫传感器的研制 c a u s e db yt h ei n t e r a c t i o ni n b e t w e e na g a bo b v i o u sa n dt h u st h ep o t e n t i o s t a t i cs t e p c o u l db ea p p l i e dt om e a s u r et h ec a p a c i t a n c ec h a n g e 。c o u p l e dw i t ham u l t i c h a n n e l s a m p l i n gs y s t e m ，am u l t i - c h a n n e lc a p a c i t i v em e a s u r e m e n ts y s t e mc o u l db er e a l i z e d e a s i l y t h ef o r m e di m m u n o a r r a ys h o w e dag o o dl i n e a rr e s p o n s et oi g ga n t i g e nw i t h t h e s e n s i t i v i t yo fin g m l ，w h i c hw a sm o r es e n s i t i v et h a nt h a tb a s e do ns i 0 2g e l ( 5 n g m l ) m e a n w h i l e ，t h ei m m u n o a s s a ys h o w e dah i g hs e l e c t i v i t y , w h i c hc o u l d d e t e c tt h ec o r r e s p o n d i n ga n t i g e n s ( h aa n dl n ) i nam i x e ds o l u t i o nw i t ht h ed e t e c t i o n r a n g e 1 1 0 0 n g m l ，0 5 10 0 n g m l t h ed e r i v a t i o nc a u s e db yt h eu n s p e c i f i c i n t e r a c t i o nw a sl e s st h a n15 ，p r o v i n gt h a tt h es u c c e s so ft h ed e t e c t i o ni nt h em i x e d s o l u t i o nc o u l dm a k et h ef o r m e di m m u n o a r r a yb ep r o m i s i n gi nt h ef u t u r ec l i n i c a l a p p l i c a t i o n k e yw o r d s ：c a p a c i t i v ei m m u n o s e n s o r s ，l i v e rf i b r o s i s m a r k e r s ，s e l f - a s s e m b l e d m o n o l a y e r s ( s a m s ) ，s o l g e l v 复旦土学硕士学饿论文 高灵瓤度电容坦毛疫传感器的竹瑚 第一章免疫俦感器概述 免疫传感器是利用抗原与蕊俸之阍毒在糖异性点於结鞠礁特瞧瓣钢缮鼹窑 型生物传感器川。该传感器具有高度的特异选择性和檄低的检测限，可广泛应用 i f - i $ 廉诊龋、药物筛选、环境监控及食品分橱等诸多领域扛制，已成为霹藏秘关 领域研究的热点。 第一节免疫传感器原理 人和脊椎动物体内广泛存在具有免疫识剁功能的纽织结构，即免疫系统，包 括淋巴组织、免疫活性细胞和免疫活性介质。而抗原遗常是指可侵入动物纽织的 一种外援性物质。谣神分子稿往具有较低的分子量，为t o k d a 左右，在自然界 中表现为蛋白质或脂多糖，存在于病每、细菌和微细菌的表面或血液及组织液申。 有免液臻蛋农鳞结桶均为一y 嫠亚基缝璃! ( 图1 小) 。两个相同的轻多肽链和相同的 ：一 重多簸链分嬲逶过二硫踺结合在一起，y 臂的氨基酸末端由于氨基酸序列的变化图1 1 免疫球蛋白分子结构示意图 而产生特殊撼，印为菝嚣抗傣结合点箝1 。 究其实质，抗原抗体反应只楚抗原决定簇和抗体结合部位的结合，且局限于太分 子戆表面特定部拉，葵阉蒡竞共赞键影度，只是虫氢镶、范德攀力，静电髅弼力 和疏水作用等相互作用结合在一起。越是分子结构上的互补性决定了免疫反应具 有超过酶蹿威物砖高度跨暑矬识列髭力，使兄蕊为糕备免疫转感器的基砖潮。 免疫铸感器鼹优劣取决节抗臻与待裂物缝合酶选择槛争素务力，瓣娩蓑蕊翡 敏感性与可逆性的选择是免筑传感器技术的萤要问题q 通常而言，对于平衡反 应，速砖块这可逆蛙鸯高度敏感性又搬互剑约。蛙于笼示踪裁捧系，农争接 反应 中，游离的待测物h ( 一个半抗原) 与抗体( 一价) 反应，生成待测物一抗体复合物 ( h a b ) ： h 4 - a b=hab( 1 1 ) 复卫点学硕士哮谯论文 高灵瓤度电容型毛鳆传感器袖卅爿 亲和常数k 取决于与抗体结合的及游离的半抗原浓度比例 k i g 。蓐一 【h a d i h x 【a b 】 ( 1 2 ， 在反应过程申，当待测物消耗了抗体的结合位点一半时，即 h a b = 【a b ，则 k = y h o s 】式申【h 。羹表示睾饱争状态时游离半抗艨浓度) 。由于 妫。5 】与亲和常 数戍反比，半饱和状态时，k 值越大，半抗原的浓度越低。在实际反应过程中，总的 半抗原浓度( h ；。】) 卵样品中待测物的浓度岛k 值及总的抗体浓度l a b t m 甫下列 关系： h t o d 一【h 】+ 【h a b 】 ( 1 3 ) 在半饱和状态时， h 。s ，l o l 】2l ，+ f a b = 1 k + a b l 。i 2 l ( 1 4j 式中【h o5 i o t 】为丰饱和状态下总的半抗原浓度，即样茹中待测物的浓度。这就意味 着半饱和时待测物的浓度与索和常数k 值成反比，岛a b 浓度成正比。因而优化 分析方法的跫敏度就必须考虑抗侮的高亲和力及低浓度。 第二节免疫抟感器的制备 与其它生物待惑器结筠类似，觅疫抟感器具有点无复合物结构，即感受器、 转换器和电子放大处理器。在感受嚣单元申，抗体与抗原选择性结合产生的信号 敏感跑铸送给感受嚣；由于抗舔与被分析耪秘亲扫槛结合葵有高度的特异谯，因 而即使有其它物质存在，感受器也能检测被分析物。抗体常固定在第二个元件转 换器上或警之邻远，转袭器蒋跨珠的生耨纯学或童耪耱理反应赣化为电信号， 再由电子元件进行放大和数牢化。 免疫传感器制静的关键是如何在电极表面有效地固定具有生物活性的抗体 分子，进函获褥灵敏、稳定惑生物铸感器。爨蠢裁务方法主要褰：物理吸黪法、 金电极自组装法、聚合膜法和溶胶凝胶法。 1 物理吸附法【8 】： 翥襄免痰传感器裁备逡常采残物理唆黔法。鼯将表藩蠢续米氛纯旗f 知 t i 0 2 ) 的金属丝通过溴化氰处理后波八抗体溶液，通过物理吸附，抗体分子将结 合羞氧化物屡表面制鹰免疫铸感器。本实验蜜蘸期利罔诿方法刳蚤盼辑癌甲黯臻 蛋白免疫传感器在0 5 1 2 n g m l 范围内对抗原溶液有良好的响应。该方法的缺 点主要在于结合到电掇表面的抗体分子易于脱附，稳定性差，影响传感器砖稳定 性。 2 i 卫上学硬士学位论文高是收度电容型毛疽传感器畴研制 2 金电极自组装法1 9 0 列： 金电极自组装法( s e l f a s s e m b l e d m o n o l a y e r s ) 是利用金一硫键固定表面带有 特定官能团的巯基化合物，通过共价结合或者静电吸附作用将抗体分子与修饰官 能团产生作用，进而将之固定在电极表面( 图1 2 ) 。采用该方法固定的生物膜有 序、定向、密集，对目标分子具有较高的识别度，可获得高灵敏度的响应，因此 该方法成为目前制备免疫传感器的主要方法。但该技术由于采用共价或静电结合 方法固定抗体，易于改变生物分子结构，影响传感器活性m 1 。 3 导电聚合膜包埋法5 1 ： 导电聚合物利用大键共轭大环结构 形成三维刚性骨架，可用于包埋生物分子 构建免疫传感器。典型的导电聚合物有聚 吡咯( p p y ) 、聚噻吩( p t h ) 和聚苯胺( p a n ) 及其衍生物。由于该方法通常采用共聚聚 合物和抗体分子在电极表面，因此简便易 行，便于实现在线分析；同时可通过电聚 g o l d5 u b m ” 合条件的改变，人工设计聚合膜的结构及 图1 2 金电极自组装抗体示意图 厚度，提高检测灵敏度。该方法缺点在于 聚合膜多为无序结构，在包埋过程中易于掩盖抗体抗原结合点位，影响传感器对 目标分子的识别。 近期v l a d i m rm m i r s k y 小纠怕1 在金电极自组装技术的基础上，利用分子印 迹技术将抗体与导电聚合物固定在电极上，得到具有有序绝缘结构的纳米级聚 合物薄膜，克服了直接使用导电聚合物包埋生物分子而产生的结构无序缺点。 4 溶胶凝胶法【”1 ： 溶胶凝胶法包埋生物分子用于构建生物传感器是近几年研究的热点。该体系 包埋生物分子条件温和，使用范围广泛；制得的材料具有良好的热、化学及光诱 导稳定性，可使包埋在其中的生物分子免受外界条件变化影响，易于保持生物分 子活性、结构、功能，同时纳米材料孔径大小可调，可通过人工设计凝胶结构提 高生物化学反应的选择性【俅1 钟。1 9 9 7 年a l i s ab r o n s h t e i n 小组及1 9 9 8 年j o e s p h w a n g 小组利用s i 0 2 溶胶凝胶体系包埋抗体分子，分别采用光学法、电流法检 测目标抗原，成功制备溶胶凝胶型免疫传感器【2 0 1 。目前选用的溶胶凝胶体系 多为金属氧化物，如s i 0 2 ，a 1 2 0 3 ，t i 0 2 等。 复旦上学硕士学位论文 高是收度电容世乞矗传鼠器的砰期 法 第三节免疫分析方法 根据检测目标分子是否需要标记，免疫分析方法主要分为标记法和无标记 1 标记法：在检测过程中，通过标记目标抗原分子监控抗原抗体结合反应。 1 1 放射免疫分析法 2 2 】： 在测定过程中，对目标抗原分子标记放射性物质，如1 2 5 i ，1 3 1 i ，3 h 和”s 。当 抗原结合到免疫传感器表面后，用第二抗体或聚乙二醇沉淀分离抗原抗体结合 物，通过测定其放射活性用于定量抗原。为提高灵敏度，可采用竞争法对抗原或 抗体进行定量。但该方法在测定过程中使用不稳定的放射性物质，需要特殊设备， 安全性差；同时废物处理较为麻烦。因此临床上已逐渐为酶联免疫分析法所取代。 1 2 ，酶联免疫分析法【2 2 】： 一类为均相法，如酶放大免疫分析法( e n z y m em u l t i p l i e di m m u n o a s s a y t e c h n i q u e ，e m i t ) 。其检测原理是将小分子抗原连接在酶分子的活性位点附近， 抗原和抗体结合将封闭酶催化位点，使之失去活性。如果被测溶液中没有相应抗 体，则酶催化底物形成产物，通过检测溶液中底物的量监控抗原抗体反应。同一 标记物也可以以竞争方式测定抗原舍量。该方法优点在于无需分离结合和游离的 抗原或抗体即可测定被测分子的含量；另一类为固相法，即将抗原或抗体吸附在 固相表面，抗原抗体反应后，分离固相和液相除去游离的抗原或抗体，而结合的 抗原或抗体上被标记的酶仍保持活性，催化底物产生有色产物加以检测，即酶联 免疫吸附试验( e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y , e l i s a ) 。该方法稳定性高， 目前在医学上被广泛使用。但其缺点在于灵敏度差，测定过程长迭数小时，操 作复杂。 1 3 电流免疫分析法【2 3 1 ： 麒辣根过氧化物酶( h r p ) 和碱性磷酸酶( a l p ) 标记抗体，在酶底物存在的 情况下，溶液中的酶可催化底物产生催化电流。当溶液中存在相对应抗原时，其 特异性结合将增大电极的绝缘性，催化电流降低，降低的程度与底物上的抗原 浓度相关。该方法较酶联免疫分析法灵敏度高，但检测时间仍然较长。近期提出 一种超灵敏电化学酶联免疫分析方法，称为毛细管电化学酶联免疫分析方法【2 4 】。 对于毛细管而言，其中心与表面的距离较短，免疫反应在其中进行，可大大的缩 4 复卫土学硕士学位论文 高走置度电容型毛疽传威器的研期 短反应孵化时间：同时该体系对催化产物的稀释效应小，缩短酶催化的放大时间。 综合结果可使分析时间从原来的7 h 的测定减小到3 0 m i n ，对人血清i g g 测定的 检测限迭5 6 1 0 m ，测定线性范围跨4 个数量级。该方法适合于快速临床检测， 尤其在生物样品( 如脑、眼、刺突和新生婴等) 量少的情况下有重要应用。 1 4 光免疫分析法【2 5 j ： 通过对测定的目标免疫分子标记荧光物质，测定结合物的荧光量进行分析的 免疫分析方法。该方法可实现大规模目标物质识别测定，已应用于商用生物芯片 的研制。为提高检测灵敏度，目前人们开始将电化学发光技术用于荧光免疫分析 体系【2 6 】。其原理是：通过电化学反应得到的产物与溶液体系中存在的发光物质 发生反应，提供足够的能量使发光物质的电子由基态跃迁到激发态；该电子在返 回基态时发光，可马上参与下一个电化学发光，通过每毫秒几十万次的循环可大 大的提高检测灵敏度。一般采用的体系为碱性鲁米洛双氧水体系以及三吡啶钌 三苯胺体系。把电化学发光技术和免疫反应相结合而形成的电化学化学发光免疫 分析( e c l i a ) 具有很高的灵敏度和特异选择性，快速方便，可广泛地应用于生 化研究测试，目前已经商品化。 标记免疫分子的免疫分析方法优点在于特异选择性高，但由于测定过程需标 记目标分子，操作较为复杂。 2 无标记法：无需标记目标抗原分子，直接监控抗原抗体反应的免疫分析方法。 2 1 电压免疫分析法刚： 早期无标记免疫分析方法。当抗原抗体结合时，由于生物分子本身所带电荷 不同，将使体系电压发生变化。通过监控电极电压变化了解抗原抗体反应进行程 度。该方法的灵敏度为“g 级，已不能满足目前检测要求。 2 2 表面等离子共振免疫分析【2 8 j ： 其原理基于物理光学现象一表面等离子共振( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ) 。 当入射光以临界角照射到两个不同折射率的透明介质界面将产生全反射，其入射 角的强度在每个角度都应该相同。但当两界面之间镀上一层薄金属层，入射角的 一部分能量将和金属表面的自由电子作用产生共振，从而导致反射光强度在一特 定的角度大大减弱。反射光消失的角度随金属层表面液体相的折射率的变化而改 变。通过在等离子共振装置表面上修饰一层抗体分子，当抗原抗体识别反应后， 等离子共振装置的折射率会发生位移，该位移的大小和位置与固定在金属表面的 差王太学镬士学往静文 毫妻鼍度电客曩毛蠢传藏器稀舛艟 生糖分子媳震量有关。落方法灵敏疫高，可买臻多氯据分号弱在线捡溅。但敷需 仪器昂贵，将限制其实际应用。 2 、3 压电免疫分析 2 9 1 剽弼抗体与槐擐的特异识别磅毙与瑾龟晶体的高灵教霞量确应之鞠粒关系 而产生的免疫分析方法。通常的实验方法是将抗体固定于晶体表面，浸八溶液后 免疫反应发生将使晶傣表面震萋负载增加，晶体振荡频零洚纸，典值与榉品溶液 中的抗原含量有关。该方法的测定原理简单，稳定性高；但灵敏皮不高，同时检 测原理走多基予蔗电晶体的质量效应，故存在一定的局限蛙。由于表面声波有出 体声波更高的振荡基频，固此可在免疫分析上提供更高的检测灵敏度，目前成为 该领域研究的热点。基表面声波剖备的免疫传感器捡测下限有塑改善多个数量 级，迭龟级f 3 讲。 2 4 电容免疫分析法”1 ： 该免疫分析方法是近几年涌现的一神是敏度嵩、操捧颁便易行的电化学免疫 分析手段，也是本论文谨点研究的方法。其具休原理分析将在第驾节进行阐述。 第四节电容免疫分析法 电容免疫分析法的原理在于：当电板插到溶液中，电板一溶液界面的行为近 似为一平行板电容器，袁给定的电势下落双层电容c d 表示： c d = a 0er i d( 1 s ) o 秀真空分电常数，为电穰每 移动电荷隔开的物质介电常数，a 为电极蕊软，d 为移动电谚与电缀 表面最近距离。出抗原始合到电檄 表蠡，藏极表委托侉层蓐度砖麓加 特降低电容值，因而可通过电极电 签值魏爱纯监稳表面结合抗爨或 毽1 3 竞液磅感器袭蕾电容示意爨 抗体的蚤。 对于固定有免疫分予的免疫传感器，电极表萄电容值应为几个电容的串联值 ( 銎l ，3 ) ，它们之阚关系可表示为： 6 量里土学硕士学位论文 走爻置土电容型毛疫传藏器曲竹瑚 1 c t o t= 1 c l 。s+ 1 c 他c+ 1 c g c( 1 6 ) c 。为电极表面嫁接绝缘层电容，c 。为固定在电极表面的抗体膜电容，c g c 为电 极与溶液之问双电层电容。为使抗原抗体结合产生的c 。电容变化能够在总电容 中灵敏的体现，该层生物膜应处于绝缘状态。否则，电解液将通过其表面存在的 针孔，到达电极表面，使得双电层电容c 。值较小，在总电容中占主导地位。抗 原抗体结合后，电极表面绝缘膜厚度所引起的微小电容变化将无法在总电容中反 映出来。同时，为提高电容型免疫传感器对抗原识别的灵敏度，该层生物绝缘膜 应尽可能薄，以放大抗原抗体结合而产生的生物膜厚度的变化。 该法通过电极表面生物膜的厚度改变检测目标抗原分子，灵敏度高；无需氧 化还原电对，可检测生物大分子等非电活性物质；整个检测过程快速简便，无需 标志物，可实时监控，因此该法有望取代目前的酶免法应用于临床测试 第五节电容测量方法 目前测定传感器电容的方法主要有两种：电位阶跃法和交流阻抗法。 1 电位阶跃法叫： 该方法基于电极体系为一简单r c 串联电路( 图1 4 a ) 对此电路施加一个 小电压脉冲( 如5 0 m v ) 后，其放电电流将指数衰减。表达式如下： i ( 0 = u r se x p ( t r sc s )( 1 7 ) i ( t ) 为电极电流响应值，u 为施加到电极表面电压，r s 为电解液电阻，c s 为电极 电容。对响应电流取对数并对时间作图，将得一线性曲线。从该曲线的斜率和截 距可计算电极电容值。该方法的优点在于：可在微秒级的时问内通过电极电流衰 减测定电极电容，便于实现多通道、多目标临床检测；同时拟合过程简便，易于 实用化。 但该方法是基于一固定的简单r c 模型。而在实际体系中，电极表面绝缘膜 存在一定量的电阻，绝非断路，因此体系表现为i v r c ) 电路( 图1 4 b ) 。为使体 系接近理想r c 电路模型，测定过程中体系电解液浓度应尽可能的稀，一般为 1 0 m m 。在此情况下，电极体系绝缘膜电阻值较高，可有效增加r c 常数值，进 而简化模型，得到较为精确的电容值。但该条件的使用将极大的限制电位阶跃方 法的应用。 7 复卫是学硬士学位论文高是置度电蓉型毛瘦传氟器螗研瑚 2 交流阻抗法州： 目前能够较为精确测定电极电容的方法应为交流阻抗法。其原理是通过在电 解池的两电极上施加交变电压讯号( v ) 测定电解池中通过的交变电流( i ) 。当 电压讯号具有正弦波形并且振幅足够小时，该交变电流和交变电压具有完全相同 的振幅和相位角。对于一确定的电解池体系，v 和i 的振幅将存在一定的比例， 因此可通过等效电路图模拟了解电解池的性质。该法在电极平衡状态下进行，对 电极膜影响较小；同时该法可对任何电路体系进行拟合，便于通过谱图拟合研究 电极表面性质。 通常交流阻抗谱图可在含有氧化还原探针( 如f e 2 怕+ ) 或者没有氧化还原探 针( 如磷酸盐缓冲溶液) 溶液中测定【1 62 8 1 。利用氧化还原探针获得的谱图重现性 高，可获得较可靠真实的信号；但由于氧化还原探针在测定过程中将扩散到电极 表面发生法拉第反应，需要在原有电路基础上引入一法拉第阻抗加以拟合，使整 体电极体系复杂；同时通常使用的f e 2 + 3 + 探针易于腐蚀金电极表面，将对组装生 物膜产生一定的影响口。使用磷酸盐缓冲溶液时，由于没有法拉第反应发生， 相对于氧化还原体系而言，拟合情况较为简单；但由于没有氧化还原探针作用， 获得的信号具有一定的误差。 与电位阶跃方法测定电极电容相比，交流阻抗技术可以在任何电路基础上对 实际体系进行拟合，获得的电容信号更为可信。但由于测定需在一较宽的频率范 围下记录谱图，时间通常需要数十分钟，远长于电位阶跃法；同时拟合过程复杂， 不利于实际临床检测中广泛推广。 第六节本论文的意义 构建高灵敏度免疫传感器用于疾病标志物的快速在线分析对于临床检测具 有较大的意义。我国是肝病多发地区，而肝纤维化作为肝病变重要阶段，是诸多 慢性肝炎向肝硬化发展的必经阶段，是慢性肝炎的共同病理特征。灵敏的探测血 清中肝纤维化标志物对于肝病早期诊断具有重要价值。目前临床上主要选用透明 质酸( h y a l u r o n a n ，h a ) 和层粘连蛋白抗原( l a m i n i n e ，l n ) 作为肝纤维化标 志物， 通过联合测定这两种抗原分子衡量患者的肝纤维化程度【3 5 1 ；同时血清中 透明质酸结合蛋( h y a l u r o n a nb i n d i n gp r o t e i n ，h a b p ) 作为生物细胞间质中一类 重要的功能蛋白质，参与调节细胞的增值和转移，作为受体调控体内透明质酸， 其含量的测定对于肝纤维化的测定也具有一定的指导意义陋37 1 。目前临床检测 差卫土学埙士毒位论文 鸯