静电纺丝纳米纤维膜固定化酶及去除水体污染的性能研究-生物物理学硕士论文

分类号分类号 密密 级级 U D C 编编 号号 硕士学位论文硕士学位论文 静电纺丝纳米纤维膜固定化酶及 去除水体污染的性能研究 丁然 （1217001） 指导教师姓名 潘 超（副教授） 专 业 名 称 生物物理学 论文答辩日期 2015 年 5 月 28 日 学位授予日期 年 月 Thesis For The Degree Of Master Preparation and Performation of Immobilization of Horseradish Peroxidase on Electrospun Nano-fibers for Water Pollution Treatment Supervisor: Prof. Pan Chao Master Candidate:Ding Ran School of Science, Dalian Ocean University Da lian, Liao ning Province, PR. China JUNE 2015 摘要 I 摘 要 水维持着地球上一切生物的生存,水也是人类发展的必要条件。伴随当今迅猛发展的 经济, 不断增长的人口,水资源遭受的污染越来越严重,使得水资源的供需更为紧迫。污染 中尤以含酚废水最为常见,它危害大且污染范围广，酚类是公认的可致癌物，残留在水体 中的高浓度的酚类物质对人类、动物和植物有着直接的危害。因此，绿色、高效处理含酚 废水技术已成为各国政府和科学家亟需解决的难题。相比于其他处理技术，生物酶作为一 种高效催化剂, 可以直接作用于污染物质的化学链, 将其降解，具有条件温和、高效、成 本低和无毒副产物等优点, 逐渐成为水体污染处理应用与研究的热点。 本文采用静电纺丝技术制备多孔聚苯乙烯纳米纤维膜，并作为载体固定辣根过氧化物 酶（HRP） ，用于处理酚类废水。重点研究了静电纺丝参数对纤维形貌的影响；固定化 HRP 酶条件对酶活性的影响； 以及固定化 HRP 处理含酚废水的性能。 本项目的研究对研制新型 酶固定化载体材料和创新污水处理技术具有重要的意义。本论文主要做了以下几个方面的 研究工作： （1）研究了静电纺丝技术制备聚苯乙烯纳米纤维膜及其最佳纺丝工艺。 为了获得出丝效果最好，纤维形貌最佳的电纺聚苯乙烯纳米纤维膜，本论文对静电纺 丝的制备条件进行研究。通过对电纺条件、溶质浓度和溶剂种类及配比等影响纤维形貌的 参数进行优化，获得了最佳纤维膜的电纺条件：聚苯乙烯浓度为 15%（wt） ，溶剂（N，N 二甲基甲酰胺(DMF)：四氢呋喃（THF） ）配比为 50:50（体积比） ，电压 16 kV,接收距 离为 15 cm。 （2）研究了电纺聚苯乙烯纳米纤维固定化 HRP 酶及其最佳固定化参数。 采用表面偶联吸附方法在改性后的聚苯乙烯纳米纤维表面固定辣根过氧化物酶 （HRP） 。研究了固定化时间、酶溶液浓度和 PH 参数对固定化 HRP 酶活的影响，结果表 明最佳固定化 HRP 酶的条件为：固定时间为 240 min、PH 7.0 、酶浓度为 200 U/L 。更进 一步的研究表明，经过固定化的 HRP 酶相比于自由酶，放置稳定性和 PH 稳定性均得到显 著提高。 （3）研究了固定化 HRP 酶处理苯酚的性能及条件优化。 论文对比研究了聚苯乙烯纳米纤维膜的纯物理吸附、自由酶以及聚苯乙烯纳米纤维膜 固定化酶对苯酚的处理效果。结果表明固定化酶对苯酚的处理效果显著高于膜的物理吸附 和自由酶的催化，更进一步的对固定化酶处理苯酚的最适条件进行了考察，在固定化酶用 量为 0.25 mg/g，苯酚浓度为 75mg/L,过氧化氢和苯酚摩尔比为 1:1 时的苯酚去除率最高。 关键词：静电纺丝；辣根过氧化物酶；固定化酶；苯酚；性能 Abstract II Abstract Water keeps all the animals on the earth, and it is the necessary condition of the development of human. With the rapid development of economy, the increasing population, water resources suffered more and more serious pollution .It makes the water resources supply and demand more urgent. Phenol containing wastewater is most common, it is of great harm and pollution range. Phenol is a possible carcinogen recognized residue, high concentrations of phenols in water to human, animal and plant has a direct harm. Therefore, green, efficient phenol containing wastewater treatment technology has become a difficult problem that governments of various countries and scientists need to solve. Compared with other processing technology, biological enzyme as an efficient catalyst, can directly effect of chemical chain of organic pollution.It has some advantages, such as mild condition, high efficiency, low cost and no toxic side products,etc.It has gradually become a focus of water pollution processing of application and research. In this paper, immobilization on the porous polystyrene nano-fibrous membrane of horseradish peroxidase (HRP) were prepared by electrospinning method, and for the phenolic wastewater treatment focuses on the electrospinning parameters on the fiber morphology, effect of immobilized enzyme conditions on HRP enzyme activity，and the properties of immobilized HRP for treatment of wastewater containing phenol. The research of this project has important significance to the development of new enzyme immobilization carrier materials and innovative wastewater treatment technology. Correlative researches are listed as follow: (1) Research on the electrospinning and its the best spinning process for preparation of polystyrene nano-fiber membrane. In order to obtain the best effect of electrospun jet, and the best polystyrene nano- fibrous morphology the influence factor were discussed through optimizing the electrospinning conditions, such as solvent polarity and ratio, environment humidity and concentration of polymer and so on. The optimum parameters of electrospun fiber membrane as follows: polystyrene concentration was 15% (wt), solvent (DMF:THF) ratio was 50:50, voltage was 16 kV, the receiving distance was 15 cm. (2) Studied on the electrospun polystyrene nano-fiber HRP immobilized enzyme and optimal immobilization parameters. Coupling with surface adsorption method, immobilized enzyme on the surface of polystyrene nano-fiber after the change traits. Studied on the effect of immobilization time, enzyme concentration and PH parameters of HRP immobilized enzyme activity. The results Abstract III showed that the optimal HRP immobilized enzyme conditions are as follows: fixed time was 4 h, PH 7.0, enzyme concentration was 200 U/L. Further studies show that, HRP enzyme immobilized compared to the free enzyme, placing stability, thermal stability and PH stability were greatly improved. (3) Studies on the performance and optimization of HRP enzyme immobilized and treatment performance of phenol. The treatment effect on phenol adsorption, the pure physical contrastive study of polystyrene nano-fiber membrane free enzyme and polystyrene nano-fiber membrane immobilized enzyme under three conditions. The results showed that the catalytic effect on the treatment of phenol was significantly higher than that of the immobilized enzyme membrane physical adsorption and free enzyme. The optimum conditions for further investigation on the treatment of phenol by immobilized enzyme, phenol removal rate is the highest when the immobilized enzyme dosage was 0.25 mg/g, the phenol concentration of 75 mg/L, molar ratio of hydrogen peroxide and phenol was 1:1. Keywords: electrospinning; horseradish peroxidase; immobilized enzyme; phenol; performance 目录 目 录 摘 要 .I Abstract .II 目 录 . IV 第一章 前言 .1 1.1 固定化酶的研究进展 .1 1.1.1 固定化酶的方法 .1 1.2 固定化酶的应用 .2 1.3 辣根过氧化物酶（HRP） .3 1.3.1 辣根过氧化物酶 .3 1.3.2 辣根过氧化物酶的固定化 .4 1.3.3 辣根过氧化物酶（HRP）在水处理方面的应用 .4 1.4 静电纺丝技术 .5 1.4.1 静电纺丝的原理 .5 1.4.2 影响静电纺丝的因素 .6 1.4.3 静电纺丝的研究进展 .6 1.5 研究目的、内容及意义 .6 1.5.1 论文研究目的 .6 1.5.2 论文研究内容 .7 1.5.3 论文研究意义 .7 1.6 论文创新点 .7 第二章 静电纺丝制备聚苯乙烯纳米纤维膜 .9 2.1 实验试剂和仪器 .9 2.1.1 实验试剂 .9 2.1.2 实验仪器 .9 2.2 实验步骤 . 10 2.2.1 静电纺丝装置 . 10 2.2.2 聚苯乙烯溶液的配置 . 10 2.2.3 聚苯乙烯纳米纤维的制备 . 11 2.3 纤维性能表征 . 11 2.3.1 纤维形貌表征 . 11 2.3.2 表面润湿性能测试 . 11 2.4 实验结果与讨论 . 11 2.4.1 溶液参数对电纺纤维形貌的影响 . 11 2.4.2 溶液参数对 PS 纳米纤维表面润湿性的影响 . 13 2.4.3 PS 纳米纤维膜改性前后的表面润湿性能 . 14 2.5 本章小结 . 15 第三章 聚苯乙烯纳米纤维膜固定化酶及活性研究 . 16 3.1 实验试剂和仪器 . 16 3.1.1 实验试剂 . 16 3.1.2 实验仪器 . 16 3.2 实验部分 .17 3.2.1 实验流程 .17 目录 V 3.3 实验方法 .17 3.3.1 蛋白质含量的测定 .17 3.3.2 酶活性的评定方法 . 18 3.3.3 固定化 HRP 和自由 HRP 的 PH 稳定性 . 19 3.3.4 固定化 HRP 的重复利用率 . 19 3.4 结果与讨论 . 19 3.4.1 FT-IR 表征 . 19 3.4.2 纤维形貌表征 .20 3.4.3 固定化参数对 HRP 活性的影响 .20 3.4.4 固定化 HRP 的重复利用率 . 24 3.4.5 固定化 HRP 与自由 HRP 对 PH 的稳定性 . 24 3.5 本章小结 .25 第四章 固定化酶处理水体酚类污染物性能的研究 .26 4.1 实验试剂与仪器 .26 4.1.1 实验材料 .26 4.1.2 实验仪器 .26 4.2 实验部分 .26 4.2.1 固定化酶催化氧化降解苯酚实验 .26 4.2.2 苯酚含量与苯酚去除率的测定 . 27 4.2.3 固定化酶降解苯酚的影响因素 . 27 4.3 结果与讨论 . 28 4.3.1 PS 纳米纤维膜对苯酚吸附性能的研究 . 28 4.3.2 固定化酶对苯酚降解性能的研究 . 32 4.4 苯酚去除率对比实验 . 36 4.5 结果与讨论 . 37 4.6 本章小结 . 37 第五章 结论与建议 . 39 5.1 结论 . 39 5.2 建议 . 39 攻读学位期间发表的论文目录 . 44 独创性说明 . 45 学位论文版权使用授权书 . 46 致谢 . 47 第一章前言 1 第一章 前言 酶是指本身具有高效催化功能的一类蛋白质，作为一种具有高催化效率和高专一性能 的催化剂，酶通常在较温和的条件如常温、常压下就可以使某些或某一生化反应催化，反 应前后其数量和性质都不发生改变。在很早以前，人类就已经对酶进行应用。如今随着高 科技的快速发展，酶逐渐在工业生产、医疗、分析检测等多个领域崭露头角，使其应用范 围更加广泛。酶本身也存在着缺点，例如酶的热稳定性低，对环境条件较为苛刻，给酶的 使用和回收利用都造成了影响。然而，酶的固定化技术不仅使酶得以克服以上的缺点，还 使酶的成本降低，提高了酶的重复利用，使酶的应用投入到工业化得以实现，为酶的应用 开拓广阔的前景。固定化酶早在上世纪八十年代就已成为得到广泛关注的新领域1-3。 1.1 固定化酶的研究进展 酶的固定化最早于 1916 年由 Nelosn 和 Griffin 4两位学者发现，之后研究学者开始 展开对固定化酶研究的工作。尤其是在 1969 年，日本学者千烟一郎等5将固定化氨基酰 化酶酶柱应用在拆分合成的 D、L-氨基酸上，通过分离得到了 L-氨基酸，这一过程，不仅 首次实现将固定化酶应用在工业上，还为固定化酶在工业化上的应用开拓了新篇章。固定 化酶在试剂应用和理论研究上存在巨大的潜力。二十世纪的六十年代初期，固定化酶技术 得到了快速发展6。 酶的固定化技术定义是通过物理或化学的方法将自由酶固定在载体上， 在一定条件下保持酶的活性，使其保持重复使用的一种技术。酶的固定化方式、固定化酶 的载体对酶活的影响最为重要，下面将分别论述。 1.1.1 固定化酶的方法 根据固定化的原理可以将酶的固定化方法分为物理方法和化学方法7：物理方法包括 包埋法和吸附法等，其中化学方法则指通过相关化学键将酶分子和载体连接，或是在载体 上制备出固定化酶。从固定化方式可将酶的固定化方法分为吸附法、包埋法、交联法和共 价键偶联法8,9，下面进行简单介绍。 1.1.1.1 吸附法 吸附法是将酶吸附在不溶性载体上的方法。它分为物理吸附和离子吸附。物理吸附是 借助酶分子中的疏水基团、氨基等功能基团，通过氢键、静电作用和范德华力把酶吸附到 载体上从而达到固定化。物理吸附可以很好的保持酶活及高级结构，对酶活影响较小，但 也存在因酶和载体间的结合力弱，易导致酶脱落的缺点。离子吸附（离子结合）是利用酶 分子含有的离子性基团和不溶性载体带有的离子交换基结合而达到固定化的效果。离子吸 附也存在物理吸附的不足。 1.1.1.2 包埋法 包埋法是使用多孔材料将酶进行包埋以达到固定化效果的方法。包埋法包括网格型包 埋和微囊型包埋。由于酶的动力学会被载体对于底物及产物的扩散阻力改变，固定化酶的 静电纺丝纳米纤维膜固定化酶及去除水体污染的性能研究 2 酶活会降低10。因此，包埋法更适用于底物和产物为小分子的酶。 1.1.1.3 交联法 交联法是一种依靠多功能或双功能试剂，使酶分子间发生交联的固定方法。交联法不 需要使用载体。由于酶蛋白含有的功能基团参与反应，导致酶活损失大，但通过交联法得 到的固定化酶有结合稳固，使用时间长的优点。 1.1.1.4 共价键法 共价键法是一种将酶分子和载体上存在的有机基团，通过共价键的作用产生键合反应 而使酶固定的方法。通过这种方法得到的固定化酶和载体结合较牢固，酶分子不会轻易从 载体上脱落，固定化酶的稳定性得以提高。但存在操作较复杂，所需的反应条件较苛刻， 酶分子容易失活的不足，导致获得的固定化酶的酶活较低。 1.1.2 固定化酶载体 固定化酶载体在固定化技术中是极为重要的， 所以， 载体材料的制备和选择十分关键。 良好的载体应符合以下特征： (1)若除了物理吸附存在酶和载体之间，还有可生成的稳定的化学键，则可以防止酶从 载体上脱落。 (2)酶固定化的载体应不影响酶的活性及性质。 (3)固定酶量大，有较高的酸碱稳定性。 (4)材料低廉易得：酶固定化发展中使用的固定化材料分为以下几类：1）无机材料： 常见的有硅藻土、活性碳、孔型吸附剂及硅胶11-15等，无机材料载体具有高机械强度、低 成本和可重复使用的优点。2）有机材料：包括天然、合成高分子材料，前者常见的有明 胶等，后者常见的有聚丙烯睛膜、海藻酸钙凝胶和聚丙烯酰胺凝胶16-18等。3）复合材料： 通过物理、化学方式将无机材料与高分子的有机材料组成的一类载体材料。4）新型载体 材料：利用物理新方法（磁、光、辐射等）制备的载体材料。包括磁性材料，光交联材料， 超声材料。 经过长时期对酶固定化技术的研究与发展，使酶固定化技术成为在生物技术研究领域 中备受关注的一份子。探索研究新的固定化技术及固定化载体，是研究酶固定化的主要目 标。随着对酶的各项机制和理论的学习研究，研究学者们将酶固定化的研究向前推进了一 大步。多个学科如遗传工程、杂交技术的发展及相互渗透，也将会为酶的固定化技术的快 速发展提供源源不断的动力。 1.2 固定化酶的应用 固定化酶在克服自由酶的缺点的同时保持酶本身的特性，被广泛应用在工业生产、医 药医疗19-21、生物工程22,23、食品、化学检测24、能源开发等领域，并且取得了成果。下 面简单介绍一下固定化酶的应用： （1）医药医疗领域：Cellapandian 等25制备得到的固定化脲酶，用来去除血液中的尿 素；Chen 等31制备得到的固定化磷酸酯酶用于减低血浆中胆固醇的含量；还有用在疾病 第一章前言 3 治疗方面的固定的葡聚糖酶26、脂肪酶27。梅建凤等28用固定化青霉素酰化酶来合成头孢 羟氨苄。研究学者还将固定化技术应用在作为药物的酶，使药物可以定位、缓释29；固定 化酶还被应用在药物的检测免疫30,31等方面。 （2）环境保护：Edwards32等用制备得到的固定化多酚氧化酶来处理水体污染，且效 果好于自由酶。 杨雪梅33等用大孔树脂固定化酶处理高蛋白质浓度的废水。 Akku34等利用 固定过化氧化氢酶，通关结合过氧化氢电极，用来检测臭氧。马秀玲35等用固定化过氧化 物酶处理含酚类的废水，当酚类浓度小于 100mg/L 时，酚类去除率高于 90%。张庆庆36 等用制得的固定农药降解酶来降解农药。Zhang37等人制得的固定山葵过氧化物酶，经实 验测定，有较高的重复使用率。 （3）环境检测：Havens38等用硝苯硫磷酯水解酶制备得到的膦酸酯化酶的泡沫酶成 功用于去除和降解有机磷农药的实验中。而 Lejeune39等用泡沫酶降解空气中的毒气。 （4）食品工业：利用固定化葡萄糖异构酶可以催化玉米和淀粉，生产可代替蔗糖的 高果糖浆40； 固定化的乳糖酶可分解牛奶中的乳糖， 改善乳糖不