（食品科学专业论文）腐乳发酵及其抗氧化和ACE抑制活性研究.pdf

中国农业大学博士学位论文 摘要 摘要 腐乳是我国特有的传统发酵大豆食品，其生产方法和食用方式与西方的千酪相似。然而，腐 乳至今仍主要作为一种嗜好性调味料为人们所接受，且生产企业效益不佳。究其原因，一是腐乳 发酵工艺标准化程度较低，生产过程中一部分工序仍需手工操作，导致生产成本提高和产品稳定 性降低，发酵机理的研究不易深入；二是对腐乳的保健功能研究不足，不能有效地提高产品的附 加值：三是腐乳含盐量较高，不易单独食用，不能有效地扩大消费量。在此背景一f ，本论文选用 当前我国腐乳生产所用的优良菌种雅致放射毛霉( a c t i n o m u c o re l e g a n s ) 研究其生长特征和产酶 特征，并对发酵过程中产品的成分变化、大豆异黄酮构型转化、抗氧化活性和a c e 抑制活性进 行研究。主要内容如下： 1 综台考虑雅致放射毛霉( a c t i n o m u c o re l e g a n s ) 菌株在腐乳白坯上的生k 特征雨i 产酶特征，确 定前酵培养条件为2 8 。c ，r h 9 5 2 条件下培菌4 8h 。该条件下，各酶的活力均较高，蛋a 酶、脂肪酶、0 l 淀粉酶和b 葡萄糖苷酶酶活分别为1 0 6 2 、4 2 、2 9 3 和6 8 2u 干基。发酵时 间延长，除脂肪酶外，其它三种酶的活力均有所下降。 2 对腐乳发酵过程中主要成分进行分析，发酵过程促进蛋白质、脂肪和碳水化合物的分解，发 酵后产品中氨基态氮、游离脂肪酸、氨基酸和维生索的变化表明发酵有利于提高产品的营养 品质。 3 首次对腐乳的抗氧化活性进行研究，腐乳试样均表现出抗氧化活性，自制后酵6 0d 腐乳试样 的抗氧化活性与b h a 相当，说明腐乳具有较强的抗氧化能力。降低腐乳中食盐的含量，可以 提高产品的抗氧化活性和活性保持能力。 4 首次对腐乳的血管紧张素转化酶( a n g i o t e n s i n c o n v e r t i n g e n z y m e ，a c e ) 抑制活性进行研究。 腐乳试样具有a c e 抑制活性，其l c 5 0 值在2 1 7 3 9 8m g m l 之间。经肠胃蛋白酶模拟体内 酶解状况，发现腐乳的a c e 抑制活性明显提高，表明腐乳中主要a c e 抑制成分为易于被人 体直接吸收的低分子肽等物质。降低腐乳中食盐的含量，可以提高产品的a c e 抑制活性和活 性保持能力。 5 首次对腐乳发酵过程中大豆异黄酮的构型转化进行研究。腐乳a 坯中主要为糖苷型异黄酮， 其中大部分是d a i d z i n 和g e n i s t i n ，这两种异黄酮的含量分别达到3 4 6 9 9 和3 5 6 6 7u 幢干物质， 占异黄酮总量的9 2 4 。在雅致放射毛霉发酵过程中产生的外源性p - 葡萄糖苷酶作用下，大 豆异黄酮的构型发生转变，糖苷型异黄酮转化为苷元型异黄酮。b 葡萄糖苷酶具有一定的耐 盐性，在腌坯两天达到最高值1 0 2 6 0u g 干物质。低盐腐乳中b 葡萄糖苷酶酶活较高，异黄 酮构型转变更为迅速。 关键词：腐乳，发酵，抗氧化，a c e 抑制，异黄酮 中国农业大学博士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t s u f u ，o n eo ft h em o s tp o p u l a rt r a d i t i o n a lf e r m e n t e ds o y b e a np r o d u c t si nc h i n a ，h a ss o m e s i m i l a r i t i e st oc h e e s ei np r o c e s s i n gm e t h o da n dw a yo f e a t i n g h o w e v e rn o w a d a y si t i ss t i l la c c e p t e da s ak i n do fp o p u l a r i z e df l a v o r i n gb yc h i n e s ep e o p l e ，w h i c hl e a v e ss u f u m a k i n ge n t e r p r i s e si nal o wl e v e l o fe c o n o m i cb e n e f i t st h i sd i s s e r t a t i o na p p l i e sa c t i n o m u c o re l e g a n st of e r m e n t i n gs u f u ，s t u d i e si t s f e r m e n t a t i o np r o p e r t i e s ，p u r e c u l t u r e dt e c h n o l o g y , c o m p o n e n tc h a n g e s ，i s o f l a v o n et r a n s f o r m a t i o na n d h e a l t h yf u n c t i o n sc h a n g e sd u r i n gt h ef e r m e n t a t i o np e r i o d t h em a i nc o n t e n t sa sf o l l o w i n g ： 1 t h ef e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e ，r e l a t i v eh u m i d i t ya n di n c u b a t i o nt i m eo fa c t i n o m u c o re l e g a n s w e r ei n v e s t i g a t e d a c c o r d i n gt ot h eg r o w t hc h a r a c t e r i s t i ca n de n z y m e so ft h ef u n g u s ，i t so p t i m a l e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sf o rp r e p a r i n gs u f uw e r ei n c u b a t i o na t2 8 。c ，9 5 o fr e l a t i v eh u m i d i t yf o r4 8h i nt h ep r e s e n ts t u d y u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s t h es u f up r o d u c e db ya c t i n o m u c o re l e g a n ss h o w e dh i 曲e r a c t i v i t i e so fp r o t e a s e s ，l i p a s e ，u a m y l a s ea n d1 3 - g l u c o s i d a s ea f t e r4 8hf e r m e n t a t i o n ，a t1 0 62 ，4 2 ，2 9 3 a n d6 8 2u gd r i e ds a m p l e ，r e s p e c t i v e l y 2 t h ec h a n g e so ft h em a i nn u t r i u e n tc o m p o n e n t si ns u f ud u r i n gf e r m e n t a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d f e r m e n t a t i o np r o m o t e dt h eh y d r o l y s i so f p r o t e i n ，f a ta n dc a r b o h y d r a t ei ns u f ua n dt h ei n c r e a s i n go f f r e e a m i n on i t r o g e n ，f r e ef a t t ya c i d ，a m i n oa c i da n dv i t a m i n ，w h i c ha r ef a v o r a b l et on u t r i t i o no f s u f u 3 o r i g i n a l l ys t u d i e dt h ef u n c t i o n o fs u f uo i la n t i o x i d a t i v ea c t i v i t ya n dc o n c l u d e st h a ta l l t h e s a m p l e sh a v ea n t i o x i d a t i v ea c t i v i t ya f t e r6 0d a y sf e r m e n t a t i o n ，t h ea n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo f s a m p l e sa r e a l m o s te q u a lt ob h a t od e c r e a s es a l tc o n t e n to f s u f ur e a l l ym a i n t a i n so re v e ni m p r o v e si t sf u n c t i o n so f a n t i o x i d a t i v ea c t i v i t y 4w ef i r s t l ys t u d i e da n g i o t e n s i nc o n v e n i n ge n z y m e ( a c e ) i n h i b i t o r ya c t i v i t ya n dc o n c l u d e st h a t t h ei c s oo fs a m p l e sw e r e21 7 3 9 8m g m l i ti sa l s oi n d i c a t e dt h a tl o ww e i g h tp e p t i d e sp l a ya n i m p o r t a n tr o l et oa c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yw h i c hc a nb ed i r e c t l ya b s o r b e db yo u rb o d y t od e c r e a s es a l t c o n t e n to f s u f ur e a l l ym a i n t a i n so re v e ni m p r o v e si t sf u n c t i o no f a c ei n h i b i t o r ya c t i v i t y 5 o r i g i n a l l ys t u d i e dt h et r a n s f o r mo f i s o f l a v o n e f r o mg l y c o s i d e st oa g l y c o n e sd u r i n gt h e f e r m e n t a t i o nb ya c t i n o m u c o re l e g a n st op r o d u c es u f u p e h t z em a i n l yc o n t a i n si s o f l a v o n eg l u c o s i d e s ，i n w h i c ht h ec o n t e n t so f d a i d z i na n dg e n i s t i na l e3 4 6 9 9a n d3 5 6 6 7u gd r i e ds a m p l er e s p e c t i v e l y d u r i n g t h ef e r m e n t a t i o n ，w i t ht h e a c t i o no f 3 - g l u c o s i d a s ep r o d u c e db ya c t i n o m u c o re l e g a n s ，i s o f l a v o n e g l u c o s i d e st r a n s f o r m s i n t oa g l y c o n e s j - g l u c o s i d a s eh a sc e r t a i ns a l tr e s i s t a n c ea n ds ol o w s a l ts u f u m a k e st h et r a n s f o n l lo fi s o f l a v o n em o r er a p i d l y k e yw o r d s ：s u f u ( f e r m e n t e ds o y b e a nc u r d ) ，f e r m e n t a t i o n ，a n t i o x i d a t i v e a c t i v i t y , a n g i o t e n s i n c o n v e n i n ge n z y m e ( a c e ) i n h i b i t o r ya c t i v i t y ，s o yi s o f l a v o n e 中国积业大学博士学位论文 缩略词 a a a a s a c e a c e i p a n f s b a p b h a b h t d p p h e a a e c s o e d t a e 队 f a h h l 1 c 5 0 1 f a i f g j s r k k s l a a l d l p g r a s r p - h p l c r s a r s e s f a s o d s p t t b h q t i 缩略词 a m i n oa c i d氨基酸 a m i n oa c i ds c o f c氨基酸评分 a n g i o t e n s i nic o n v e r t i n ge n z y m e 血管紧张素转化酶 a c ei n h i b i t o r yp e p t i d e sa c e 抑制活性肽 a n t i n u t r i t i o n a lf a c t o r s抗营养因子 b i o l o g i c a l l ya c t i v ep e p t i d e s 生物活性肽 2 , 6 d i t e r t - b u t y l 4 h y d r o x y a n i s o l e 2 , 6 - 二叔丁基- 4 - 羟基茴香醚( 台成抗氧化剂) 2 , 6 d i t e r l b u l l 4 h y d r o x y t o l u a n e 2 , 6 - 二叔丁基4 羟基甲苯( 合成抗氧化剂) 2 , 2 一d i p h e n y l - 1 - p i c r y l h y d r a z y l 2 , 2 - 二苯基- 1 间三硝基苯基联肼( 自由基发生剂) e s s e n t i a la m i n oa c i d 必须氨基酸 5 0 i n h i b i td p p hc o n c e n t r a t清除5 0 d p p h 所需抗氧化物的摩尔比 e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e s s e n t i a lf a t l ya c i d必须脂肪酸 f a t t ya c i d 脂肪酸 h i p p u r y l - l - h i s t i d y l l - l e u c i n e 马酰尿组胺酰- 亮氨酸 5 0 i n h i b i tc o n c e n t r a t i o n半抑制浓度 i s o f l a v o n ea g l y c o n e 异黄酮营元 i s o f l a v o n eg l u c o s i d e异黄酮糖苷 i n i t i a ls c a v e n g i n gr a t e原始消除率( 抗氧化物对自由基( 如d p p h0 消除反 应的直线斜率为负数时的时问与初始时问之比) k a l l i k r e i n k i n i ns y s t e m 激肽释放酶一激肽系统 l i m i t i n g a m i n oa c i d限制氨基酸 l o wd e n s i t yl i p o p m t e i n低密度脂蛋白 p r o p y lg a l l a t e 没食子酸丙酯 r e n n i n a n g i o t e n s i ns y s t e m 肾素一血管紧张素系统 r e v e r s e d - p h a s eh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 反相高效液相色谱 r a d i c a ls c a v e n g i n ga c t i v i t i e s自由基清除活性 r a d i c a ls c a v e n g i n ge f f i c i e n c y自由基消除系数( 2 i s r 1 0 0 0 e c 5 0 ) s a t u r a t e df a t t ya c i d饱和脂肪酸 s u p e r o x i d ed i m u t a s e 超氧化物歧化酶 s o y b e a np r o t e i ni s o l a t e 大豆分离蛋白 t e r t - b u t y r l b e n z o q u i n o n e 叔r 基氢醌 t r y p s i n i n h i b i t o r 胰蛋白酶抑制因子 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：弓阳知嶙 时间：沙石年占月一日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：张魂嶂 时间：m 年占月弘日 导师签名夸吐晴 帆瑚占年g 月知日 中国农业大学博士学位论文第一章绪论 1 1 研究目的和意义 第一章绪论 1 1 1 开发传统发酵大豆食品的意义 大豆食品种类繁多，按照加工工艺可分为非发酵与发酵大豆食品两大类。非发酵大豆食品包 括豆浆、豆腐、腐竹及其加工而成的各类豆制品；发酵大豆食品包括腐乳、豆豉、豆酱、酱油等。 其中，发酵大豆食品是用整粒大豆或其它非发酵大豆食品作原料，用某种专用微生物发酵或几种 微生物进行发酵，以获得较好的风味、质构和保藏性。发酵大豆食品以其发酵过程中是否添加食 盐可划分为含盐大豆发酵食品和无盐大豆发酵食品两大类。主要的发酵大豆食r 铺如表l - 1 所示。 表1 - 1 主要发酵大豆食品 t a b l e1 - 1s o y b e a nf e r m e n t e df o o d s 备注：东南亚国家包括柬埔寨、印尼、老挝、马来西亚、缅甸、菲律宾、新加坡、泰国和越南。 大豆食品的加工工艺与营养和功能性质关系密切。大豆中含有多种抗营养因子( a n f s ) ，如 胰蛋白酶抑制因子( t r y p s i nf o c t o r s ) 、植物凝集素( l e c t i n s ) 和致敏因子( a l l e r g e n i cf a c t o r s ) 等， 这些a n f s 都以不同方式不同程度地影响人体对营养成分的消化、吸收和利用。发酵大豆食品通 过发酵过程中微生物及其分泌的酶系的作= f j ，发生一系列的生化反应，破坏了大豆中原有的对生 理不利的物质，使大豆中营养素被利用的可能性大大提高。同时，发酵过程可以把不溶性高分子 物质分解成为可溶性低分子化合物，保留大豆异黄酮和低聚糖等顾有功能性物质，还可以产生大 豆中原米没有的营养成分和生物活性物质，使产品具有较高的营养和功能特性( m a n e e p u n y u n c h a l a d ，2 0 0 4 ) 。 相比于未发酵大豆食品，火部分发酵大豆食品的消费局限于各自的产地。然而，功能性质和 功能成分的研究有力地促进了发酵大豆食品的市场全球化。以日本的纳豆和印尼的丹贝为例，它 们是我国豆豉传到国外后，为适应当地气候和文化改造而成的产品，最早也是地域性产品，现在 中国农业大学博士学位论文 第一章绪论 已经逐渐在世界范围内得到认可。 1 9 8 7 年，须见洋行将纳豆及其提取物置于人工制作的纤维平板上，观察到有明显的溶圈，从 而发现纳豆中的纳豆激酶有较强的溶血栓效果( s u m ie ta 1 ，1 9 8 7 ：f u j i t ae ta l ，1 9 9 3 ) 。此后，陆续 有研究发现纳豆还具有多种其它保健功能：抗肿瘤( t a k a h a s h ie ta 1 ，1 9 9 5 ) 、降血压( a k i k oe ta 1 ， 1 9 9 5 ) 、抗菌( h o s o ie ta 1 ，1 9 9 9 ) 利预防骨质疏松( t s u k a m o t oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 等。纳豆中含有多种 生理活性物质，如纳豆激酶、纳豆菌、大豆异黄酮、皂苷素和v k 2 等，使其不仅成为保健食品， 还被作为医药保健原料来治疗心脑血管疾病和预防癌症( 吴胜英，2 0 0 3 ) 。 丹贝富含维生素e 和大豆异黄酮，具有很好的抗氧化功能( m u r a k a m ie ta 1 ，1 9 8 4 ；a s t u t ie ta 1 ， 2 0 0 0 ) 。1 9 9 6 年e s a k i 等从丹贝中提取出未发酵大豆中所不含有的抗氧化物质3 一羟基氨基苯甲酸 ( h a a ) 。丹贝还具有抑制肿瘤生长( k i r i a k i d i se ta 1 ，1 9 9 7 ) 、降胆固醇( k a r y z d ie ta 1 ，1 9 9 6 ) 等 多种保健功能，使其作为功能保健食品受到消费者的欢迎。 发酵大豆食品营养丰富，并且含有多种生理活性物质，符合现代消费者的健康取向，为大豆 产业的发展带来了新的机遇。目前，纳豆年产量达2 0 万吨左右，丹贝年产量5 0 万吨左右，消赞 市场已辐射到美洲、欧洲和非洲。纳豆和丹贝功能性研究和市场国际化的成功，有力地促进了对 发酵大豆食品及其功能性的深入研究。 1 1 2 腐乳是我国传统的发酵大豆食品 腐乳起源于中国，至今已有一千多年的历史。公元5 世纪( 北魏末年) 古书中就有记载“干 豆腐加盐成熟后为腐乳”。公元1 4 世纪( 明代) 我国就大量加工制作腐乳，李日华的蓬栈夜话 中最早详细记载腐乳的制作方法。我国腐乳种类繁多，其生产类型依各地环境、条件、生活习性 不同而定。通常根据腐乳的色泽风味和生产： 艺两方面来分类。按照产品的色泽风味可以分为红 腐乳、白腐乳、青腐乳、酱腐乳和各种花色腐乳，见表1 2 ( 中华人民共和国国内贸易部s b t 1 0 1 7 1 1 9 9 3 ) 。 表1 - 2 腐乳的种类( 按产品色泽风味划分) t a b l ei - 2 a p p a r a t u sf o re x p e r i m e n t 按照生产工艺可分为腌制型和发霉型两大类，发霉型又分为自然发酵和纯种培养两种。依据 豆腐坯培菌的菌种不同，又可分为毛霉型、根霉型和细菌型( 王瑞芝和杜晓湘，1 9 9 8 ) 。目前毛 霉型纯种发酵腐乳最为普遍，其生产工艺如图l - l 所示； 中国农业大学博士学位论文 第一章绪论 丁 压榨4 划块_ + 酽j 酵1圆圆 + - 前期培菌接种 f i g 1 - 1t h e f l o wc h a r to fm o u l d f e r m e n t e ds u f up r o c e s s i n g 中国腐乳在明代时传入朝鲜，其品种主要是辣豆腐乳，称为“蛮辣酱”( 赵玉莲，1 9 9 7 ) 。公 元1 8 世纪( 琉球王朝) ，中国福建省的红腐乳制作技术传到日本，称之为“豆腐糕”( t o f u y o ) 。 御膳本草一书中记载豆腐糕“味香开胃、食之甜美、利治百病”。在琉球王朝时代，“豆腐糕” 被作为病后的滋补品和副食，非常珍贵。其制作方法也作为“祖传秘方”密不外传，仅有少量生 产( y a s u d a ，1 9 8 3 ) 。目前“豆腐糕”在日本也并不普及，主要作为冲绳地区的特产而生产。受 当地气候和饮食习惯等的影响，日本的“豆腐糕”与我国腐乳已有很大的区别，其传统制作工艺 如图1 2 所示： 旧然发酵( 枯草茁) l阳味液( 红曲、黄曲、泡盛酒和盐水) l 固一切块一抹盐一阴千一圃_ + 表面清洗一腌制坷 ( 2 - - 5 天)( 2 3 月) 图i - 2 日本豆腐糕生产工艺 f i g 1 - 2t h ef l o wc h a r to fm o u l d - f e r m e n t e ds u f up r o c e s s i n g 其他国家迄今尚未有当地特色的腐乳出现。目前我国腐乳已经出口美国、英国、意大利、澳 大利皿、新西兰、韩国、日本和新加坡等国家。 1 1 3 研究的目的和意义 腐乳是具有良好风味的传统食品，它既可调味又可佐餐，以独特的工艺、细腻的品质、丰富 的营养及鲜香可口的风味深受广大群众的喜爱。 通过微生物发酵，大豆中的苦腥味、胀气因子、抗营养因子等不足被克服，消化率和生物价 均大大提高，同时产生了多种具有香味的有机酸、醇、酯、氨基酸。由豆腐经微生物发酵成腐乳 后，水溶性蛋白质含量增加，碱溶性蛋白质含量减少，这使得腐乳极易消化，口味鲜美，蛋白质 的消化率达到9 2 9 6 。此外，腐乳中除了含有大量水解蛋白质、游离氨基酸和游离脂肪酸，还 有硫胺素、核黄素、尼克酸、钙和磷等营养成分，不含胆固醇，这些都利于身体健康，是促进人 呷i 皂 一 脱 一 黼 一 雠l 回 一 跳 一圆 一 中国农业大学博士学位论文 第一章绪论 体正常发育或维持正常生理机能所必需的( 李幼筠，1 9 9 7 ：王家槐，2 0 0 2 ) 。 腐乳色、香、味、体的形成都与发酵微生物及其作用机理有着密切的关系。前期培菌时霉菌 生长均匀，使被膜完整，腐乳不易破碎，具有较好的块形。发酵过程中微生物作用产生的有机酸 和酒精形成各种酯类，构成腐乳的特殊香气。腐乳白坯中的蛋白质在微生物所产生的蛋白酶作用 下，降解为分子量较小的蛋白质分子，以及部分胨、寡肽甚至氨基酸等水溶性物质。水解得到的 各种氨基酸具有不同的风味闽值，赋予腐乳特有的鲜味( 王瑞芝和杜晓湘，1 9 9 8 ) 。 腐乳作为一种发酵大豆制品还保留着大豆中天然存在的大豆低聚糖、大豆磷脂、大豆异黄 酮等其它活性成分。在红腐乳的生产中，加入了大量的红曲，红曲本身是一种发酵产物，含有蒙 纳可林( m o n a c o l i n ) 、麦角吲醇( m r g o s t e r 0 1 ) 和m o n a s c i d i na 等多种生理活性物质，具有降血压、 降胆固醇和抑菌等作用( a k i r a ，1 9 7 9 ；k e i s u k ee ta 1 ，1 9 9 2 ；b l a n ce t a l ，1 9 9 5 ) 。有研究表明，腐乳 中存在有明显s o d 样活性的物质( 饶平凡等，1 9 9 6 ) ；腐乳中的大豆蛋白酶解物中不溶性成分具 有很强的与胆酸结合的能力，水溶性成分中含有a c e 抑制肽活性( 倪莉等，1 9 9 7 ) ：腐乳作为食 物蛋白源具有降胆固醇作用( 张蓉真等，1 9 9 8 ) 。这些研究预示着腐乳不仅可以作为一种风味独 特的调味品，而且还可以作为功能性食品加以开发，有必要对腐乳的功能性和功能性成分进行深 入的研究。 因此，以腐乳的营养和生理功能特性为目标，研究腐乳发酵机理和功能性成分，可以促进腐 乳产品加工技术水平的提升，增加对传统腐乳食品的营养、口味和功能性的认识，从而使中华传 统特色美食继续发扬光大，具有很大的理论和实践意义。 1 2 国内外研究现状 1 2 1 腐乳发酵微生物的研究 腐乳作为一种传统的发酵食品，早期一直采用自然接种、自然霉制的方法制作。其生产菌种 来自环境，菌种杂乱，不易控制，产品质量不稳定。1 9 2 9 年，w a i 最早从绍兴腐乳中分离出纯菌 种腐乳毛霉( m u c o r 蹦m ) 。1 9 4 2 年，方心芳从腐乳坯上分离出高大毛霉( m u c o r m u c e d o ) 、总状 毛霉( m u c o r r a c e m o s u s ) 、黄色毛霉( m u c o r f l a v u s ) 及五通桥毛霉( m u c o rw u t u n g k i a o ) 四种毛 霉菌。其后，又有研究者对各地腐乳中微生物进行分离鉴定和筛选，纯化出许多优良的工业化生 产菌株。5 0 年代后期以来，我国腐乳的生产大多采用纯种发酵工艺。常用的腐乳生产用微生物如 表1 - 3 所示( h e s s e l t i n e ，1 9 6 5 ；沈德中，1 9 8 9 ：方蔼祺等，1 9 9 1 ：y a s u d ae ta 1 ，1 9 9 2 ；鲍松林， 1 9 9 4 ；赵玉莲和郑学翔，1 9 9 8 ；y a s u d ae ta 1 ，1 9 9 9 ；宋国安，2 0 0 2 1 张琴，2 0 0 2 ) 。 与根霉和细菌相比，毛霉作为腐乳发酵微生物具有明显的优势( 李幼筠，1 9 9 9 ) ：1 ) 毛霉菌 丝粗壮，质地细密，可在腐乳表面均匀地覆盖一层0 2m m 的皮膜，对腐乳块型的保持具有重要 作用；2 ) 毛霉菌丝洁白，不产生深色孢子，使腐乳毛坯色泽纯净：3 ) 毛霉生长迅速，抗杂菌能 力强；4 ) 毛霉产生的蛋白酶活力较高，酶系丰富，有利于腐乳形成独特的风味。因此，目前大 部分的腐乳生产都采用毛霉进行纯种发酵，对于腐乳菌种的选育也主要集中在毛霉菌。 4 中国农业大学博士学位论文 第一章绪论 表1 - 3 腐乳生产用的微生物 t a b l e1 - 3m i c r o o r g a n i s m su s e di ns u f um a k i n g 根霉的耐高温性优于毛霉，但根霉菌丝稀疏，颜色浅灰，长有黑色孢子囊，且蛋白酶活力、 肽酶活力相比毛霉菌较低。因此，用根霉菌生产的腐乳，其形状、色泽、风味和理化指标均不及 毛霉腐乳。南方的一些厂家选用耐高温根霉菌酿制腐乳但关于腐乳酿造用根霉的相关研究鲜有 报道。少孢根霉r t - 3 通常用来生产丹贝，适宜生陡温度为3 7 4 0 c ，温度达5 0 5 2 。c 时仍能生 长，适宜生长p h 30 4 5 ，而且具有较高的蛋白酶活力。孙兴民等( 1 9 9 7 ) 将其应用于腐乳制作， 并根据少孢根霉特性改进加工1 艺，用1 乳酸酸化白坯，发酵前期高温促使孢子萌发，后期降 温以防止发酵过速产热，得到的产品质地疏松，口感良好。 1 2 2 腐乳发酵机理的研究 1 9 世纪6 0 年代开始台湾中国科学院化学研究所( t h e i n s t i t u t e o f c h e m i s t r y , a c a d e m i a s i n i c a o f t a i w a n ) 的w a i 和美国农业部北部地区研究实验室( n o r t h e mr e g i o n a lr e s e a r c hl a b o r a t o r y , u s d e p a r t m e n to f a 面c u l t u r e ) 的w a n g & h e s s e l t i n e 分别领导其研究小组进行腐乳纯种发酵工艺和机 理的研究。w a n g h e s s e l t i n e ( 1 9 7 0 ) 总结指出，将豆腐坯浸入6 n a c i 和2 5 柠檬酸溶液中1h ， 然后在1 0 0 热空气中处理1 5m i n ，用这种方法来防止腐败细菌的生长而不抑制霉菌的生长以保 证纯种发酵。冷却后的豆腐坯接种纯菌种，于2 0 c 培养3 7 d ，用1 2 n a c i 和1 0 乙醇溶液作 为后酵汤料，发酵成熟4 0 6 0 d 。发现发酵过程大豆蛋白被水解为多肽和氨基酸，脂肪被水解为 脂肪酸，认为后酵汤料中的食盐和乙醇影响腐乳的发酵成熟过程，后酵成熟阶段添加的乙醇与脂 肪酸发生生物化学反应产生腐乳特有的风味成分。 豆腐坯上培养出来的毛霉、根霉或其它外界侵入的微生物所产生的酶类，以及配料中红曲中 的红曲霉、面糕中的米曲霉、酒类中的酵母菌等所分泌的酶类，在腐乳发酵过稃中与微生物协同 作用。c h o u 等( 1 9 8 8 ) 在台湾雅致放射毛霉( a c t i n o m u c o rt o i w a h e s i s ) 制各腐乳毛坯的研究中 中国农业大学博：匕学位论文 第一章绪论 指出，温度、湿度和发酵时间是重要的影响因素，但是菌株的最佳生长条件并不一定是其产酶的 壤佳条件，在实际生产中需要综合考虑确定毛坯的培养条件。鲍松林( 1 9 9 4 ) 对绍兴腐乳毛坯中 蛋白酶进行研究指出，绍兴腐乳生产菌林木毛霉( m u c o rs i t v a t i c u s ) 在豆腐坯上积累的蛋白酶属 胞外酶，采用1 7 5 n a c i 或具有相当离子浓度的介质的溶液方可使该胞外酶从菌丝体表面得到 彻底的释放。发现n a c i 和乙醇对该蛋白酶有较好的保护作用，有利于腐乳的成熟。对普雷恩毛 霉( m u c o rp r a i n i i ) 在腐乳白坯上的产酶特征的研究也表明毛霉蛋白酶属于胞外酶，并且温度和 湿度对毛霉的生长和产酶特征影响显著。李理等( 1 9 9 9 ) 研究毛霉m 2 6 3 - 3 在鼓曲中蛋白酶的提 取方法，证实毛霉蛋白酶确实是以离子键松弛地结合在菌丝表面，一定浓度的n a c l 溶液可以有 效地提取毛霉蛋白酶，并指出最佳提取条件是4 0 ，0 3m o l l n a c i 溶液。余若黔等( 2 0 0 1 ) 用 毛霉g h l 0 1 发酵腐乳，发现豆腐毛坯表面酶系丰富，含有大量的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及糖 化酶，培菌3 6 h 后菌体开始老化酶活有所下降，认为培菌阶段发生的主要化学变化是蛋白质部 分降解成为水溶性蛋白质：后期发酵阶段腐乳中蛋白质的降解过程和氨基氮含量的升高主要集中 在前四周，分子量大于3 1 1 0 3u 的蛋白质都已降解。指出腐乳后酵过程中可溶性蛋白质及氨基 酸含量的变化直观地反映了腐乳的成熟情况。当可溶性蛋白质含量为1 8 2 0 ( 干基) ，氢基酸 态氮大于1 5 时腐乳基本成熟。 y a s u d a 等研究了红曲( m o n a s c u s 菌属制各) 、黄曲( a s p e r g i l l u so r y z a e 制各) 以及混台曲对 腐乳( t o f u y o ) 发酵过程中酶系、化学成分和质构等方面的影响( 1 9 9 3 ；1 9 9 4 ：1 9 9 5 ；1 9 9 6 ) 。研 究结果表明：红曲腐乳发酵过程中( 0 3 月) 蛋白质和脂肪含量逐渐降低，还原糖含量升高；成 熟3 月后，蛋白酶残存活性3 5 o ，蛋白质分解率达到3 6 3 ，腐乳的主要成分是5 5 k d a 的球 蛋白和1 1 1 5k d a 的多肽。黄曲腐乳发酵过程中酶和化学成分变化趋势与红曲腐乳相似，蛋白 质分解程度更高。成熟3 月后，蛋白酶残存活性3 4 3 左右，蛋白质分解率为3 8 8 ，腐乳的主 要成分是3 2k d a 的球蛋白和1 0 1 3k d a 的多肽。采用2 5 红曲和7 5 黄曲混台发酵制备的腐 乳感官评价结果最佳；成熟3 月后蛋白酶残存活性3 6 8 ，蛋白质分解率为3 90 ，腐乳的主要 成分是4 0 3 2k d a 的球蛋白和1 1 1 5k d a 及1 0k d a 以下的多肽。红曲、黄曲和混合曲制备腐 乳的过程中，由于大豆蛋白的分解，腐乳的破断应力和粘弹性系数不断降低，大豆蛋白凝胶的网 状结构由纤维状向微孔状转变。 腐乳工艺包括添加食盐腌制并在后酵汤料中加入料酒，食盐和酒精对腐乳品质的影响受到研 究者的重视。c h o u & h w a n ( 1 9 9 4 ) 利用台湾雅致放射毛霉和雅致放射毛霉来纯种发酵制备腐乳， 在后酵汤料中添加1 5 乙醇进行成熟，与不添加乙醇后酵成熟的腐乳进行比较，发现乙醇的添加 使腐乳产品中的游离脂肪酸增加，抑制蛋白质降解，但是脂肪酸的组成并不受影响。h w a n c h o u ( 1 9 9 9 ) 用台湾雅致放射毛霉发酵制备腐乳，在后酵汤料中添加1 5 乙醇进行成熟，采_ h j 气相色 谱和气质色谱联用测定腐乳中的挥发性化台物，共检出6 1 种挥发性化合物，随着熟化时间的延 睦，挥发性化合物中酯类和醇类都明显增加，且挥发性化合物在种类和数量上都比未加乙醇的样 品要多，说明乙醇参与腐乳中风味成分的形成。h a r t 等( 2 0 0 3 ) 分别添加1 4 ，1 1 和8 的食 盐腌制腐乳，发现1 4 食盐含量的腐乳硬度升高1 0 0 、弹性升高1 8 ，而粘弹性下降3 0 ； 在后酵6 0 天时，含盐量8 腌制的腐乳中游离氨基态氮与总氮比值达到0 4 o 4 5 ，游离氢基酸 与粗蛋白的比值达到o 2 4 一o 2 6 ，高于1 4 v 0 n1 1 含盐量的腐乳。 6 中国农业大学博士学位论文 第一章绪论 1 2 3 腐乳的功能性和功能性成分的研究 腐乳制作最初只是豆腐盐藏的一种手段，人们在有意识地抑制有害微生物的同时却无意识地 利用了有益微生物，从而产生出腐乳这一全新的不同于豆腐的发酵食品。腐乳的营养保健功能在 我国早有记载，清王士雄随息居饮食谱中有“腐干而再造者为腐乳，陈久愈佳，最宜病人” 的文字，其生理功能早已为我们的祖先所利用，有必要进一步深入研究。 l ，2 3 1 大豆异黄酮的研究 a 大豆异黄酮苷元( i f a )b 大豆异黄酮糖苷( i f g ) 图l - 3大豆异黄酮的化学结构 f i g 1 - 3c h e m i c a ls t r u c t u r eo fs o yi s o t l a v o n ei s o m e r 大豆异黄酮是大豆生长过程中产生的次生代谢产物，是大豆和大豆食品中主要的生理活性物 质( c r o u s ee ta 1 ，1 9 9 9 ) 。整粒大豆中异黄酮的含量约为0 3 ，主要以葡萄糖苷和丙二酰葡萄糖 菅的形式存在，其中大豆苛和染料木苷占异黄酮总量的9 0 以上( w a n g m u r p h y , 1 9 9 4 a ) 。目前 已发现的大豆异黄酮共有1 5 种，分别以异黄酮糖苷( i s o f l a v o n eg l u c o s i d e ，i f g ) 和相应的苷元形 式( i s o f l a v o n ea g l y c o n e ，i f a ) 存在，其结构式如图1 - 3 所示( w a n g & m t t r p h y , 1 9 9 4 a , b ) 。 中国农业大学博士学位论文第一章绪论 大豆异黄酮的形式不同，其在体内的消化吸收和生物利用状况也存在差异。在消化过程中， 肠道菌群产生的酶对糖苷型有分解作用，生成相应的苷元形式( x ue t a l ，1 9 9 4 ，1 9 9 5 ) 。m a r o i s z 等 ( 1 9 9 9 ) 用剂量为7 9p _ m o l k g 的d a i ，g e n ，d a i g l u 和g e n g l u 喂食小鼠，比较3 0 分钟后血浆中 相应的代谢物浓度，结果表明苷元型的d a i 和g e n 在胃部和小肠内均能够被吸收，而糖苷型的 d a i g l u 和g e n g l u 仅在小肠末端可以被吸收，认为胃内不能产生分解糖苷型异黄酮的酶或者胃 内的口h 等条件不适于糖苷的分解。a n d l a u e r 等( 2 0 0 0 a ，b ) 证实g e n g l u 在小鼠小肠中1 5 4 被 分解为g e n ，1 4 9 被直接吸收，主要以葡萄糖醛酸苷元( 1 4 6 ) 结合形式进入血液循环系统。 s e t c h e l le ta 1 ( 2 0 0 1 ) 首次对纯大豆异黄酮在人体内的代谢利用进行研究，1 9 位健康妇女分别服 用5 0m g 的d a i g l u ，g e n g l u ，d a i 和g e n 后，血浆中未能检测出完整的糖苷类异黄酮，g e n 和d a i 在血浆中浓度达到峰值的时间分别为5 2 和6 6h ，而其糖苷达到峰值的时闻分别为9 3 和9 0h ， 表明糖苷型异黄酮在