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摘要 化感物质香豆素对苜蓿种子萌发及幼苗初级氮同化的影响 蔡登高( 生态学) ( 中科院成都生物研究所，成都6 1 0 0 4 1 ) 指导教师：潘开文研究员 王进闯助理研究员 摘要 香豆素类物质是苯丙酸内酯( 环酯) 类化合物，绝大部分高等植物通过次 生代谢途径都能合成。研究表明，香豆素类物质是花椒体内最重要的化感物质， 系统研究香豆素类物质的作用机理有助于理解和最终解决花椒连作障碍。本文 通过研究香豆素对几种植物种子特别是苜蓿种子萌发、苜蓿幼苗初级氮同化的 影响，从生理生化角度揭示香豆素的作用方式，为花椒连作障碍的解决和化感 作用机制的深入理解提供依据。主要研究结果如下： 1 研究了香豆素对6 种常见作物种子萌发的影响，并对一组数据采用4 个不同的指标进行评价，对生物测定化感作用中存在的问题进行了讨论。结果 发现1 0 m m 的香豆素对采用的6 种作物的种子萌发均表现出一定的化感作用， 4 个指标的敏感程度依次为s ( 发芽速度) a s ( 累积发芽速度) c r g ( 发芽指数) g t ( 最终发芽率) 。种子萌发实验是化感作用研究中最重要、应用最广泛的生 物测定方法之一，应根据不同的研究目的合理采用指标和实验方法。 2 采用培养皿试纸法进行种子萌发试验，研究了香豆素水溶液在苜蓿种 子萌发过程中对其吸水、电导率及抗氧化保护酶活性的影响。结果表明，影响 苜蓿种子发芽的香豆素浓度阀值为0 3 m m 。香豆素在1 0 m m 的浓度下降低了 苜蓿种子吸水阶段i i 的吸水速度，使其外渗物质增多，电导率增大，并显著抑 制了超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化物酶( p o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 的活性，同 时种子体内丙二醛( m d a ) 的含量显著增大。高浓度香豆素破坏了膜的结构、 影响了抗氧化保护酶的活性是香豆素降低苜蓿发芽率的原因之一，也可能是影 响花椒一苜蓿间作的关键因素之一。 3 不同浓度( 0 、2 5 州、5 0 州、0 1m m 、1 0m m ) 化感活性物质香豆 化感物质香豆素对苜蓿种子萌发及幼苗初级氮同化的影响 素对1 0 日龄苜蓿幼苗初级氮同化的影响的结果表明2 5 “m 5 0g m 的香豆素 加快了苜蓿幼苗对硝态氮的吸收。高浓度的香豆素导致苜蓿根系和叶片内可溶 性蛋白含量降低、鲜重减小、地下鲜重地上鲜重( r s ) 的比值升高，根系中 初级氮同化的关键酶硝酸还原酶( n r ) 、谷氨酸胺合成酶( g s ) 、谷氨酸脱氢 酶( g d h ) 的活性降低，叶片中n r 、g s 的活性减低、叶绿素含量减少，而 g d h 的活性升高。香豆素影响苜蓿幼苗氮代谢和氨同化的关键酶，导致体内 养分的缺失是香豆素抑制苜蓿幼苗生长的机理之一。 关键词：花椒；香豆素；紫花苜蓿；种子萌发；抗氧化酶；氮同化 i i a b s t r a c t e f f e c t so fc o u m a r i no nt h es e e dg e r m i n a t i o na n dp r i m a r y n i t r o g e na s s i m i l a t i o no f a l f a l f a c a id e n g g a o ( e c o l o g y ) d i r e c t e db yp r o f p a nk a i w e n a s s i s t a n tp r o f w a n gj i n c h u a n g ( c h e n g d ui n s t i t u t eo f b i o l o g y , t h ec h i n e s ea c a d e m yo f s c i e n c e ，c h e n g d u 6 1 0 0 4 1 ) a b s t r a c t c o u m a r i n sa r el a c t o n e so fo - b y d r o x y c i l m a m i ca c i d ，a n da r ea l l e l o p a t h i c c o m p o u n d st h a to r i g i n a t ei nt h ep h e n y l p r o p a n o i dp a t h w a y t h e ya r es y n t h e s i z e db y a l m o s ta l lh i g h e rp l a n t s a c c o r d i n gt op r e v i o u ss t u d i e s ，c o u m a r i n sw e r em o s t i m p o r t a n ta l l e l o c h e m i c a l si nc h i n e s ep r i c k l ya s h s y s t e m a t i c a l l yr e s e a r c ho ft h e e f f e c to fc o u m a r i nc o u l dh e l pt oc o m p r e h e n dt h ec o n t i n u o u sc r o p p i n gi m p e d i m e n t t h ee f f e c t so fc o u m a r i no ns e e dg e r m i n a t i o na n dp r i m a r yn i t r o g e na s s i m i l a t i o no f a l f a l f aw e r es t u d i e d t h em a i nr e s u k ss h o w e dt h a t ： 1 w ec o m p a r e df o u rc o m m o ng e r m i n a t i o ni n d i c e s ( s ，a s ，c r qg t ) p r e c i o u s l yc a l c u l a t e dw i t ht h e s a m ed a t e t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，a tt h e c o n c e n t r a t i o no f1 0m m ，c o u m a r i ni n h i b i t e ds e e d sg e r m i n a t i o n a m o n ga l li n d i c e s ， t h esi n d e xw a sm o s ts e n s i t i v e ，f o l l o w e db yt h ea sa n dc r gi n d i c e s a n d s u g g e s t i o n so nt h ee x p r e s s i o no fb i o a s s a yr e s u l t sw e r ea l s op r o v i d e d 2 a tc o n c e n t r a t i o n sa b o v e0 3m m ，c o u m a r i ni n h i b i t e ds e e dg e r m i n a t i o ni na c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n tm a n n e r d u r i n gs e e di m b i b i t i o ni i ，c o u m a r i na t 1 0m m s i g n i f i c a n t l yr e d u c e dt h ea c t i v i t i e so fs u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ，c a t a l a s e ( c a t ) ， p e r o x i d a s e ( p o d ) ，w h i l et h ec o n t e n to fm a l o n y l d i a l d e h y d e ( m d a ) i na l f a l f as e e d s s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d t h eh i 曲e rc o n c e n t r a t i o nc o u m a r i nd e s t r o y e ds t r u c t u r eo f m e m b r a n ea n di n f l u e n c e da c t i v i t i e so fa n t i o x i d a n te n z y m e s ，w h i c hm i g h tb eo n eo f t h er e a s o n st h a tc o u m a d nd e c r e a s e dg e r m i n a t i o nr a t eo fa l f a l f a , a n do n eo ft h ek e y f a c t o r si n f l u e n c i n gc h i n e s ep r i c k l ya s h a l f a l f ai n t e r c r o p p i n g 3 a l f a l f ap l a n t sw e r ee x p o s e dt od i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fc o u m a r i n ( o 、2 5 州、5 0 州、0 1m m 、1 0m m ) g r o w nf o r1 0d a y so nc o n t r o lm e d i u m c o u m a r i n , i i i 化感物质香豆素对苜蓿种子萌发及幼苗初级氮同化的影响 i nt h er a n g eo f2 5o m 5 0l x m ，s i g n i f i c a n t l ys t i m u l a t e dt h en e tn i t r a t eu p t a k e i n c r e a s i n gc o u m a r i nc o n c e n t r a t i o nl e dt oad e c r e a s eo fp r o t e i nc o n t e n t s i nt h e l e a v e sa n dr o o t s 毗r o o tt os h o o to u s ) f wr a t i ow a si n c r e a s e db yi n c r e a s i n g c o u m a r i nc o n c e n t r a t i o n u n d e rh i 班c o u r n a r i nc o n c e n t r a t i o n ，t h ea c t i v i t i e so fn i t r a t e r e d u c t a s e ( n r ) a n dg l u t a m i n es y n t h e t a s e ( g s ) w e r er e p r e s s e di nt h er o o t sa n d l e a v e s g l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s e ( g d h ) w a si n h i b i t e di nt h er o o t s ，w h i l ee n h a n c e d i nt h el e a v e s c h l o r o p h y l lc o n t e n t si nt h el e a v e sw e r ea l s od e c r e a s e du n d e rh i 、班 c o u m a i nc o n c e n t r a t i o n c o u m a r i nd e c r e a s e da l f a l f ag r o w t hb y ( i ) n u t r i t i o n a l d e f i c i e n c i e ss h o w nb yt h ed e c r e a s eo fn i t r a t e ，( i i ) l o w e r e dnc o m p o u n ds y n t h e s i s v i ai n h i b i t i o no fn i t r a t er e d u c t i o na n da n m a o n i u ma s s i m i l a t i o n k e yw o r d s ：c h i n e s ep r i c k l ya s h ；c o u m a r i n ；a l f a l f a ；s e e dg e r m i n a t i o n ； a n t i o x i d a n te n z y m e ；n i t r o g e na s s i m i l a t i o n i v 前言 j 月i j 吾 化感作用是指一种植物( 包括微生物) 通过向环境释放某些化学物质，在其 周围形成一个微环境区域，从而抑制或促进该区域内其他植物( 或微生物) 生长 的现象，涵盖了各种植物之间、包括微生物问的相生相克关系。它广泛存在于自 然界中，对解释植物个体及种间的相互作用机制和构建植物群落都起着重要的作 用，并对农、林业生产有重要的影响，如农作物的连作障碍，森林更新失败以及 生物入侵等现象都与化感作用密切相关【1 ，2 】。因此，深入研究化感作用具有重要 的科学和实践意义。 随着农业生产由资源消耗型向技术效益型的逐步转化，提高资源利用效率已 成为间套种植研究的重中之重，许多学者从模式组合、品种配置、水肥调控、根 系竞争与互补等多角度进行了优化资源利用效率的理论和实践探索，从复合群体 中异质个体的互作角度构建了许多指导间作套种应用的技术体系【3 7 】。在复合群 体中，两种或两种以上的作物之间，以及作物与土壤生态系统中的生物之间必然 存在相互影响，这些复杂关系中，通过作物的分泌物对不同生物产生的化感作用 是十分重要生态作用之一，也是复合群体极具潜力的调节途径之一。 岷江上游区域的花椒( z a n t h o x y l u mp i p e r i t u m ) 林生态系统是一个比较独特 的，且多分布于生态环境极端脆弱的干旱、半干旱地段植被类型，长期以来，花 椒一直都是岷江上游羌族群众致富的重要经济树种之一。当地农民为了提高花椒 产量，增加收入，往往除去林地内的杂草，使得花椒林树种单一，导致水土流失 和病虫害日趋严重，并带来严重的生态、经济和社会问题 s l 。其中最为严重的就 是水土流失和花椒因重茬失败寿命缩短，这样不仅使得生态环境本已脆弱和恶化 的地段更加难以恢复和治理。所以，针对连作带来的种种不良效应，诸如杂草滋 生、病害蔓延、有毒物质积累等对作物的影响，最好的办法就是合理布局，选择 合理的栽培方式、轮作制度、耕作系统等，尽量避免具有相克效应的作物间、混、 套作。建立多物种组成、多层次结构配置的经济价值高、生态效益好的坡地花椒 农林复合生态系统对于提高花椒质量，延长花椒寿命，减少水土流失，进而推动 和促进该区域的生态建设与社会经济的可持续发展有重要意义。 化感物质香豆素对苜蓿种子萌发及幼苗初级氮同化的影响 紫花苜蓿( m e d i c a g os a t i v a ) 是一种常见的优质豆科牧草，具有抗逆性强、分 布广、栽培面积大、产量高、品质好、利用方式多、适口性好、经济价值高等特 点，故有“牧草之王 的美称【9 】。因苜蓿具有以上优点，所以，目前试图将苜蓿 引入花椒农林模式中作为地面覆盖物，来改变单一的种植模式，提高花椒农林系 统的生态效益。 花椒叶浸提液对一些受试作物种子的萌发以及花椒幼苗生长产生明显的影 响作用，而且花椒挥发油中含有大量的化感物质【旧】，已初步证明花椒具有化感作 用。阮少波等对花椒各部位及林下土壤中的化感物质进行h p l c 测定表明，阿 魏酸、香草酸、香豆素、香豆酸等都是花椒体内的化感物质，尤其是香豆素类， 在花椒根、茎、叶及及土壤水浸液中都有存在。宋亮等研究了四种化感物质阿魏 酸、香草酸、香豆素、香豆酸对苜蓿种子萌发、幼苗体内保护酶活性的影响 1 1 1 。 但作为花椒体内最重要的化感物质香豆素类对苜蓿种子萌发及幼苗生长影响的 机理仍不清楚。国外把香豆素作为一种化感物质和一种生长抑制剂来对待，并且 进行了很多的研究【1 2 - 2 0 1 ，但香豆素抑制植物发芽及养分吸收的关键机理尚未清 楚。研究花椒体内最重要的化感物质的作用机理及生理生化特点有助于从本质上 弄清花椒化感的作用机制，为花椒间套群体探索新的调控理论依据、技术途径和 研究方法，以推动花椒间套种植的高效持续发展。 阮少波花椒水浸液对植物种子萌发和幼苗生长的影响成都生物研究所硕士论文，2 0 0 5 2 第一章研究现状 第一章研究现状 化感物质种类很多，r i c e 根据化感物质的结构把它们分为1 4 类：水溶性有 机酸，直链醇，脂肪族醛和酮；简单不饱和内脂；长链脂肪族和多炔；萘醌、葸 醌和复合醌：简单酚，苯甲酸及其衍生物；肉桂酸及其衍生物；香豆素类；类黄 酮；单宁；类萜和甾类化合物；氨基酸和多肽；生物碱和氰醇，硫化物和芥子油 苷；嘌呤和核苷【2 1 】。通常也将化感物质大致分为酚类、萜类、炔类、生物碱和其 他结构5 类 2 2 j ，从目前的研究结果来看，酚类和萜类两类次生物质是高等植物主 要化感物质，酚酸类( 包括萘醌、蒽醌和复合醌、苯甲酸及其衍生物、香豆素类、 类黄酮和单宁) 最为常见，而目前关于化感作用机制研究的化感物质也主要局限 在少数酚酸类化感物质之中f 2 3 】。 1 1 酚酸类化感物质对种子萌发的影响 1 1 1 对种子萌发率的影响 种子的萌发常常被看作是种子植物生命周期的开始，种子的萌发率和萌发速 率受环境条件的影响，所有的化感物质都对一些植物的种子萌发产生影响 2 4 j ，并 且这种影响比对植物生长发育的影响更大【2 5 】。如小麦提取液中的阿魏酸能使牵牛 花( 1 p o m o e al a c u n o s a ) 的种子发芽率从9 4 降到6 f 2 6 】；黑胡桃( j u g l a n sn i g r a ) 枝、叶、果实和根中的羟基胡桃苷被雨水带入土壤，经水解和氧化转化为胡桃醌， 在0 0 0 2 时就能抑制其它植物种子萌发f 2 7 】；宋亮等研究了阿魏酸、香豆素、香 草酸、香豆酸4 种酚类化感物质对苜蓿种子的萌发的影响，发现4 种化感物质在 1 0 3m 处理下，分别使苜蓿种子的最终萌发率降低了6 4 、4 7 、5 1 、1 6 u 。 1 1 2 对种子萌发影晌的机理 植物生长发育发生了变化与自身内部各种物质代谢过程、酶活性与激素活性 的变化是分不开的，酚酸类物质对种子萌发作用机理也可以从这几个角度考虑。 化感物质对细胞膜的伤害可能是化感物质多种效应的起始尉2 8 1 。用苯甲酸和肉桂 化感物质香豆素对苜蓿种子萌发及幼苗初级氮同化的影响 酸的衍生物处理黄瓜幼苗时发现，酚酸类物质糖基化的减退和酚基1 3 一葡糖基转 移酶活性的降低与细胞膜透性的增加是联系在一起的，酚酸类物质增加了细胞膜 的脂质过氧化作用，并造成原生质体膜的破坏【2 9 】；咖啡酸、没食子酸和酚类物质 的含量与苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸4 羟化酶活性密切相关，抑制了这些酶活性， 调节苯丙氨酸等物质代谢 2 2 , 2 3 , 2 8 】。b a z i r a m a k e n g a 等在研究大豆根对磷酸盐和甲 硫氨酸吸收时指出，苯甲酸、肉桂酸、香草酸以及阿魏酸降低了大豆根对3 2 p 和 甲硫氨酸的吸收，而香豆酸和对羟基苯甲酸增加了对3 2 p 和甲硫氨酸的吸收。所 有的酚酸类物质都降低了3 2p 向d n a 和r n a 的整合，除香豆酸和香草酸外，其 它酚酸类物质对甲硫氨酸向蛋白质整合起抑制作用。这表明，酚酸类物质对核酸 以及蛋白质合成的影响是其影响植物生长和种子萌发的机制之一【3 0 】。 种子经化感物质处理以后很多生理生化过程都发生了变化，植物化感作用首 先是对膜的伤害，通过细胞膜上的靶位点【3 l 】，然后将化感物质胁迫的信息传送到 细胞内，从而对激素、离子吸收等产生影响。这些过程的改变必然引起种子活力 下降、呼吸作用减弱、物质代谢途径以及保护酶系统的变化，从而对植物种子表 现出化感效应【3 2 1 。 1 1 3 种子萌发在化感作用测定中的应用及存在的问题 种子萌发实验是化感作用研究中最重要、应用最广泛的生物测定方法之一。 此方法简单、快速，条件易控制，需要较少的化感物质【3 3 】。通常种子萌发实验是 在大小合适的培养皿或三角瓶中进行，将经挑选的种子放入含有不同浓度化感物 质的滤纸或琼脂上。三角瓶优于培养皿之处是保湿性能良好，允许长得较高，便 于观察；缺点是载面较窄，种子数限制较大【3 4 1 。种子萌发的标准是胚根突破种皮 1 - - - - 2 m m ，萌发的时间根据植物的不同一般为1 - - 7 天【3 3 j 。 种子萌发实验过程中日照、温度、湿度、p h 值等环境条件都会影响种子萌 发，必须进行必要的调节。同时，种子萌发实验不一定适合于所有的指示植物， 特别是杂草种子，由于杂草种子萌发率低，萌发时间长，萌发不整齐，结果重现 性差。种子萌发实验的设计需考虑到生产实际以及受试植物的敏感性，消除萌发 中环境、营养等方面的限制因子，从而准确而突出地显示化感效应的大d d 3 3 1 。另 外，选取何种植物种子作为生物检测材料，不仅应考虑实验的快速、敏感以及批 4 第一章研究现状 量等因素，最重要的是有实际意义，如果实验是试图探讨化感物质对杂草的抑制 作用，采用莴苣、绿豆等可能会给出错误的检测结果，因为莴苣、绿豆等对化感 物质的响应与稗草等杂草会有所不同【3 5 】。室内生物检测所用的种子大小必须合理， 使得种子内的养分不至于在采样前消耗完，这样可以较好的消除种子对培养液 的依赖，而不向系统中引入可能的养分竞争。较大的种子，例如大豆等，比较容 易感染细菌而影响实验结果，较小的种子由于养分的有限，可能在采样前已消耗 完自身的养分。另外，由于种子密度的不同，也会导致个体种子化感物质接受量 的差异，从而影响试验结果的可靠性【3 5 1 。 种子萌发实验是定量检测植物化感作用的一种方法，因而需要一些指标来评 价，用来评价种子萌发的指标有很多，通常可分为三类：用来描述种子发芽率的、 用来描述种子萌发过程的和用来描述种子萌发曲线的【3 刚。其中种子最终萌发率 ( c r r ，t o t a lg e r m i n a t i o n ) 是一个最为常用的指标，a l l a i e 等研究表明，研在用 来评价化感物质对种子萌发的影响时的敏感性较差，发芽速度( s ，s p e e do f g e r m i n a t i o n ) 、累积发芽速度( a s ，s p e e do f a c c u m u l a t e dg e r m i n a t i o n ) 及发芽 指数( c r g ，c o e f f i c i e n to ft h er a t eo fg e r m i n a t i o n ) 比g t 更具有优越性【3 刀。a l l a i e 的实验是采用a n t h e m i sc o t u l a 叶片浸提液作为化感物质进行的，其目的是为了检 测入侵种对其他植物种子萌发的抑制作用，对于己分离、鉴定的潜在化感物质， 利用标准化学品进行生物检测，以确定其化感作用是化感研究中一个重要的环节 3 5 】，这几个指标敏感性的也需要标准化学品进行检测。另外，不同的植物发芽的 速度不同，如苜蓿的种子在处理3 6 小时后发芽率就保持稳定。，而采用天作为时 间单位很难反应其真实的发芽过程。每一个描述植物种子发芽的指标都具有局限 性，因此应根据不同的研究目的合理采用，确定一些指标的合理及敏感性在化感 作用的研究中显得尤为重要。 1 2 酚酸类化感物质对植物营养吸收的影响 1 2 1 对植物养分吸收种类和数量的影响 有关酚酸类化感物质对植物营养元素的吸收的影响已进行了大量的研究 阮少波花椒水浸液对植物种子萌发和幼苗生长的影响成都生物研究所硕士论文，2 0 0 5 5 化感物质香豆素对苜蓿种子萌发及幼苗初级氮同化的影响 脚4 0 】。许多化感物质都对植物根部吸收矿物质产生显著的影响。丁香酸、咖啡酸 和原儿茶酸可以降低豇豆对n 、k 、p 、f e 和m o 等主要元素的吸收能力，但对m g 的吸收能力不影响【4 1 1 。简单的阿魏酸还可以抑制植物x f f n 0 3 。、p 0 4 3 - 和s 0 4 2 。离子 的吸收，而阿魏酸和香豆酸的混合物使得黄瓜幼苗对p 0 4 3 。的吸收受到加合的抑 制作用【4 2 】。用阿魏酸处理黄瓜苗3h ，发现阿魏酸抑制净离子吸收量特别是n 0 3 。 的吸收，同时促进了k + 从根部的溢出，而水分吸收的下降造成了叶面水势和膨压 的下降【3 9 j 。黄瓜根系分泌物中的芳香酸可以抑制自身根系对n 0 3 。、s 0 4 2 。、k + 、 c a 2 + 、m 孑+ 和f e 2 + 的吸收，但不影响对h 2 p 0 4 - 的吸收【4 3 1 。陈龙池等应用n 同位素 示踪技术，通过盆栽实验研究了香草醛和对羟基苯甲酸对杉木( c u n n i n g h a m i a l a n c e o l a t a ) 幼苗n 素养分吸收、分配的影响，结果发现香草醛及其与对羟基苯甲 酸的混合物( 浓度比1 ：1 ) 明显抑制了杉木幼苗的生长和对n 0 3 - 离子的吸收l 4 4 j 。 1 2 2 影响植物营养吸收的机理 化感物质对营养元素吸收的干扰作用，可能是通过影响细胞膜而实现的。细 胞膜是营养元素交换、转移的重要通道，当营养元素在细胞膜的转换过程受到干 扰时，植物对营养元素的吸收作用必然受到影响。如果膜的渗透性和相关转换过 程的能量因为化感物质的出现发生变化，则营养元素在膜之间转换也将发生变化 【2 3 】。用5 0 0i t m 浓度的水杨酸作用于大麦，大麦的根细胞被迅速去极化，膜的势 差在1 2m i n 内从1 5 0m v 改变到几乎为0 ，其他的酚酸化感物质如苯甲酸和丁酸根 据他们的脂溶性不同，而对细胞膜或线粒体膜产生不同程度的去极化【4 5 】。另一方 面化感物质可以通过改变植物细胞膜透性来影响植物对营养元素离子的吸收。酚 酸类化感物质可以增加大麦根细胞的膜透性，使得许多不论正负的元素离子及其 他化合物都很容易通过大麦根细胞出入。酚酸类物质能够诱导细胞膜的变化，导 致细胞膜势或结构的变化已有广泛的共识，但详细的作用机制还需要深入的研究 【2 3 1 。另外，植物同时吸收外界的化感物质和营养元素，这些化感物质在植物体内 是怎么影响植物生长的尚未清楚。 大多数化感物质具有广谱性的作用机制，能够影响植物许多生理生化过程， 其作用机制不仅取决于化感物质的种类和浓度，而且取决于不同化感物质的组 合。现实中大多数植物的化感作用是由其释放多种化感物质而共同实现的，还要 6 第一章研究现状 受到环境因子的作用，进一步地在野外和细胞水平上评价一些典型化感植物对受 体的作用机制是非常重要和必须的脚】。 1 3 化感物质香豆素的研究概况 香豆素类物质是苯丙酸内酯( 环酯) 类化合物，绝大部分高等植物通过次生 代谢途径都能合成【1 3 】，广泛分布于高等植物中，尤其是芸香科和伞型科中【4 7 1 。 n e u r m 砒n _ n1 9 5 9 年在s c i e n c e 上的一篇文章把香豆素看作一种植物激素来研究【1 2 】， 后来的研究发现香豆素的作用机理与激素作用机理既有相似处又有不同点，经激 素处理的根系细胞的伸长生长的速度要快、持续的时间要长【4 8 】，香豆素处理的根 系细胞的伸长生长速度变慢、持续的时间不变【4 9 】。香豆素类物质被列为一类具化 感活性的物质起源于b e r e n b a u m 的实验，他们发现鳞翅类昆虫成虫不取食欧防风 ( p a s t i n a c as a t i v a ) ，鳞翅类昆虫的幼虫在欧防风上也不能正常的生长，进一步的 研究发现这种植物的体内能够合成香豆素类物质【5 0 1 ，其中的花椒毒素 ( x a n t h o t o x i n ) 对昆虫的毒性最强。目前关于香豆素类物质作用的研究多集中在以 下几个方面。 1 。3 。1 作为植保素的研究 香豆素类化合物作为植物合成的苯丙烷类次生代谢产物，与其它一些苯丙烷 类化合物如黄酮、异黄酮等一样，有许多重要生物功能：抗微生物活性、紫外线 保护，可作为调节昆虫、共生菌、病原菌与植物互作反应的信号分子【5 。许多病 原菌诱导的苯丙烷类化合物( 例如：香豆素，异黄酮) ，因为它们在体外有抑菌活 性，同时在植物体内可以积累到防止感染的浓度，被认为是植保素【5 引。b e i e r 报 道这类化合物影响植物的许多活动，例如作为植物毒素来保护植物免受感染，可 以阻止病原物在植物体内繁殖【5 3 】。 多种植物在受到微生物侵染或激发子诱导时能够合成香豆索类化合物【5 。2 0 世纪7 0 年代，f r i t i g 等在t m v 侵染的烟草中也发现有香豆素类化合物东莨菪苷的 合成，由m 造成局部坏死过敏反应中也发现有东莨菪苷的积累【54 1 。此外，s c h a l k 等研究结果表明，在对真菌激发子做出反应时，烟草培养细胞中发现有东莨菪亭 的积累。在烟草对t m v 过敏反应中在局部坏死周围有东莨菪亭所产生的荧光环 7 化感物质香豆素对苜蓿种子萌发及幼苗初级氮同化的影响 【5 5 1 。k a u s s 等以粗制真菌激发子处理大麦悬浮细胞，发现有香豆素化合物的合成 【5 6 1 。这类化合物的合成与病程相关，研究发现在一些植物一病原物不亲和互作中 东莨菪亭被快速显著地合成，而在亲和互作中东莨菪亭合成很慢并以还原态形式 存在。 1 3 2 作为植物生长调节物质的研究 香豆素化合物作为植物保护素，还控制植物的生长过程，调节植物生长活动。 b a s k i n 等从o r a l e as u b a c a u l i s 种皮提取到的香骨脂素( p s o r a l e n ) ，能够抑制自身 植物种子的萌发和其它植物种子的萌发和根的伸长吲；h a r a 等认为香豆索类至少 可以抑制纤维索的合成而调节植物生长【5 8 】。j u n t i l l a 研究发现东莨菪亭和伞形酮是 中国白菜苗非常有效的生长抑制剂【5 9 1 。k u p i d l o w s k a 等以黄瓜为材料，用香豆素 处理，发现处理后的黄瓜细胞内膜减少，内质网膜上的核糖体减少，胞内出现去 除核糖体质网膜，同时出现包括内膜降解的质体，最可能是自我吞噬的一种特征 1 6 0 。在高等植物中，此类化合物主要积累在保卫细胞、上皮细胞、以及叶子亚表 皮细胞中心液泡中【6 1 1 ，能清除活性氧达到保护植物的作用。 1 3 3 对种子萌发的影响 香豆素可以强烈抑制植物种子的发芽，植物所具有的这种能力可以在植被的 演替中增强自身的竞争力【1 6 1 。a b e n a v o l i 研究发现香豆素抑制小麦种子发芽的浓 度为2 0 0p , m ，随着浓度的增大发芽率降低【6 2 1 。b a s k i n 等研究发现) a p s o r a l e a s u b a c a u l i s 提取出的香豆素类化合物可以抑制包括自身在内的5 种植物种子的发 芽 5 7 】。f r i e d m a n 等发现剧l 4 m m im a j u s r 扣提取的花椒毒素对可以抑制其他三种植物 的种子，但对自身种子却没有影响【6 3 1 。而一些伞形科的植物体内的呋喃香豆素只 影响本科的一些植物种子的发芽l 6 4 j 。 z o b e l 和b r o w n 认为香豆素类物质抑制了细胞的有丝分裂的过程而影响植物 种子发芽的【1 6 1 。k h a n 和z e n g 认为香豆素是种子萌发过程氧化磷酸化的解偶联剂 【6 5 1 ，a l i o t t a 等的研究显示香豆素抑制了种子的吸水而导致发芽率降低【1 4 1 ， v a n s u m e r e 等则认为香豆素类物质抑制了氨基酸的运输和蛋白质的合成【6 6 1 。 a b e n a v o l i 等分阶段研究了香豆素对小麦种子发芽抑制的机理，发现香豆素最开 8 第一章研究现状 始影响了小麦种子的吸水、电解质的渗漏及氧气的吸收，然后影响保护酶和物质 转化酶的活性使得小麦种子的发芽率降低【6 2 】。种子萌发是一个复杂的过程，香豆 素类物质影响种子发芽的关键机理需要进一步的研究。 1 3 4 对根系结构及养分吸收的影响 香豆素类物质可以影响植物生长发育的很多方面，其中影响植物幼苗根系的 结构是最重要的方面之一。r i c h a r d 和c a r o l y n 在对2 3 种香豆素类物质对燕麦根 系结构影响的研究中把此类物质分为4 个等级，一是对根系结构有严重影响的， 8 一甲基香豆素、香豆素、4 甲基白瑞香、3 羧基香豆酸等；二是相对影响严重的， 3 - 甲基香豆素、4 甲基香豆素、5 甲基香豆素、6 甲基香豆素、7 甲基香豆素和 硫代香豆素；三是对根系结构有影响的，3 羟基香豆素、伞形酮、4 甲基伞形酮、 5 ，7 二羟基香豆素、6 ，7 二羟基香豆素、7 羟基6 甲氧基香豆素、3 羟基吡喃 酮等；四是没有影响的，甲氧基香豆素、茵陈素、6 ，7 二甲氧基香豆素、七叶 苷、5 ，7 二羟基- 4 甲基香豆素、3 ，4 二羟基吡喃酮等【d 7 】后来的研究中常采用 第一类物质作为研究对象。s v e n s s o n 研究发现香豆素抑制了细胞分裂和伸长生 长，导致细胞的直径增大，这种影响只有在香豆素达到一定的浓度时才会突然发 生 4 9 1 。k u p i d l o w s k a 等研究了三种香豆素类物质香豆素、7 羟基香豆素、花椒毒 素对黄瓜、玉米、豌豆根系结构的影响，其中7 羟基香豆素的作用效果要比其他 两种弱，3 种植物间黄瓜的根系最敏感，这三种物质只要是通过影响根系细胞内 质网的机构来影响其生长的【6 0 】。香豆素降低了玉米根系须根数量及分枝的密度也 是一种重要的作用机制 1 9 1 。根系的分布和结构的变化通常会引起植物对养分及矿 质元素吸收能力的变化，香豆素也可能通过此种途径来影响植物营养的吸收【6 8 1 。 a b e n a v o l i 等发现高浓度的香豆素影响了小麦根导管的大小而降低了对硝态氮吸 收速度及运转【1 7 l 。但目前关于香豆素对植物养分吸收的影响的研究很少，研究香 豆素对养分吸收的影响有助于进一步理解化感物质作用的机理。 1 4 研究展望 香豆素类物质是一类重要的化感活性物质，研究还表明香豆素类化合物具有 抗h i v 、抗癌、降压、抗心律失常、抗骨质疏松、镇痛、平喘及抗菌等多方面生 9 化感物质香豆素对苜蓿种子萌发及幼苗初级氮同化的影响 物学活性【6 9 】，在植物上的研究远落后与在医药上的研究。香豆素类化合物在农业 上应用最成功的例子是对蛇床子素的开发利用【5 l 】。而植物体内体内尤其是花椒体 内含有多种香豆素类化合物，其对其他植物和自身生长作用的机理我们还了解的 甚少，继续从香豆素类化合物中寻找对农业害虫、杂草有生物活性的物质，从而 开发低毒、高效、低残留的生物农药、开创新的轮作栽培制度是一个十分具有前 景的研究课题。 香豆素( c 9 h 6 0 2 ) 是香豆素类物质中以最简单形式存在的化合物，大部分香 豆素类化合物都具有与香豆素单体类似的性质，因此通过研究单体对于更好的理 解香豆素类化合物的作用机理具有重要的意义。本文通过研究花椒体内重要化感 物质香豆素对苜蓿种子萌发及幼苗初级氮同化的影响，继续探讨花椒和苜蓿之间 的兼容问题，为农林复合模式的构建提供新的思路。 1 0 第二章研究方案 2 1 研究目的 第二章研究方案 通过研究花椒体内重要的香豆素类化感物质对苜蓿种子萌发及幼苗初级氮 同化的影响机理，为合理的间作、套作提供科学依据，进一步对花椒重茬失败提 供科学的解决办法。 2 2 研究内容 2 2 1 对几种作物种子萌发的影响及几个问题的讨论 2 2 2 对苜蓿种子萌发的影响 各个浓度香豆素处理后苜蓿种子的萌发率，并结合筛选的指标进行分析。在 香豆素影响下，苜蓿种子每隔两个小时的吸水率，每隔半个小时的电导率及在1 、 3 、6 、1 2 、1 8 、2 4 小时的保护酶体系及m d a 含量的变化。 2 3 3 对苜蓿幼苗初级氮代谢的影响 香豆素对首蓿幼苗叶片和根中氨态氮、硝态氮、可溶性蛋白含量、初级氮同 化相关酶( n r 、g s 、g d h ) 的影响；对苜蓿幼苗根n 0 3 。吸收速率的影响。 2 3 技术路线 化感物质香豆素对苜蓿种子萌发及幼苗初级氮同化的影响 2 2 2 幼苗生长实验 2 4 实验方法 2 4 1 香豆素对作物种子萌发影响及指标筛选实验 挑选颗粒饱满、大小均匀、无破损的白菜( 牛牌1 9 号) 、萝卜( 成都大红皮) 、 水稻( 金优5 2 7 ) 、黑麦( 马波罗) 、白三叶草( 海发) 种子各5 0 粒，玉米( 长 玉1 3 ) 2 0 粒，用2 ( m v ) 次氯酸钠溶液浸泡1 5m i n ，然后用蒸馏水冲洗四次， 将种子均匀排列在垫有双层滤纸的培养皿中，分别加入5m l0 、o 1 、o 2 5 、o 5m m 不同浓度的香豆素溶液，在人工气候箱内2 5 、5 0 相对湿度黑暗中培养。以 后每隔一天各补充相应培养液2 m l 。每天测定发芽粒数，连续测定7 天，每个处 理重复三次。对获得的数据采用4 个常用的指标分析，对指标的敏感性进行方差 分析，采用的指标及计算公式见表1 。 单位重量种子获得的香豆素量的计算： ( 发芽结束时种子重量一开始发芽时种子重量) x 香豆素浓度种子干重 2 4 2 香豆素对苜蓿种子萌发的影响实验 2 4 2 1 浓度梯度实验 1 2 第二章研究方案 挑选颗粒饱满、大小均匀、无破损的苜蓿种子1 0 0 粒，用2 ( m v ) 次氯 酸钠溶液浸泡1 5m i n ，然后用蒸馏水冲洗四次，将种子均匀排列在垫有双层滤纸 的培养皿中，分别加入5m l0 、0 1 、0 2 、0 3 、0 4 、0 5 、0 6 、0 7 、o 8 、0 9 、1 0 m m 不同浓度的香豆素溶液，在人工气候箱内2 5 。c 、5 0 相对湿度黑暗中培养。每 隔2 h 计算发芽种子的数量，3 6 h 后各计算发芽率。每个处理重复4 次。 表1 实验所采用的指标及计算公式 t a b l e1 f o r m u l a et oc a l c u l a t et h eg e r m i n a t i o ni n d i c e s 2 4 2 2 时间梯度实验 试验a ：苜蓿种子在0 1m m 、1 0m m 的香豆素溶液培养1 、3 、6 、1 2 、1 8 、 2 4h 后转移到蒸馏水中继续培养至3 6h ，计算发芽率。试验条件同2 4 2 1 。 试验b ：苜蓿种子在蒸馏水中培养1 、3 、6 、1 2 、1 8 、2 4h 后分别转移n o 1m m 、 1 0m m 浓度香豆素中溶液中继续培养至3 6h ，计算发芽率。试验条件同2 4 2 1 。 2 4 2 3 实验采用的指标及计算公式见表1 ，以每6h 为时间单位计算 2 4 2 4 吸水率 每隔两小时将培养在0 、0 1m m 、1 0m m 浓度香豆素溶液的苜蓿种子取出， 用吸水纸吸干表面的水分后称重，计算种子吸水量，连续测定2 4 个小时，每个处 理重复4 次p 6 1 。 2 4 2 5 电导率 按照佘跃辉等的方法【7 3 】略作修改进行：将培养在0 、o 1m m 、1 0m m 浓度香 化感物质香豆素对苜蓿种子萌发及幼苗初级氮同化的影响 豆素溶液的苜蓿种子经自来水冲洗，无离子水洗后，用滤纸吸干，放入烧杯内加 无离子水1 0i i l l ，平衡1 0 分钟后用电导仪测定电导率，另取一只空烧杯加无离子 水作对照，每隔0 5 h 测定一次，共测定1 6 次。 2 4 2 6 保护酶及m d a 在i 、3 、6 、1 2 、1 8 、2 4 h 将培养在0 、0 1m m 、1 0m m 浓度香豆素溶液的苜 蓿种子取出，立即放液氮储存，用于酶的测定。 ( 1 ) 超氧化物歧化酶( s o d ) 活性测定方法参照g i a n n o p o l i t i s 等的方法【7 4 】 ( 2 ) 过氧化氢酶( c a t ) 活性测定参照宋松泉等的方法 ( 3 ) 过氧化物酶( p o d ) 测定参照巩普遍等的方法【7 6 1 ( 4 ) 丙二醛( m d a ) 含量测定参照g o s s e t t 等的方法【7 7 1 2 4 3 香豆素对苜蓿幼苗初级氮同化的影响 2 4 3 1 缺氮培养5 日龄幼苗 挑选颗粒饱满、大小均匀、无破损的苜蓿种子1 0 0 粒，用2 ( m v ) 次氯 酸钠溶液浸泡1 5r a i n ，然后用蒸馏水冲洗四次，将种子均匀排列在垫有双层滤纸 的培养皿中，加5m l 蒸馏水。在人工智能气候箱中2 5 、5 0 相对湿度黑暗中 培养3 6 小时。用消过毒的镊子将刚刚萌发的种子( 芽长约0 5c m ) 挑出，然后 采用国际上常用的沙培法进行培养。在每盘培养皿( 直径1 5c m ) 中，先放入5 0 g 洗净的石英沙，然后放置