（食品科学专业论文）酶解猪血红蛋白制备小肽方法的研究.pdf

酶解猪血红蛋白制备小肽方法的研究 摘要 猪血红蛋白是猪血中的重要成分，占到了全血蛋白质总量的2 3 和血细胞蛋 白质总量的9 0 以上。已有研究证明，小肽适用于不能消化和吸收完整蛋白质的 病人和易过敏病人，能避免完整蛋白质引起的免疫调节过敏反应；有利于矿物质 元素的吸收和利用；某些小肽还具有免疫活性作用，等等。铁缺乏和贫血是当今 世界上最常见的营养不良症，在中国的情况亦十分严重。血红素含有二价的铁离 子，比铁盐具有更好的吸收性，血红素铁的吸收不依赖于膳食的组成，产生的副 作用微乎其微，是一种优良的补血剂。血红素和多肽共存时，在广泛的p h ( p h 2 1 2 ) 范围内溶解性不会降低，从而可以提高铁的吸收和生物利用率。血红蛋白大多是 农业和食品加工业的废弃物，开展酶解猪血红蛋白制备血红素多肽产物的研究能 够变废为宝，同时也防止了废弃血液直接排放可能带来的环境危害，因此有着重 大的环保意义和经济价值。 为了研究猪血红蛋白的最佳酶解条件，采用正交试验法研究了酶的种类、底 物浓度、酶浓度和水解时间四个因素。对水解物的总氮、氨基氮、水解率、蛋白 质收率和血红素进行了测定。结果表明，选用木瓜蛋白酶或中性蛋白酶，底物浓 度采用1 0 或8 ，酶浓度采用4 0 0 0 u 隽，水解时间为1 3 h ，是酶解猪血红蛋白的 最佳条件。 为了进步提高猪血红蛋白的酶解效果，采用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的复 合酶对猪血红蛋白进行了水解，研究了底物浓度、加酶比例、p h 、温度对水解 率，血红素，总氮、蛋白质收率，氨基氮的影响。试验结果表明：底物浓度对指 标的影响最为显著，8 为最佳的底物浓度。p h j 7o 和7 5 都可以复合酶的酶解p h 值，但p h 为7 5 时似乎更佳。温度以5 5 为最佳水平，加酶比例是影响最不显著 的因素，它的取值可以根据实际情况来决定。 为了探索膜技术在猪血红蛋白酶解液的澄清和浓缩中的应用，试验研究了在 膜分离和浓缩过程中微滤陶瓷膜和超滤膜的性能表征，以及酶解液过膜前后多肽 类蛋白质、血红素、氨基氮成分的变化。实验结果表明：陶瓷膜对酶解液的澄清 效果很好，溶液中的蛋白质、氨基氮和血红素能够大部分获得，有一定的损失， i 但可以通过增大每批过膜料液的数量使损失的程度下降。3 5 0 0 d 超滤膜处理微滤 液有较好的蛋白质截留率，血红素的浓缩倍数大于氨基氮的浓缩倍数，说明使用 膜技术对浓缩猪血红蛋白酶解液中的多肽和血红素有效。 为了扩大猪血酶解液的应用范围，研究了活性炭脱色方法的最优条件。在试 验中不同的温度、p h 、活性炭用量、脱色时间等条件下，测定了脱色效果和蛋白 质损失率两项指标，以确定最佳的温度、p h 、活性炭用量和脱色时间。试验结果 表明：在活性炭用量为3 0 ，p h 为4 ，温度为7 0 ，脱色时间为l h 的条件 下，猪血酶解液的脱色效果明显，而且脱色酶解液具有较高的营养价值。 关键词：血红蛋白膜技术酶工程生物酶解脱色 s t u d y o nt h ee n z y m a t i cp r o d u c t i o no fp e p t i d e s f r o mp o r c i n e h e m o g l o b i n a b s t r a c t h e m o g l o b i n i sav 山a b l ei 咽司i e n to f p o r c i n eb l o o d i ta c c o u n t sf o r 押o t h i r d s p r o t e i no fw h o l eb l o o da i l dm o r et h 锄n i n e t yp e r c i 濉t h a to f b l 0 0 dc o r i m s c l e ni s t e s t i f i e dt h a ts m a l lp 印t i d e sa f es u i t a b l ef 缸p a t i e n t s 、j _ 血觞s i m i l a t i o np f o b l e m s ，m f o r a l l e r g i cp e r s o 地t h e yc a l lp r e v e n t 丘o ma n a p h y l a ) 【i si n d u c e db yi n t a 吐p r o t e i n s ；t h e y a r ei nf a v o fo f 曲s o r p t i o no fm i n e r a l 叫t r i t i o n ；s o m es m a l lp e p t i d e sh a v ei m m u n e 剃v i 吼e ta 1 i m nd e 矗c i e n c ya n da n e m i aa r et h em o s tc o m i l l o nr n a l 仰t m i o ni nt h e w o r l d ，a l s o 擎a v ei nc k n a h 锄ec o r 过a i 璐f e 2 + ，t h ea b s o r p t i o no f w h i c hi s 笋e a t e r t h 柚向t o u ss a l t s h c l i l e _ i r o ni sn o td 印e n d e n tu p o nd i e 伽yc o m p o s i t i o n 锄dp r o d u c e s l m l es i d ee 骶c t s ，s oi ti sap e 鹏吐h e m a t “c p 印t i d e sw o u l d 眦i m 血h 锄ei na s o l u b l ef o 肿w i t l l i n 诵d ep hm n g e ( 2 1 2 ) w h 肌p 印t i d e s 柚dh e m ec o e x is t ，w l l i c h c 柚e n h a i l c et h ea b s 呷蛀o n 柚db i o a v a i l a b i l i t y0 fh e m e _ i r o n m o s t0 fp o r c i n e h e m o 西o b i ni sa 啪s t eo fa 鲥c t l l t t l 】r a la n df o o dp r o c e s s i n g ，t h ei n v e s t i g a t i o no nt h e p r o d u c to f h e m e _ e 耐c h e dp 印t i d e sh y d m l y z e d f o mp o r c i n eh e m o 百o b i nc a nn o t0 1 1 l y c o n 、枷st h ew a s t et ot h eu s e 旬i n e s s ，b u ta l s op r e v e n t st h eh 删1c a u s e db yp o r c i n e h e m 吲o b i ni m m e d i a t e l ye j e c t e di m oc i r c u m s t a n c e t h e r e f o r e ，t l l ei n v e s t i g a t i o ni s g r 龃u ye c o l o g i c a l l ym 翩n i n g 血la n de c o n o i n i c a l l y v a l u a b l e ho r d e rt of i n dt h eb e s tc o n d “i 0 1 l so fe n z y m a t i ch y d r o l y s i s a i lo r t h o g o n a l t e s t w 器a d o p t e d t o i l l v e s t 遮a t e 眦y m e s p e c i e s ， s u b s t r a t e c o n c e m r a t i o n ，e m 叫m e c o i l c e m r a t i o na n dh y d r o l y s i st i m e t o t a l n h r o g e n ，a m i n om t r o g c n ，d e g r e e o f h y d r o l y s i s ，r e c y c l er a t eo fp r o t e i na n dh e m e w e r em e a s u r e dt h er e s u h ss h o w e dt h a t c h o o s i n gp 印a i no rn e u t r a lp r o t e a s e ，1 0 0 r8 o f s u b s t r a t ec o n c e m r a t i o 玛4 0 0 0 u 悖 o fe n z y m ec o n c e m 删o i l ，1 3 ho fh y d r o l y s i st i m e ，、嗍o p t i m a lc o n d i t i o n s o f e m m n a t i ch y d r o l y s i so f p o r c i n eh e m o 西o b i n t bf i l r t h e ri m p r o v et h ee 丘b c to f e n z y m a t i ch y d r o l y s i so fp o r c i n eh e m o g l o b i n ，a h y d r o l y s i sw a sc o n d u c t e db y t h ec o m b i n a t i v ee r u 可m eo f p 印a i na i l dn e u t r a lp r o t e a s e t h ei n n u e n c e so f s u b s t r a t ec o n c e n t m t i o n ，p r o p o r t i o no f e l l z y m e 是p ha n d t e m p e r a t u r e o n d e g r e eo f h y d r o l y s i s ，h e m o c l l r o m e ，t o t a li l i t r o g e l l ，r e c y c l er a t eo f p r o t e m ，锄i n o 1 n i t r o g e l l w e r ei n v e s t 培a t e d t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h ei 棚u e n c eo fs u b s t r a t e c o n c e m r a t i o nw a st l l em o s to b v i o u s ，a n d8 o f s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n 、v a st h eb e s t l e v e l b o t hp h 7 0 锄dp h 7 5c o i l l db em f o rp 印a i na n dn 踟t r a lp r o t e 私e ，b u tp h 7 5 s e e m e dt ob eb e t t e rt h eb e s tt 伽叩e r a t u r c 、糟s5 5 ，趴dt h ep r o p 硎o no fe n 巧m e s 、矾st h cl e a s t 油p o n 锄tf a 瞰) r w i l i c hc o u l d b ed e t 踟n i l l e db y l h e p r a c t i c a li l l s t 柚c e i no r d e rt o 麟p l o r et h e 印p l i c 砒i o no fm e m b r 锄et e c l l n o l o 甜t ot h ec l 撕f i c a t i o n a n dc o n c e i m m i o no fp o r c i n eh e m o 西d b i nh y d r 0 1 y s a t e t h ed h a r a c t e r so fc e r a m i c m e m b r a n e卸du h r a 丘1 t f a t i o nm e m b m n e， i nt h ec o u r s eo fc l a r i 6 c a t i o n柚d c o n c e n t r a t i o n ，w e r ei i e s t i g a t e d ，s od i d l ec h a i 培e so f c o n t e n to f p e p t i d i cp r o t e 沁 h e m e ，a i i l i n on i t r o g e n n 、a ss h o w nt h a tt h ed f b c to fc e r a m i cm e m b 啪eo n e f l z y m a t i ch y 山- o l y s a t ew a sg o o d ，a n dm o s to fp r o t e i l l ，a i t l i n on i 臼r o g e n ，h e m ew e r e a c q u i r e d t t l o u g l lac 叭a i nl o s se 】【i s t e d ，“c o u l db er e d u c e d 酊i n c r e a s i n g t h ev o l u m e o fs o l u t i o nt ob ef i l t e r e d t h er e t a i n i n gr a t eo f p r o t e i nb y3 5 0 0 d u l t n 矗h r a t i o nw a s h i 9 1 1 ，鲫dt h e 舢1 t i p l eo f c o n c e m r a t i o n0 nh e m ew a sb i g g e rt l l a l lo na r n i n o 皿r o g e 玛 s h o w i n gt t l a t t h ea p p l i c a t i o no fm e m b r a n et e c h n o l o g yt od a f ya n dc o n d e n s et h e e 北y n l a t i c l y d r o l y s a t eo f p o r c i n eh e m o 孚o b i nw a s e 任b c t i v e t oe x p l o r et h ea p p l i c a t i o na r 龃o f e n z y m a t i ch y 出o l y s a t eo fp o r c i n eb l o o d ，t h e b e s tc o n d i t i o n so f d e c 0 1 0 r i z i n gs u c ht l l i n gw i t ha c t i v a t e dc h a r c o a lw e r ci n v e s t 远a t e d w 赴hv a r i o u s t e m p e 国t u r e ，p h a n l o u mo fa c t i va _ c e dc h a r c o a l u s e d ，t i m e f o r d e c 0 1 0 r i z i n g ，t l l ee 氏c to fd e c o l o r i z i n g a i l dl o s sr 砒eo f p r o t e i nw e r em e a s w e dt o d e t e n l l i n et h eo p d m u mp a 舳e t e r s t h er e 跚h si nt h ee x p e r i m e n ts h o w e dt h a tu n d e r s u c hc o n d i t i o n sa s3 o o f a c t i v a t e dc h a r c o a lu s e d ，p h 4 ，7 0 o f t e m p e r a t u r e ，1 ho f t i m e ，t h ee n z y m a t i ch y d r o l y s a t eo fp o r d n eb l o o dw e r ed e c o l o r i z e de a e c t i v e l y ，a i l d r e m a i l l e d1 1 i g hn u t m i o n a lv a l u e k e yw o r d s ：h e m o 百o b i n ；m e m b r a n et e c l l l l o l o g y ；e m 可m ee i 培i n e e r i n g ；e n z y m a t i c h y d r o l y s i s ；d e c o l o d 西n g 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 铂历极 时间：弘 关于论文使用授权的说明 年玲j s b 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：功为自才髫l时间：孔瑚驴年月心日 导师签名 勿系勰 时间：0 眄中年4 月疋日 j 上_ i 一 刖再 1 研究的目的与意义 我国是世界上猪出栏数最多的国家，每年出产的猪血估计在9 0 万吨以上“3 ， 资源相当的丰富。猪血分为血浆和血细胞，含有丰富的蛋白质，蛋白质的量达到 全血总量的1 8 9 ，其中血浆的蛋白质含量为全血蛋白质总量的2 5 左右，血细胞 的蛋白质含量为7 5 左右。血浆蛋白质是种容易制取、用途广泛的蛋白质，已被 国内外用于肉类似物。1 、香肠、布丁的配方中。而血细胞中主要的蛋白质一 血红蛋白因色泽猩红，腥味重和不易消化等特点而受到用途限制。我国很多屠 宰场对屠宰牲畜后留下来的血液除了少部分用做菜肴食用外，如陕西的血面条、 江苏的血丝酸汤、湖南的猪血饼和血豆腐，就直接地排入了环境，既浪费了宝贵 的蛋白质资源，又严重污染了周围的环境。我国是从上世纪七、八十年代开始研 究畜禽血液的利用，到今天已经积累了很多有价值的研究资料，取得了极大的研 究进展，但也还存在着某些问题。其中的一个问题是猪血利用研究品种单一，己 报道的品种只有脱色蛋白质粉“1 、脱色氨基酸混合液”和经过微生物发酵的血粉 ”3 等少数产品；另外，目前的几种利用畜禽血的技术成本都比较高，使得其产品 的价格与其他蛋白质来源的同类产品没有竞争力。这些问题限制了我国的畜禽血 包括猪血的开发利用。因此根据猪血中的有用成分进一步开展研究，利用现代高 新技术开发新产品，提高产品的附加值，对猪血的利用走上工业化开发道路和保 护生态环境有着重要的意义。猪血的主要营养素是蛋白质，血红素是自然界中独 一无二的优良补血剂，已有资料证明血红素有机铁比无机铁更易吸收”1 。所以本 实验计划采用蛋白酶水解的方法，开发出富含血红素的多肽产品，提高产品的功 能价值，使其产生良好的经济、社会和环境效益，为猪血乃至动物血的利用探索 一些新的理论。 2 国内畜禽血红蛋白的酶解研究进展 我国酶技术在畜禽血蛋白质上的利用主要是生产脱色氨基酸营养混合液，畜 禽血酶解的效果与原料的预处理、p h 、温度、e s ( 酶底物) 浓度、底物浓度以 及激活剂的使用情况有关。 2 1 原料血的预处理 畜禽血液中的蛋白质由血浆蛋白和血球蛋白组成，绝大部分是血球蛋白中 的血红蛋白( 占到全血蛋白的2 3 ) ，然而由于血红蛋白外有一层细胞膜保护，并 且它的分子量大并呈卷曲状排列，酶对蛋白质的作用位点有限，所以必需在酶水 解之前进行必要的预处理，使血红蛋白从血球中溶出，并使之变性，改变原来的 蛋白质结构，使肽链从卷曲状变为舒展状，以增加蛋白酶与蛋白质的有效接触， 从而提高酶解效率0 3 。目前已报道的预处理主要有以下几点： 2 1 1 原料血的抗凝处理 为了使血液在实验或生产的待处理过程中不凝固结块，需要在畜禽血液中加 入抗凝弃。抗凝剂的种类有肝索、草酸钠、柠檬酸钠等“。柠檬酸钠 ( n a 3 c 6 】瞰0 7 2 珏2 0 ) 做抗凝剂，经济高效，用量可以是4 【l l 】、6 【1 2 】，1 1 3 j 。据 任文福等“”报道，柠檬酸钠的使用量从2 、1 5 、1 减少到o 5 ，即每公斤 畜血，用柠檬酸钠5 克，即可获得良好的效果。并且他们证实加有抗凝剂的畜禽 血，经煮沸变性，酶解的效果没有产生变化。 2 1 2 原料血的溶血处理 红血球的细胞膜是由蛋白质和脂类物质形成的复杂化合物组成，它不能被人 体内消化酶破坏，因此，由于细胞膜的保护作用，红血球包含的蛋白质基本上不 能被人体消化吸收。在酶解之前，也需要破坏细胞膜，使膜内的蛋白质释放出来， 以有利于蛋白酶的酶解作用。溶血的方法有低渗胀破溶血，超声波溶血，机械溶 血，冷冻溶血等“”，溶血后离心除去细胞膜的破碎残留物。 2 1 3 原料血的变性和绞碎处理 血红蛋白( i a e m 0 9 1 0 b i n ，h b ) 分子是一种混合四聚体，由两条a 珠蛋白链和 两条p 珠蛋白链组成。珠蛋白链含有1 5 0 个左右的氨基酸残基，在空间以8 段n 螺 旋组成，依次折叠成紧密状，各段连接区及两个末端为非螺旋段。整个球状结构 的内部含疏水性氨基酸残基侧链，表面则富于极性侧链。两对亚基占据在相当于 四面体的4 个角上，形成椭圆形分子。各亚基间相互嵌补，其间靠范德华力、氢 键及盐键结合，各亚基之间均有接触界面，但连接牢固程度不同“。一般在酶解 之前都需要进行变性处理。变性时有序的血红蛋白结构发生变化，表面疏水性增 加，巯基数减少，分子的椭圆率下降，分子展开，蛋白质肽链更易于被蛋白酶接 触“”。一般采用加热的方法将溶血后的畜禽血蛋白质变性。加热时应注意控制变 2 性的温度和时间。处理过度，既浪费了能源又容易引起结垢；处理不足，蛋白质 变性不充分。一般采用煮沸或者在8 0 9 0 保持4 0 分钟。杨炜等人m 还比较了无 毒害的m 9 2 + 、m n 2 _ 、z n 2 + 和乙醇等蛋白质变性剂对畜禽血液酶解效果的影响， 得出z n 2 + 适合作畜禽血液变性剂，添加变性剂可有效提高水解液中氨基氮含量的 结论。畜禽血液变性后蛋白质凝固，这时需捣碎处理，减小颗粒的体积，增大有 效表面积，有利于酶的作用效果。 2 2 酶解效果的影响因素 2 2 1 温度和p h 对酶解效果的影响 大部分蛋白酶的活性受其环境的温度和p h 值的影响，在最适p h 值下，酶反应 具有最大速度，高于或低于此值，反应速度下降。在最适温度下，胰酶的最适p h 为7 o 7 5 ，碱性蛋白酶的为9 1 1 5 ，中性蛋白酶为7 o 7 ，5 ，曲霉蛋白酶的 为7 5 。温度也是影响血蛋白酶解效果的重要因素，在最适p h 值下，中性蛋白酶 的最适温度为4 5 ，碱性蛋白酶的最适温度为4 0 4 5 ，曲霉蛋白酶的为4 5 5 5 。几种常用酶的最适p h 和最适温度见表l 。总之，酶法水解时，不同的酶，不 同的反应条件，要选择相应的最适p h 值和最适温度。 表1 几种常用酶的最适p h 和最适温度“”“1 t a b l e1 0 p t i m a lp h sa t l dt e m p e r a t u r e so fc 咖o ne n z y m e s 2 2 2 酶种类和酶用量对酶解效果的影响 酶种类是一个非常重要的影响因素。不同来源的蛋白酶对畜禽血蛋白的酶 解效果差别很大，准确选取一种蛋白酶对畜禽血蛋白的酶解结果有着十分重要的 影响。蛋白酶按其来源可分为动物性、植物性和微生物性蛋白酶三种。目前国内 在畜禽血液酶解中使用的动物性来源的酶有胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶；植 物性来源的蛋白酶有木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶；微生物性来源的蛋白酶有a s l 3 9 8 中性蛋白酶、2 0 9 碱性蛋白酶、栖土曲霉3 9 4 2 蛋白酶、米曲霉30 4 2 、w f l 4 6 高温 蛋白酶、1 6 6 中性蛋白酶、2 7 0 9 碱性蛋白酶。动物性来源的蛋白酶由于来源有限， 价格昂贵，一般只适用于医药行业和实验室工作。在食品工业上，人们的注意力 主要是集中在植物来源和微生物来源的蛋白酶的开发利用上。a s 1 3 9 8 中性蛋白 酶是一种微生物酶，它是由芽孢杆菌a s 1 3 9 8 ，经深层发酵的代谢产物提炼而成 的蛋白酶，能将大分子蛋白质分解成腺、多肽及氨基酸，是使用范围较广的一种 酶。杨炜等人在试验中选育到一株产高温蛋白酶的嗜热脂肪芽孢杆菌w f l 4 6 。该 项研究表明，用w f l 4 6 高温蛋白酶制备猪血水解蛋白水解物具有定的优势。由 于目前我国蛋白水解物的制备多采用常温蛋白酶，导致工艺时间都在2 4 小时以 上，而w f l 4 6 酶的水解过程在7 0 进行，由于温度高，酶反应速度快，所需的生 产时间只是l 小时左右。从加快生产过程，降低生产成本的角度考虑，高温蛋白 酶是一种理想的酶制剂。 酶的用量对酶解效果也有影响。在一定的酶浓度范围内，随着酶用量的增加， 畜禽血蛋白的水解率增大。据李俊安报道，胰酶在最适温度和最适p h 条件下，对 2 0 9 血粉水解，随着胰酶用量的上升，水解物氨基氮含量也相继上升，但是当胰 酶用量升至2 0 0 m g ，氨基氮含量增加至5 4 5 m g 时，基本上不再增加，说明在酶饱和 后，水解反应的速度就不再与酶的用量相关。 2 2 3 激活剂对酶解作用的影响 对蛋白酶的激活是一个复杂的问题，有其他酶的激活，有表面活性剂的激活， 有金属离子的激活，畜禽血液中蛋白酶的激活多采用金属激活的方法。金属离子 对酶活的影响见表2 4 表2几种金属离子、盐类对酶活的影响“1 t a b l e2i n f l u e n c e so fv a r i 。u s e t a l i o n sa n ds a l t so na c ti v i t yo fe n z y m e s 酶类离子或盐用量( )酶活测定( 单位g ) 上表数据是以酪蛋白为底物的测出值。对a s 1 3 9 8 中性蛋白酶的激活，钙离 子最强，镁、锌次之；对胰酶的激活，钙离子较强，镁次之，锌低于空白对照； 对栖土曲霉3 9 4 2 蛋白酶以n a 2 s 2 0 。( 硫代硫酸钠) 较强。 2 2 4 底物浓度与e s 对酶解的影响 底物浓度也是影响酶水解的一个重要因素。底物浓度太高，水解反应进行的 不彻底，产物氨基氮含量低；浓度太低，则产物浓度太稀，经济上不合算。而且 在某个底物浓度m 之前，水解率逐渐升高，在m 点的时候，水解率达到最大值，而 超过了m 值以后，水解率转而呈下降趋势，这是由于底物浓度增大后，产生底物 抑制现象，阻碍了蛋白酶对动物血蛋白的水解。e s 值，即为酶浓度与底物浓度 之比，它较酶浓度本身能更好地反映出反应过程中的反应速度特征。当底物浓度 一定而酶浓度又未使底物达到饱和时，则e s 值越大，反应速度也越大，因此在 定的水解时间内，e s 值越大，蛋白质的水解率也越大。“。 3 国外酶解畜禽血蛋白的研究状况 3 。1 从畜禽血中提取活性肽 活性肽( b i o a c t i v ep e p t i d e s ) 是一类分子量较小，构象较松散具有多种生 物功能的小肽，这些小肽包括由体内的内分泌腺分泌的多肽激素( 肽类激素) 、 由血液或组织中的蛋白质经专一的蛋白酶分解而产生的组织激肽等。 从2 0 世纪7 0 年代初国外就开始了许多种源自食物蛋白质的生物活性肽的研 究。人们用酶解的方法将在母体蛋白质序列中没有体现活性的活性肽释放出来。 用于制取多肽的蛋白质资源包括牛奶、大豆、鱼和小麦。动物血的蛋白质也被用 来研究某些生物活性肽的制取。从牛血红蛋白的胃蛋白酶水解物中可以分离得到 一些活性肽，例如阿片样肽( 唧i o i dp e p t i d e s ) 。“、血管舒缓激肽( b r a d y k i n i n p e p t i d e s ) 。”、微生物生长促进肽( b a c t e r i a lg r o w t hs t i 叫1 a t i n gp e p t i d e s ) “。从不同种类的动物血蛋白的水解物分离得到了几种血管紧张肽转化酶 ( a i l 豇o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z ) r m e ，a c e ) 的抑制肽2 “2 “。从牛血清的胰蛋白酶 水解物中分离出一种血管舒缓肽( a l b u t e n s i n a ) 。”。从清蛋白的胃蛋白酶水解 物中得到一种与神经降压素有关的肽油1 。发现来源于牛血清水解物的多肽具有抗 基因毒害的作用”1 。 3 2 酶解畜禽血制备富血红素铁多肽的产品 国外对畜禽血蛋白利用的另一条重要途径是酶解血红蛋白生产富血红素多 肽的产品。在发展中国家，由于以谷物膳食为主引起的铁生物利用率差和寄生虫 感染引起的血损失，造成贫血病的发病率很高。在工业化国家，贫血症也在成长 中的婴儿、孕妇和胎儿、经期的妇女和青年女性这样一些对铁有高需求的人群中 发生。”。为了防治贫血症，硫酸亚铁被广泛地使用。但是此种治疗剂常有副作 用，包括恶心，上腹部不适，腹痛，便秘，腹泻等。由于这些原因，新的具有良 好吸收和耐受性的含铁制剂为人们所需求。血红蛋白铁比铁盐有更好的吸收性， 许多研究已经表明血红素铁的吸收不依赖于膳食的组成，产生的副作用微乎其微 “。因此，血红蛋白血红素铁有可能在未来成为优质的防治贫血病的铁源。 e r i k s s o n ( 1 9 8 3 ) 。2 1 提交了一种生产富含血红素铁的氨基酸专利。但后来发现血 红素在酸性环境中呈聚合物存在，生物利用率差；并且纯氨基酸的营养液在肠道 内形成高渗的环境，使肠腔壁细胞的胞液排入肠腔，高浓度的h + 离子会刺激肠道 的蠕动，容易引起恶心、腹胀、腹泻等症状。最近人们发现血红蛋白水解消化产 生的多肽能保持血红素在较宽广的p h 范围内处于溶解状态。“，同时多肽具有独特 6 的营养功能，不具高渗性，于是掀起了一股富血红素多肽产物的研究高潮。 p i o t ( 1 9 8 8 ) 将超滤技术应用到牛血红蛋白水解物的制备中。l e b r u n ( 1 9 9 8 ) 1 等研 究了分子水平上牛血红蛋白水解物中各成分之间的作用对超滤的影响。 b e l h o c i n e 和m o k r a n e ( 2 0 0 0 ) 等研究了血红蛋白在连续膜反应器中的酶解最优 化条件。国外对富血红素铁多肽产物的研究正方兴未艾。 7 第一章猪血红蛋白酶解的研究 第一节不同酶水解血红蛋白的比较研究 摘要：为了找到一种适合猪血红蛋白水解的蛋白酶，本文对几种不同来源的蛋 白酶进行了比较。在各种酶的适宜p h 和温度条件下，用正交试验的方法研究了 不同酶种类、酶浓度，水解时间和底物浓度四种因素对水解液的水解率、蛋白质 收率、总氮、氨基氮和血红素的影响。试验结果表明：选用木瓜蛋白酶或中性蛋 白酶，底物浓度采用l o 或8 ，酶浓度采用4 0 0 盹垤，水解时间取1 3 h ，可作为 酶解猪血红蛋白的最优条件。 关键词：血红蛋白酶工程生物酶解小肽 a b s t 随吐：t bf i n dap r o t i nf a v o ro ft h eh y d r o l y s i so fp o r d n eh e m o g l o b 氓 p r o t e a s 疗o md i f f b 陀n ts o u r c e sw e r cs t u d i e d u n d e ro p t 咖mp h sa n dt e m p e r a t u r e s o f v 撕o u sp r o t e 幽e 吕t l l 锄s e l v e s ，t l l ei n f l u c e so f t h ef 缸o r ss u c ha se n z y m e s p e c i e s ， e m 可m ec o n c e m r a t i o i l ，h y d r o l y s i st i m e 吼l b s t r a t ec o n c e n 仃砒i o no nt h ei n d e x e sw h i c h w e r ed e 殍o f h y d l o l y s i s ，r e c y c l er a t eo fp r o t e i n ，t o t a ll l i t r o g e n ，锄i n on i t r o g 饥， h 锄o c h r o m ew e r ei n v e s t 培a t e d t l l r o u g hal 1 6 ( 4 ) o r t h o g o 芏l a lt e s t t h er e s u l t ss h o w e d t h 砒u s i n gp a p a i no rn e u t r a lp r o t 魄s e ，l ( ) o r8 o f s u b s t r a t ec o n c e 蛐r a t i o n ，4 0 0 0 u 幢 o fe m 了m ec o n c e i l n 嘶。玛1 3 ho f h y d m l y s i st i t n e c o l l l db eo p t i n m mc o n d i t i o n sf o r e n 巧m a t i ch y d r o l y s i so f p o f c i n eh e i t i o 西o b i n k e yw o r d s ：h e m o g l o b i n ：e n 巧m e 朗画n e 酣n g ；e r 岬1 a t i ch y d m l y s i s ；s m a l lp 印t i d e s 猪血红蛋白是猪血中的重要成分，它的量占到了全血蛋白质总量的2 3 ，占 血细胞蛋白质总量的9 0 以上。血红蛋白分子由珠蛋白和血红素构成的亚基组 成。变性以后的血红蛋白，其珠蛋白的球状结构展开，血红素从珠蛋白的血红素 口袋伸展出来，经过酶解，可以得到氨基酸、小肽和血红素的混合物。已有研究 证明，小肽适用于不能消化和吸收完整蛋白质的病人、胃病和肝病的病人，可以 作为他们膳食中蛋白质的主要形式；适用于易过敏病人，避免完整蛋白质引起的 免疫调节过敏反应；有利于矿物质元素的吸收和利用：某些小肽还具有免疫活性 作用，等等”“。另外，铁缺乏和贫血是当今世界上最常见的营养不良，在中国也 8 情况严重。以硫酸亚铁作为补铁剂在世界各国很普遍，但硫酸亚铁有较强的副作 用，现在也有人使用元素铁粉作为补铁剂添加于面粉、早餐谷物和婴儿食品中， 此方法可以延长食品的货架期，但它的生物利用率不稳定。”。血红素含有二价f e 离子，比铁盐有更好的吸收性，血红素铁的吸收不依赖于膳食的组成，产生的副 作用微乎箕徽，是一种优良的补血剂。血红素和肽共存时，在广泛的p h ( p h 2 一1 2 ) 范围内血红素的溶解性也不会降低，从而提高了铁的吸收和生物利用率。 屠宰场的血红蛋白大多数是农业的废弃物，开展猪血红蛋白酶解生产富含血 红素和多肤产物的研究可以变废为宝，同时也防止了直接排放可能带来的环境危 害，因此有着重大的环保意义和经济价值。开展猪血红蛋白酶解研究首先要选用 适宜的酶类进行水解，因此本文从商业化的4 种蛋白酶出发，考察不同来源蛋白 酶对猪血红蛋白酶解的效果，同时还考察影响酶解反应的三个因素：底物浓度、 酶浓度和水解时间，为进一步深入研究打下基础。 1 材料和方法 1 1 材料 1 1 1 粗血红蛋自新鲜卫生猪血加o 5 的柠檬酸钠抗凝，用干净纱布过滤除纤， 再在3 5 0 0 r m i n 转速离心2 0 m i n ，弃上清渡，沉淀物用生理盐水清洗，然后同样转 速离心2 0 m i n 。重复两次。最后冷冻备用。 1 1 2 酶制剂木瓜蛋白酶广州远天酶制剂厂 a s l 3 9 8 中性蛋白酶2 7 0 9 碱性蛋白酶房山酶错4 荆厂 胰蛋白酶上海实验试剂有限公司 1 ，1 3 其他试剂l 半胱氨酸盐酸盐氯化血红素( b r )e d t a酪氨酸 柠檬酸钠甲醛酪蛋白氢氧化钠磷酸氢二钠硫酸铜 1 2 主要仪器 电热恒温水浴锅医用离心机微量凯氏定氮装置精密p h 计 7 5 4 型紫外可见分光光度计电动搅拌器捣碎机电子天平微量滴定器 1 3 试验方案 以血红蛋白酶解后的蛋白质收率，水解率、氨基氮、总氮以及血红素为指标， 选用酶种类( e ) 、底物浓度( s ) 、酶浓度( e s ) 和水解时间( h ) 为试验因素 ( 试验因素和水平见表1 1 ) ，进行正交试验，正交表选用l 1 6 ( 4 5 ) ，以获得最 佳水解条件。探讨各酶在比较适宜的p i 和温度下作用。酶解液体积1 0 0 0 商。 表i 1 不同酶水解猪血红蛋白的试验因素和水平 1 a b l e1 1f a 她a n d l e v c l so f e x 群而n t f o f t l i e 坶d r d 噼i so f p o r c i n e h 册。甜o b i l l 砸山 v a r i o me i l 巧 注：( 各酶的作用p h 争温度) 木瓜蛋白酶：p h = 8 ，o ，t = 5 5 ；中性蛋白酶：9 h _ 7 ，5 ，t = 4 0 ；胰蛋白酶：p h _ 7 5 ，t 。4 5 ；碱性蛋白酶p h = 1 0 5 ，t 4 5 。 1 4 操作步骤 ( 1 ) 粗血红蛋白的取样；用觊氏定氮法测缛粗血红蛋自的蛋白质含量为 3 0 2 5 m 咖l ，根据底物浓度取样。 ( 2 ) 粗血红蛋白的变性：加5 0 m l 蒸馏水进各组样品中，在9 5 水浴中加热 变性4 5 m i n 。 ( 3 ) 捣碎：变性后的血红蛋白在1 0 0 0 0 r p m 的速度捣碎。 ( 4 ) 酶解：在适宜的温度下水解，水解过程调p h ，使之保持在原来的值不 变。 ( 5 ) 灭酶：水解完成后，用6 m o l 1 h c l 调p h 至4 5 ，在9 0 加热3 0 m i n 灭酶。 ( 6 ) 冷却离心：在4 0 0 0 r p m 速度离心2 0 m i n ，得上清液。 ( 7 ) 记录上清液体积。 1 5 测定项目与方法 1 5 1 酶活力的测定参照 4 0 方法。测定木瓜蛋白酶时，需要活化木瓜蛋 白酶。方法是：02 6 4 9 l 一半胱氨酸盐酸盐和0 1 1 8 9 n a 2 e d t a 用4 0 m 1 的0 1 m o l i 磷酸 氢二钠溶液溶解，然后同一溶液调p h 至7 5 ，定容到1 0 0 m 1 ，用此溶液溶解木瓜蛋 自酶。酶活的定义；3 0 ，p h 7 5 的条件下，水解酪蛋白每分钟产生1 u g 酪氨酸为 一个酶活力单位。酶活的测定结果见表1 2 。 1 0 表1 2 四种酶的酶活测定结果 1 曲l e1 21 1 i c 佗s l l l 忸0 f 吐埠d e 蛔m i n 撕o n0 f 枷、1 i 6 船o f f 0 盯k i n d so f 雠z y n ”s 1 5 2 总氮测定方法改良凯氏定氮法p 1 】 1 5 3 氨基氮测定方法甲醛滴定法 1 5 4 血红素测定方法分光光度法“” 1 5 5 蛋白质收率蛋白质收率硼n l o o “ 式中，r r 水解液中粗蛋白质量，粗蛋白质量= 总氮6 2 5 n 加入蛋白质的量 1 5 e 水解率= 赢1 0 删 2 结果与分析 各项指标的测定结果见表1 3 。 表1 3 不同酶水解猪血红蛋白正交试验结果 t a b l e l 3t h er c s u l t so f n l e 0 r d 峭o n a lt 。s t 伽血eh v d r o h s i so f p o r c 岫h 啪咀0 b i nw i m 黧懋螋鲤j 职竖 试原料血上清液 效果 萼总酏，薯箩警总弛，訾专警篓气曩笋 l1 6l o o1 2 0 8 4 8 8 lo 2 8 77 5 5 03 05 0 6 21 28 8 01 3 5 68 4 1 80 3 2 21 0 5 96 57 6 5 36 44 00 9 8 5 3 5 5 2o 2 8 81 5 3 8 85 55 0 0 49 66 01 f 5 2 35 0 7 4 o 3 3 41 58 6 55 28 5