（微生物学专业论文）人白细胞介素４在衣藻叶绿体中的高效转化及表达.pdf

上海交通大学硕士学位论文 i 人白细胞介素在衣藻叶绿体中的高效转化及表达 摘要 叶绿体转化是近些年发展起来的一项环境友好的基因工程技 术由于叶绿体基因组的高度多倍性叶绿体转化允许每个细胞中 导入近百到数千个拷贝的外源基因并表达较高水平的外源蛋白 近几年来尽管高等植物叶绿体表达系统也成功地高表达了数种蛋 白质药物如人生长激素人血清白蛋白人胰岛素口服疫苗等 但由于植物叶绿体转化及转基因植物再生障碍以及植物代谢产物 复杂而不利于提取纯化等问题使得该项技术的应用受到限制因 此人们把研究的目标转向莱茵哈德衣藻的叶绿体转化系统 本文利用 pcr 融合技术将人白细胞介素 4 基因(hil4)融合到莱 茵哈德衣藻叶绿体基因组 rbcl 5-utr 和 3- utr 非翻译区序列之 间得到了 5utr-hil4-3utr 融合表达单元然后将其插入到来 源于莱茵哈德衣藻叶绿体基因组 5.7kb的同源片段中 构建成 pxhil4 同源重组交换质粒利用电脉冲法将 pxhil4 质粒与含有 aada 基因 的壮观霉素抗性质粒p228 共同转化莱茵哈德衣藻叶绿体 本实验研究了莱茵哈德衣藻的生长条件生理特性以及在电脉 冲转化中所需的化学物理参数及其与转化效率的相关性并进行 转化子筛选与检测初步探讨了外源基因在莱茵哈德衣藻叶绿体中 的同质化进程从含有 100ug/ml 的壮观霉素抗性平皿上筛选到阳性 藻落并通过 pcr 扩增方法检测到 hil4 基因检测结果显示其 上海交通大学硕士学位论文 ii 共转化频率高达 90经过 western blotting 印迹转移分析证实了 人白细胞介素 4基因在转基因莱茵哈德衣藻藻株中成功获得表达 本文建立的电脉冲转化的方法是一种简单方便高效的莱茵 哈德衣藻叶绿体转化方法为进一步研究在莱茵哈德衣藻叶绿体中 高效表达外源蛋白奠定了基础 关键词人白细胞介素莱茵哈德衣藻叶绿体基因工程 电脉冲转化 上海交通大学硕士学位论文 iii high- frequency electroporation and expression of human interleukin 4 gene in chlamydomonas reinhardtii chloroplast abstract chloroplast transformation has been emerged as an environmentally friendly approach for plant genetic engineering. due to high multi-fold occurrence of chloroplast genomics, chloroplast transformation may allow a single cell to be transformed with hundreds to thousands copies of foreign genes, and express foreign proteins at high level. in recent years, several kinds of protein medicines, for instance, human growth hormone, human serum albumin, human i nsulin, oral vaccination, et al., have been successfully expressed in high plant chloroplast. however, practical application of these expressed products are markedly limited, because of technique difficulties in plant chloroplast transformation and the obstacle of plant regeneration, as well as the complexity of plant metabolic products. therefore, the research interests have been moved to use chlamydomonas reinhardtii as chloroplast transformation system. in this study, hil4 gene was integrated between chlamydomonas 上海交通大学硕士学位论文 iv reinhardtii chloroplast genome rbcl 5- and 3 untranslated regions (utrs)and successfully formed the expression cassette 5 utr-hil4- 3utr fragment by fusion pcr amplification technology. hil4 gene under the control of utrs can enhance the stability of hil4 gene translation and expression. this fusion fragment 5utr-hil4-3utr was then introduced into expression vector p322-btm by bamhi site to obtain homologous recombinant plasmid pxhil4, which contains a homologous fragment (5.7kb) with chlamydomonas reinhardtii chloroplast. cells of chlamydomonas reinhardtii were cotransformed by electroporaion with plasmid pxhil4 and the selectable marker plasmid p228 conferring resistance to spectinomycin. transformants were screened on the plates containing 100ug/ml spectinomycin. the positive transformants were picked and primarily confirmed by pcr to amplified hil4 gene. chlamydomonas reinhardtii cultures were intensively studied for their growth and physiological characteristics. moreover, the pertinence between the chemical lane 2, 5utr; lane 3, 3utr; lane 4, hil4; lane 5, 5utr- hil4; lane 6, 5utr- hil4-3utr 引物 p1p6 分别设计了 bamhi酶切位点即在片段 5utr- hil4-3utr 的两端具有 bamhi酶切位点可以利用这个酶切位点进行以下酶切鉴定连 接步骤 3.2ta 克隆阳性质粒的鉴定 将融合 pcr 片段 5utr-hil4-3utr 克隆在 ta 载体上转化 e.coli dh5 菌株抽取质粒 dna经过 0.7琼脂糖凝胶电泳检测fig 2-6可见两种大 小有差异的电泳条带由于携带外源 dna片段 5utr- hil4-3utr约 1.0kb 的质粒比空载体ta 载体约 3.0kb大可以推测电泳条带较小的质粒图 2- 6, lane 1,4,16是空载体并对电泳条带较大的质粒进一步进行 bamhi酶切fig 2-7a及 pcr 扩增fig 2-7b鉴定 图 2-6ta克隆质粒检测结果 fig.2-6 detection of ta cloning plasmids 上海交通大学硕士学位论文 第27页 如图 2-7 可见待鉴定的 ta 克隆阳性质粒fig2-7a, lane 3明显比阴性 对照质粒fig2-7a, lane 1pks 大并且进一步用 bamhi消化能够形成两条 明显的特征带fig2-7a, lane 23kb 和 1kbta 克隆空载体已知为 3kb 大 小 5utr- hil4-3utr 约为 1kb 大小 同时进行 pcr 扩增分析 利用引物 p3/p4 在 2.3.1pcr 扩增条件下能够看到与阳性对照 hil4fig2-7b, lane 1同样大小 的特征带大小约 400-500bpfig2-7b, lane 2因此bamhi酶切及 pcr 扩 增分析的鉴定结果是此质粒为 ta 克隆阳性质粒 图 2-7ta克隆阳性质粒 bamhi酶切(a)及 pcr 扩增(b)鉴定 fig.2-7 identification of ta cloning positive plasmid by bamhi digestion(a) and pcr amplification(b) a: m, dna marker; lane 1, control of pks plasmid(3.0kb); lane 2, ta cloning plasmid digested by bamhi; lane 3, ta cloning plasmid b: m, dna marker; lane 1, positive control of hil4 gene; lane 2, pcr amplification of ta cloning plasmid by primer p3/p4 3.3p322-btm 载体的构建 质粒 p322 经过 bamhi酶切分析被消化成两条带约 3.8kb 和 5.0kb fig2-8a, lane 2说明质粒 p322 含有两个 bamhi位点 将质粒 p322 经过 ecori-xhoi酶切分析被消化成两条带约 5.7kb 片段和 3.2kb已知质粒 p322 的 ecori-xhoi片段5.7kb即莱茵哈德衣藻叶绿体基因 组的同源序列进一步将此 ecori-xhoi片段5.7kb用 bamhi消化只有一 条带fig2-8b, lane 3说明此 ecori-xhoi片段5.7kb中只含有一个 bamhi 上海交通大学硕士学位论文 第28页 位点即被消化掉的片段中含有另一个 bamhi位点 图 2-8p322(a)和 pbtm116(b)酶切分析 fig.2-8 analysis of p322(a) lane 1, p322 plasmid digested by ecori-xhoi; lane 2, p322 plasmid digested by bamhi; lane 3, p322 plasmid b: m, dna marker; lane 1-2, pbtm116 plasmid digested by ecori-sali; lane 3, extraction of p322 5.7kb dna fragment (ecori-xhoi) digested by bamhi 质粒 p322 的 5.7kb 片段ecori-xhoi是来源于莱茵哈德衣藻叶绿体基因 组反向重复序列的一段同源 dna 片段在其 bamhi位点插入外源目的基因 hil4通过同源重组将 hil4 基因整合到莱茵哈德衣藻叶绿体基因组 由于外源基因 hil4 的插入位点是 bamhi位点因此需要构建仅含有一个 bamhi位点的同源重组交换载体以避免在进行 bamhi酶切时将载体切成几段 第一步将质粒 pbtm116 进行 ecori-sali酶切fig2-8b, lane 1-2以消化 掉多余的 bamhi位点切下的碎片非常小约为 16bp因此采用乙醇沉淀小片 段的方法 实验方法2.4 回收 得到约5.8kb大片段 将质粒p322进行ecori-xhoi 酶切fig2-8a, lane 1以消化掉多余的 bamhi位点并将足量的酶切产物进行 0.7琼脂糖凝胶电泳用 dna 琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目标 dna 片段 5.7kb 第二步 将质粒 p322 的 5.7kb 片段 ecori-xhoi 与质粒 pbtm116 的 5.8kb 片段ecori-sali用 t4 dna连接酶连接并将酶连产物转化 e.coli dh5 菌 上海交通大学硕士学位论文 第29页 株利用 xhoi和 sali是同尾酶的性质得到构建的同源重组载体 p322-btm 质 粒大小约 11kb 第三步抽取 p322-btm 质粒 dna利用 0.7琼脂糖凝胶电泳检测图 2-9a及 bamhi酶切图 2-9b鉴定得到仅含有一个 bamhi位点的酶连产物 p322-btm 质粒由图 2-9a 琼脂糖凝胶电泳检测质粒图可见6 个待检测的酶 连产物样品图 2-9a, lane2-7中仅只有 1 个图 2-9a, lane4是阳性酶连产 物原因可能是由于乙醇沉淀 pbtm116 酶切小片段不彻底因此产生很多自 连产物将待鉴定的阳性质粒fig2-9a, lane 4进一步作 bamhi酶切分析可 见一条略大于 10kb 的特征带符合预期大小 11kb 并且仅有一个 bamhi酶切位 点结果证明此连接产物为同源重组载体 p322-btm 质粒 图2-9酶连产物 p322-btm 质粒(a)及其 bamhi酶切(b)鉴定 fig. 2-9 production of p322-btm ligation(a) lane 2-7, production of ligation; lane 8, control of peg202 plasmid(10kb) b: m, dna marker; lane 1, p322-btm plasmid digested by bamhi; lane 2, p322-btm plasmid 3.4pxhil4 同源重组质粒的构建及 hil4 基因插入方向的鉴定 3.4.1 从阳性 ta 克隆质粒上用 bamhi酶切并回收得到 5utr- hil4-3utr片段 约 1kb 3.4.2 将载体 p322-btm 质粒用 bamhi酶切线性化大小约 11kb 3.4.3 用 t4 dna 连接酶 16?过夜反应连接两条 dna 片段由于载体片段和 上海交通大学硕士学位论文 第30页 外源片段均比较大为保证有效连接采用 dna比例 5:15utr- hil4-3utr 片段p322-btm 线性化 dna片段 3.4.4 将连接产物转化 e.coli dh5 菌株抽取质粒 dna由于是单酶切位点连 接因此产生许多自连产物需要进一步筛选阳性连接产物 3.4.5 利用 bamhi酶切及 pcr 扩增分析鉴定 pxhil4 同源重组质粒如图 2-10a 可见阴性对照空载体 p322-btm 经过 bamhi酶切被消化成一条带fig2-10a, lane 2略大于 9.4kb阳性连接产物经过 bamhi酶切被消化成两条带fig2- 10a, lane 3一条略大于 9.4kb和空载体一样大小一条大于 564bp 的特 征带可推测是 5utr- hil4-3utr 片段 1kb进一步将样品用 p3/p4 引物 pcr 扩增 hil4 基因分析可见阴性对照载体 p322-btm 经过 pcr 扩增没有出 现可见特征带fig2-10b, lane 2阳性连接产物经过 pcr 扩增出现明显可见 的特征带略大于 400bpfig2-10b, lane 3结果表明hil4 基因已经整合 到载体 p322-btm 的 bamhi酶切位点上 图2-10pxhil4 质粒的鉴定ab及 hil4 基因插入方向的鉴定c fig. 2-10 identification of pxhil4 and the insert direction of hil4 gene a: analysis of products digested by bamhi. lane 1, dna marker; lane 2, empty vector p322-btm; lane 3, 5utr- hil4-3utr fragment inserted into vector. b: pcr analysis of hil4 products. lane1, dna marker; lane 2, empty vector; lane 3, 5utr- hil4-3utr fragment inserted into vector. c: identification of the insert direction of hil4 gene by psti digested. lane 1, dna marker; lane 2, forward direction (pxhil4); lane 3, empty vector; lane 4, reverse direction 上海交通大学硕士学位论文 第31页 3.4.6 hil4 基因插入方向的确定hil4 基因插入载体 p322-btm 的方向是随机 的可能是正向插入也可能是反向插入通过 bamhi酶切及 pcr 扩增虽然能够 很方便的检测到外源基因但是并不能确定其方向为了保证 hil4 基因的正常 表达需要进一步鉴定其方向性不同插入方向的酶连产物被 psti酶切成大小 不同的 dna 片段正向的酶连产物被 psti消化成 2.3kb2.9kb7.2kb 片段 反向的酶连产物被 psti消化成 2.5kb2.7kb7.2kb 片段进一步鉴定的结果 如图 2-10cfig 2-10clane 2是正向酶连产物即携带 hil4 基因的莱茵哈 德衣藻叶绿体重组交换质粒 pxhil4 本章小结 本章介绍了莱茵哈德衣藻叶绿体同源重组交换质粒 pxhil4 的构建过程 实验结果表明在 hil4 基因的两端成功的融合了 utr 非翻译区域这段序 列对外源基因的表达稳定性起到了重要的作用并且成功的构建了表达载体 p322-btm此表达载体含有唯一的 bamhi酶切位点并且有一段 5.7kb 的莱茵哈 德衣藻叶绿体基因组同源序列最后将融合片段 5utr-hil4-3utr 正向插入 到表达载体 p322-btm 的 bamhi酶切位点上构建了莱茵哈德衣藻叶绿体同源 重组交换质粒 pxhil4为下一步进行电脉冲转化作好了准备 上海交通大学硕士学位论文 第32页 第三章电脉冲法转化莱茵哈德衣藻叶绿体 材料 1.1主要实验仪器 光照恒温培养箱hpg-320哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 电转化仪electroporator2510eppendorf公司 sds-page 凝胶电泳仪和电泳槽北京市六一仪器厂 1.2菌株和质粒 菌株 chlamydomonas reinhardtii 137c(mt+)质粒 p228 由加拿大西安大略大 学医学院 s. w. ma 教授馈赠 1.3培养基 tap 培养基 1l 22 1m tris base 20ml phosphate buffer 1ml hunters trace metals 1mlnutrient stock 10ml冰醋酸约 1ml 调节 ph7.0 phosphate buffer1lk2hpo4 108gkh2po4 56g nutrient stock1lnh4cl 40gmgso4 7h2o 10gcacl2 2h2o 5g hunters trace metals 配制将 50g edta加热溶解于 250ml ddh2o将以 下成分依次加入溶解于 100550ml ddh2obo3h3 11.4gznso4 7h2o 22.0g mncl2 4h2o 5.06gfeso4 7h2o 4.99gcocl2 6h2o 1.61gcuso4 5h2o 1.57g mo7o24(nh4)6 4h2o 1.1g混合以上两种溶液颜色为蓝绿色加热至 100 稍微冷却温度 80-90用 20 koh 约 83ml 调节 ph 值 6.5-6.8在调节 过程中温度不能低于 70用 ddh2o 定容到 1l混合均匀装入棕色瓶放置 几天待溶液的颜色由绿色转变成紫色用三层滤纸过滤溶液4避光保存 1.4蛋白质分析相关试剂 1.4.115 sds-page 凝胶配制 上海交通大学硕士学位论文 第33页 分离胶5ml 水 1.1ml 30丙烯酰铵溶液 2.5ml 1.5m trisph8.8 1.3ml 10 sds 0.05ml 10 过硫酸铵 0.05ml temed0.002ml 积层胶2ml 水 1.4ml 30丙烯酰铵溶液 0.33ml 1.0m trisph6.8 0.25ml 10 sds 0.02ml 10 过硫酸铵 0.02ml temed0.002ml 1.4.2 电泳缓冲液考马斯亮蓝染色液脱色液的配制及操作方法见分子克隆 实验指南 1.4.3western blotting 分析相关试剂 a1a2c 0.5m tris ph10.4300ml25ml25ml 0.4m 己酸 50ml 甲醇 100ml100ml100ml 双蒸水 100ml375ml325ml 总体积 500ml500ml500ml 10 倍 tbs 缓冲液1l24.2g tris base ph7.680g nacl 方法 2.1莱茵哈德衣藻培养条件 本研究采用 chlamydomonas reinhardtii 137c(mt+)藻株在 tap 液体培养基 或含 1琼脂糖的固体培养基中, 22-24? 300lux 光照条件依据不同实验目的 连续培养 5-10 天液体培养可在 100rpm光照摇床振荡培养 上海交通大学硕士学位论文 第34页 2.2野生型莱茵哈德衣藻对壮观霉素spc敏感性的检验 将在 tap 固体培养基上生长良好的莱茵哈德衣藻单藻落分别接种于含有 50ug/ml 和 100 ug/ml 壮观霉素spc的 tap 固体培养基上每种处理设置三 次平行实验重复按照 2.1 培养条件培养 15 天观察莱茵哈德衣藻繁殖状况 2.3电脉冲法共转化方法的建立 取 od750值达到 1.4-1.6 即培养四天的莱茵哈德衣藻菌液在冰上预冷后加 入 10 tween-20(1/2000 v/v)800g 4 ?离心 5min 收集菌体用 ddh2o 洗涤细 胞 3 次后溶于 2ml 新鲜 tap 培养液加入等量 50 peg50mm 蔗糖混 匀后取 70ul 悬浮液加入到 1mm电击转化杯每杯加 20ul 10鲱鱼精 pxhil4 和 p228 质粒 dnapxhil4/p228 为 3?1室温下 2.1kv/cm 电场强度进行电脉 冲转化22复苏 8小时涂于 100ug/ml 壮观霉素的 tap 平皿上 22 300lux 生长 6-8天即可筛选共转化子 2.4莱茵哈德衣藻总 dna的提取/methods/dna.html 从平板上刮取几环生长良好的莱茵哈德衣藻细胞放入有 0.5mlten 缓冲 液的 ep 管 剧烈涡旋混匀细胞10000rpm离心 10sec吸走上清 用冰冷的 ddh2o150ul重悬细胞加入 300ul sds-eb溶液涡旋混匀 用 350ul 酚氯仿 11 抽提 1 次涡旋混合几分钟 12000rpm离心 5min 吸取上层液体到另一 ep 管中 用 300ul 氯仿异戊醇241再抽提 1 次吸取上层液体到另一 ep 管 中 加入 2 倍体积冰乙醇冰上放置 30min12000rpm离心 10min 用 700ul 70乙醇洗涤沉淀 1 次 待沉淀干燥后溶解于 20-40ul ddh2o ten 缓冲液10mm tris-hcl ph8.010mm edta150mm nacl sds-eb 溶液2 sds400mm nacl100mm tris-hcl ph8.040mm edta 2.5转基因莱茵哈德衣藻的 pcr 检测 根据 hil4 基因设计的引物 p35-aca ttt att tat act cga ggc cat ggg tct cac ctc cca act-3 和p4 5-ctg cag gtc gac tct aga gtt 上海交通大学硕士学位论文 第35页 cag ctc gaa cac ttt gaa tat t-3反应体系 20ulpcr 扩增条件为 95预变性 5min94变性 1min52退火 1min72延伸 45sec循环数 35 最后 72延伸 6minpcr 扩增完毕后经过 1.5琼脂糖凝胶电泳检测目标带 2.6莱茵哈德衣藻总蛋白的粗提 挑取莱茵哈德衣藻单藻落接种于 3ml tap 液体培养基22 300lux 生长 8-10 天 6000rpm 5min 离心收集细胞沉淀用 1ml 50mm tris-hcl(ph8.0)洗涤 细胞 2 次加入 150-200ul缓冲液50mm tris-hcl ph8.01mm edta100mm nacl1ul 100mm pmsf 和 1 dtt置-80冻融 3 次超声波破碎 10sec/ 次间歇 40sec共 10 次13000rpm 4离心 15 分钟收集上清即莱茵哈德衣藻 水溶性总蛋白粗提液 2.7sds-page凝胶的制备及电泳分析 按厂商的说明书安装玻璃板 按 1.4.1 表配制分离胶溶液依次混匀各成分加完 temed 后聚合反应就 立即开始因此迅速旋动混合物并进行下一步 将丙烯酰胺溶液灌至两块玻璃板的间隙中给积层胶留出足够空间(梳齿长 再加 1cm)在丙烯酰胺溶液上覆盖一层正丁醇防止氧扩散到凝胶中抑制聚合 作用将凝胶垂直放置于室温下 待分离胶聚合完全(30min)后倒掉覆盖层用去离子水清洗凝胶顶部数次 以去除残留的未聚合丙烯酰胺尽可能排去凝胶上的液体再用纸巾的边吸净 残留的水 按 1.4.1 表配制积层胶溶液依次混匀各成分加完 temed 后迅速旋动混 合物并进行下一步 将积层胶溶液直接灌至聚合好的分离胶上立即在其中插入一块干净的 teflon 梳子注意不要混入气泡使积层胶溶液彻底填满梳子之间的孔隙将 凝胶垂直放置于室温下 待积层胶聚合完全(30min)后小心移出 teflon 梳子用去离子水清洗加样 槽数次以去除残留的未聚合丙烯酰胺尽可能排去凝胶上的液体再用纸巾的边 吸净残留的水 将凝胶架放入电泳槽加入电泳缓冲液排除气泡 上海交通大学硕士学位论文 第36页 将莱茵哈德衣藻水溶性总蛋白粗提液加入 3 倍 sds 上样缓冲液取 15-20ul 于 100沸水 5min冷却至室温后上样于 15 sds-page 凝胶积层胶内的 电压为 80v分离胶内的电压为 110v 电泳 待电泳完毕后小心取出凝胶用考马斯亮蓝染色液染色 5-10 分钟并用脱 色液脱色 4 个小时观察结果 2.8western blotting分析 待 sds-page 凝胶电泳完毕后小心取出凝胶切下分离胶待转膜 用双蒸水浸润硝酸纤维素膜用双蒸水润湿半干转膜仪 在阳极缓冲溶液 a1 中浸泡 4 张滤纸尺寸规格略大于凝胶然后平铺在 阳极板上去气泡 在阳极缓冲溶液 a2 中浸泡 2 张滤纸尺寸规格略大于凝胶然后平铺在 前面的 4 张滤纸上去气泡 在滤纸上铺一层硝酸纤维素膜去气泡 将 sds-page 凝胶在阳极缓冲溶液 a2 中浸泡后平放在硝酸纤维素膜上 去气泡凝胶放上后不要再移动 在凝胶上平铺 6 张用阴极缓冲溶液 c 浸泡过的滤纸尺寸规格略大于凝 胶去气泡 盖上阴极板避免产生气泡具体操作见示意图fig 3-1 图 3-1转膜操作示意图 fig.3-1 sketch map of transfer to membrane 转膜 30 分钟后取出硝酸纤维素膜用含有 5脱脂奶的 tbs-t0.05 上海交通大学硕士学位论文 第37页 tween 20室温孵育 1-2 个小时 用 tbs-t 漂洗 15 分钟 3 次 将膜转入含有 1脱脂奶和人抗小鼠 anti-hil4 单克隆抗体 5ug/ml的 tbs-t 溶液室温反应 1-2小时 ?用 tbs-t漂洗 15 分钟 3 次 将膜转入含有 1脱脂奶和羊抗小鼠 igg-hrp1:7000的 tbs-t 溶液 室温反应 30分钟 ?用 tbs-t漂洗 15 分钟 2 次用 tbs 漂洗 5 分钟 2 次 按照 ecl 试剂盒说明书将膜与 ecl 试剂反应该试剂会与二抗的辣根 过氧化物酶作用发光 用 x 光片进行压片感光 显影定影清洗x 光片上显示有杂交信号带 结果与分析 3.1绘制莱茵哈德衣藻生长曲线 挑取莱茵哈德衣藻单藻落接种在 tap 液体培养基中于 22 300lux 光照 条件下振荡培养 6 天以 1接种量转接于 100ml tap 培养液体从接种之 日起每天按时取样测菌液 od750值绘制 c.reinhardtii 生长曲线图 3-2 图 3-2莱茵哈德衣藻生长曲线 fig.3-2 growth curve of c.reinhardtii 3.2野生型莱茵哈德衣藻对壮观霉素spc敏感性的检验 在 tap 固体培养基中培养 15 天后观察50ug/ml 平皿上有少量藻落出现 上海交通大学硕士学位论文 第38页 100ug/ml 平皿上均无藻落出现说明在 tap 固体培养基中 100ug/ml 壮观霉素 spc能够完全抑制莱茵哈德衣藻的生长这个致死剂量可以作为转化子的筛 选剂量 3.3电脉冲法共转化参数的优化 3.3.1 莱茵哈德衣藻细胞生长状况对转化效率的影响 取处于不同 od750值的莱茵哈德衣藻细胞进行转化结果表明当培养四 天时 od750值达到 1.4-1.6细胞生长状态旺盛细胞数量合适转化效率最高 生长时间小于 2 天细胞还处于生长延迟期细胞数量极少生长时间在 2-4 天时细胞刚刚进入对数生长期不足以提供足够的细胞数量进行转化生长 时间在 6 天以后细胞老化凋亡细胞增多转化效率显著降低结果未显示 3.3.2 莱茵哈德衣藻转化细胞浓度的计算 将电转化杯中的莱茵哈德衣藻菌液未经电击处理直接稀释成不同的浓度 梯度 10-310-410-510-6每个浓度梯度设置三个平行实验然后涂于固体培 养基 tap 平皿22?光照 300lux培养 7 天计算转化细胞数量实验结果显示 在稀释浓度为 10-4的 tap 平皿上莱茵哈德衣藻藻落生长数量合适分别可见莱 茵哈德衣藻藻落为 198 个207 个和 222 个平均数为 209 个按照每个三角 瓶 100ml 菌液被浓缩成 1ml每个电转化杯中含有 40ul 浓缩液计算莱茵哈德 衣藻转化细胞浓度为 106/ml 3.3.3 莱茵哈德衣藻电击后的复苏时间对其转化频率的影响 将莱茵哈德衣藻细胞用2.1kv/cm电场强度电击22复苏复苏时间分别 为0小时2小时8小时24小时如图3-3显示8个小时以内莱茵哈德衣藻 细胞随复苏时间延长活细胞数急剧下降8-24个小时内细胞数缓慢减少超过60 个小时的复苏时间存活细胞非常少不足以满足筛选转化子的数量条件 将不同复苏时间0小时2小时4小时8小时16小时24小时48小 时的莱茵哈德衣藻细胞涂于100ug/ml壮观霉素的tap平皿上观察转化子数量 如图3-4显示复苏4个小时得到的转化子数量最高复苏2-8个小时内转化子数 量明显高于其他复苏时间复苏时间小于2个小时或者大于48个小时转化子数量 极少 上海交通大学硕士学位论文 第39页 图3-3不同复苏时间的活菌率 fig. 3-3 histogram of alive cells remaining ()-incubation time 图3-4不同复苏时间的转化子数 fig.3-4 histogram of number of transformants-incubation time 复苏8小时的样品在含100ug/ml壮观霉素的tap平皿上长出约160个莱茵哈 德衣藻藻落复苏24小时的样品在同样的筛选平皿上长出约30-40个莱茵哈德衣 藻藻落进一步进行pcr检测hil4基因pcr检测hil4基因是否共存于壮观霉 素抗性转化子中即共转化结果表明复苏时间8小时和24小时产生的共转化 子数量明显不同(4-5倍)但是共转化效率没有明显差异均为90以上 上海交通大学硕士学位论文 第40页 3.3.4抗生素浓度对筛选共转化子的影响 不同壮观霉素浓度对筛选共转化子也有很大的差异在含50ug/ml壮观霉素 的tap平皿上筛选的共转化效率为20-30而在含100ug/ml壮观霉素的tap平 皿上筛选的共转化效率为90以上这些数据表明在含100ug/ml壮观霉素的 tap平皿上筛选虽然转化子数量少但是共转化效率非常高能够更方便更 快捷的得到共转化子 3.4共转化子的 pcr 筛选结果 按照方法 2.2 进行电脉冲共转化从含 100ug/ml 壮观霉素的 tap 平皿上挑 取莱茵哈德衣藻单藻落接种于同样的平皿培养 8 天 提取莱茵哈德衣藻总 dna 进行 pcr 扩增检验 hil4 基因莱茵哈德衣藻总 dna 溶于 20ul ddh2o取 5ul 作为 pcr 模板用 p3/p4 引物 pcr 扩增目标基因 hil4循环数为 35如图 3-5 显示90的莱茵哈德衣藻转化藻株都能扩增得到明显的目标带 图 3-5共转化子 pcr 产物分析 fig.3-5 pcr analysis of random co-transformants. a: pcr products were generated from random co-transformants total genomic dna using a primer pair specific for the hil4-coding region(0.5kb). wt indicates total dna isolated from wild type c.reinhardtii strain and hil4 indicates template dna from plasmid pxhil4. b: total dnas were isolated from individual co-transformants. 上海交通大学硕士学位论文 第41页 3.5利用抗性筛选促进同质化程度 采用在 100ug/ml 壮观霉素的 tap 固体培养基多次传代的方法以期达到 同质化水平fig3-6从转化后的 spc100ug/ml 平皿上挑取可见的单藻落接种 于新的含有 100ug/ml壮观霉素的 tap 固体培养基上生长约 7-10 天记为第 一代再将其接种到另一个新的含有 100ug/ml 壮观霉素的 tap 固体培养基 上记为第二代以此类推 图 3-6在含 100ug/ml 壮观霉素的 tap 平皿上连续传代培养结果 fig. 3-6 conclusion of each generation of co-transformants grows on tap-medium containing 100ug/ml spectinomycin. 1: generation 1, 2: generation 2, 3: generation 3, 4: generation 5, 5 and 6: generation 7. 3.6pcr 分析同质化程度的结果 将同一莱茵哈德衣藻转化藻株的第一代第三代第四代第七代细胞提 取总 dna溶于 30ul ddh2o取 2ul 作为 pcr 模板用 p3/p4 引物 pcr 扩增 目标基因 hil4循环数为 35fig 3-7pcr结果显示第一代莱茵哈德衣藻 转化藻株fig3-7, lane 2在这个条件的 pcr扩增时还无法看见明显的特征带 第三代莱茵哈德衣藻转化藻株fig3-7, lane 3在这个条件的 pcr 扩增时已经 可以看见比较微弱的特征带略大于 400bp第四代莱茵哈德衣藻转化藻株 fig3-7, lane 4在这个条件的 pcr 扩增后电泳显示的特征较第三代莱茵哈德 衣藻转化藻株电泳结果明亮 但是第三代 第四代莱茵哈德衣藻转化藻株在 pcr 过程中有明显的略大于700bp的杂带 第七代莱茵哈德衣藻转化藻株 fig3-7, lane 上海交通大学硕士学位论文 第42页 5在这个条件的 pcr扩增后电泳显示出非常清晰的特征带略大于 400bp并 且没有杂带干扰实验结果表明抗生素筛选代数越多的细胞相同条件下 pcr 扩增得到的目标带越亮即在壮观霉素100ug/ml选择压力下传代促进了 同质化程度 图 3-7 pcr 检测同质化程度 fig3-7 detection of the level of homogeneity by pcr amplification lane 1dna markerlane 2generation 1 of transformantlane 3generation 3 of transformantlane 4generation 4 of transformantlane 5generation 7 of transformant (arrow points hil4 gene lines). 3.7sds-page凝胶电泳及 western blotting 分析结果 分别从野生型莱茵哈德衣藻和在含有 100ug/ml 的 tap 平皿上筛选 5 次的 莱茵哈德衣藻共转化子中制备总蛋白材料和方法 1.715sds-page 电泳 结果见图 3-8a通过用人白细胞介素 4 单克隆抗体做 western 检测显示出两 条明显的杂交带一条约 15kd另一条约 24kd图 3-8b我们推测形成 两条蛋白带的原因与人白细胞介素 4 糖基化有关hil4 的蛋白分子由 129 个氨 基酸残基组成 理论计算蛋白质大小约为 15kd 含有 2 个糖基化位点 magnuson 等人 1998 年报道由于 hil4 糖基化使其在烟草里表达出两种大小不一样的蛋 400bp 上海交通大学硕士学位论文 第43页 白质分别为 18kd 和 20kd62elena bulanova 等人也研究了 il15r 的糖基 化问题 63 图 3-8hil4 在 c.reinhardtii 叶绿体中表达产物的 sds-page(a) 和 western blotting(b)的分析 fig.3-8 sds-page (a) and western blotting (b) analysis of the hil4 expressed products in c.reinhardtii chloroplast am: protein molecular weight marker, lane1: total soluble proteins were extracted from wild-type c.reinhardtii strain and from generation 7 transgenic c.reinhardtii strain(lane 2). bhil4 protein exprossion in c. reinhardtii chloroplast was detected by immunoblotting with the anti-hil4 antigen. lane1: wild-type c.reinhardtii strain, lane2: transgenic c.reinhardtii strain (arrows point expression products) 本章小结 本章介绍了莱茵哈德衣藻叶绿体的电脉冲转化方法利用携带 aada 壮观 霉素抗性基因的质粒 p228 和同源重组交换质粒 pxhil4 共同转化莱茵哈德衣 藻优化了电脉冲转化方法的电场强度温度复苏时间抗性筛选浓度等参 数实验结果表明在含有 100ug/ml 壮观霉素的 tap 培养基平皿上其共转 化效率达到 90%并且经过 7 次含有 100ug/ml 壮观霉素的 tap 培养基连续培 养后能够通过 western blotting 方法检测到外源基因 hil4 在莱茵哈德衣藻中的 表达 上海交通大学硕士学位论文 第44页 第四章总结与讨论 本文利用莱茵哈德衣藻叶绿体基因组 rbcl 5-utr 和 3-utr 序列和人白细 胞介素 4 基因构建融合表达单元研究了莱茵哈德衣藻的生长条件生理特性 以及电脉冲转化中所需的化学物理参数及其与转化效率的相关性并进行转 化子筛选与检测初步探讨了外源基因在莱茵哈德衣藻叶绿体中同质化进程 建立了一种简单方便高效的莱茵哈德衣藻叶绿体转化方法 莱茵哈德衣藻叶绿体同源重组载体载体 p322-btm 是针对 bamhi酶切位点 设计的要求待插入的外源基因或者外源 dna 片段没有 bamhi酶切位点否 则在构建的过程中外源基因或者外源 dna 片段将被破坏并且载体的构建过 程需要经过多次酶切酶连不仅操作复杂而且增加了对酶切位点的限制性 也就是说这种载体的通用性比较低daniell 等 70 构建了高等植物叶绿体遗传 转化通用载体并且认为这种载体可用于多种植物的转化目前可以将载体 p322-btm 的 bamhi酶切位点附近增加一些酶切位点这样就提高了外源基因 或者外源 dna片段的可供选择性避免了重新操作这些构建步骤的麻烦 目前关于叶绿体转化最普遍使用的方法是基因枪法这是因为一些高等植 物如禾谷类作物烟草马铃薯等不适合用 peg 转化法电击法显微注射法 等另一方面基因枪法能够在很多细胞组织上广泛使用如根茎叶胚 等操作简便快速效率高但是基因枪价格昂贵转化效率不高轰击过 程中可能造成外源基因的断裂使插入的基因成为没有活性的片段出现非转 化体或嵌合体的可能性较高等本研究针对电场强度复苏时间抗生素筛选 浓度等参数优化了电脉冲转化方法并利用这种方法成功的将外源基因 hil4 整 合到莱茵哈德衣藻叶绿体探索莱茵哈德衣藻的电脉冲转化方法将为正在兴 起的藻类基因工程奠定基础电转化仪是生化实验室最常用的仪器之一一般 被用来操作大肠杆菌酵母等转化莱茵哈德衣藻素有绿色酵母之称它 们具有很多相似性这为我们研究电脉冲转化方法提供了思路 本研究将莱茵哈德衣藻叶绿体同源重组交换质粒 pxhil4 和携带壮观霉素 上海交通大学硕士学位论文 第45页 抗性基因的质粒