（微生物学专业论文）酒窖底泥中丁酸梭菌的分离及特性研究.pdf

华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 摘要 丁酸梭菌即酪酸梭菌，是存在于人和畜禽肠道的一种厌氧有益菌。它能形成内 生芽孢，具有耐高温、耐酸、耐胆酸盐、耐部分抗生素等特性，作为饲料添加剂和 兽药，与非芽孢类活菌制剂相比优势显著。 本研究从酒窖底泥中筛选到一株具有优良益生特性的丁酸梭菌b 1 ，研究了其生 长特性、应用特性和发酵生产工艺，断奶仔猪饲喂实验验证了其防病促长效果。具 体研究结果如下： ( 1 ) 通过厌氧培养法从酒窖底泥中分离得到1 4 个菌株，生理生化实验和1 6 s r d n a 序列分析鉴定出两株丁酸梭菌。选取丁酸梭菌菌株b 1 研究了其生 长特性和安全性，体外研究表明其具有较强的耐酸、耐胆汁和耐抗生素 能力，并能显著抑制常见肠道致病菌的生长，具有作为饲用微生态制剂 应用的潜力。 ( 2 ) 对丁酸梭菌的培养条件进行了优化，得到优化后的丁酸梭菌发酵培养基 为：葡萄糖2 ( w v ) ，大豆饼粉4 5 ( w v ) ，硫酸铵0 1 ( w v ) ，n a h c 0 3 o 1 2 4 ( w v ) ，玉米粉0 7 ( w v ) ，m n s 0 4 h 2 00 0 2 ( w v ) ，m g s 0 4 7 h 2 c o 0 2 ( w v ) ，c a c l 2 0 0 0 2 ( w v ) ，初始p h 为7 5 。 ( 3 ) 在优化培养基的基础上进一步研究了发酵工艺对发酵菌数的影响，发现 接种量为5 ，初始p h 为7 0 、培养时间为4 8h 及加热菌种有利于提高 发酵菌数，按此方法发酵菌液菌数可达4 o x x 0 8c f u m l 。而通过控制p h 值恒定在p h 6 5 ，发酵菌数可达2 0 x 1 0 9c f u m l ，说明丁酸梭菌生长絮 殖受自身产酸抑制严重。 ( 4 ) 对丁酸梭菌的干燥工艺进行了摸索。发现喷雾干燥法干燥时菌体死亡率 过高，而用烘箱在低于5 5 低温烘干时可以保持较高的菌体存活率。 ( 5 ) 进行仔猪饲喂试验，初步验证了其防病促长效果。 关键词：丁酸梭菌；分离鉴定；抑茵试验；培养优化；益生菌 酒窖底泥中丁酸梭菌的分离及特性研究 a b s t f a c t c l o s t r i d i u mb u t y r i c u mi so n et y p eo fa n a e r o b i cp r o b i o t i c sw h i c hi se x i s ti ni n t e s t i n a l f l o r ao fh a m a na n dl i v e s t o c k i tc a l lf o r m a t i o ne n d s p o r e ，a n dh a v es t r o n ga b i l i t yt or e s i s t h i g ht e m p e r a t u r e s ，l o wp h ，b i l ec o n c e n t r a t i o n sa n ds o m ea n t i b i o t i c s i t sa p p l i c a t i o ni n f e e d sa n dv e t e r i n a r yd r u gh a sav e r yv a s tp r o s p e c tc o m p a r e dt on o n - s p o r ef o r m a t i o n p r o b i o t i c s i nt h i ss t u d y , w ei s o l a t e dag o o dc l o s t r i d i u mb u t y r i o e ns t r a i nf r o mp i t ss l u d g e t h e g r o w t hc h a r a c t e r i s t i c s ，a p p l i c a t i o nc h a r a c t e r i s t i c sa n dp r o d u c t sp r o c e s so ff e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sw e r es t u d i e d t h e nat r i a lf o rf e e d i n gw e a n l i n gp i 簪v a l i d a t e dt h ee f f e c to f d i s e a s ep r e v e n t i o na n dg r o w t hp r o m o t i n g t h er e s u l tw e r es h o w e da sb e l o w ： ( 1 ) 1 4s t r a i n sw e r ci s o l a t e df r o mp i t ss l u d g eb ya n a e r o b i cc u l t i v a t i o n , t w o c l o s t r i d i u mb u t y r i c u ms t r a i n sw e r ei d e n t i f i e d b yp h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a l e x p e r i m e n t sa n dt h es e q u e n c ea n a l y s i so f1 6 sr d n a t h ep h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s a n ds e c u r i t yo fc l o s t r i d i u mb u t y r i c u mb 1w a ss t u d i e d , i nv i t r or e s e a r c hi n d i c a t e di tw a s t o l e r a n ta g a i n s tl o wp h , b i l ec o n c e n t r a t i o na n da n t i b i o t i c sa n dh a sa n t a g o n i s me f f e c t s a g a i n s tp a t h o g e n s ( 2 ) t h ec u l t i v a t i o nm e d i u mc o m p o s i t i o n sw c l - eo p t i m i z e d t h e s ee x p e r i m e n t a l r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nm e d i u mf o ri n c u b a t i n gcb u t y r i c u mw a s c o m p o s e do f 2 ( w v ) g l u c o s e 4 5 ( w v ) s o y b e a nc a k ee x t r a c t ，0 1 ( w v ) ( m 1 4 h s 0 4 ， o l 2 4 ( w v ) n a h c 0 3 ，0 7 ( w v ) c o r nf l o u r , 0 0 2 ( w 聊m n s 0 4 h 2 0 ，o 0 2 ( w v ) m g s 0 4 。7 i - 1 2 0a n d0 0 0 2 ( w v ) c a c l 2a tp h 7 5 ( 3 ) t h ef o r m e n t a f i o nt e c h n o l o g yw e r ea l s oo p t i m i z e da f t e rt h ec u l t i v a t i o nm e d i u m t h e s ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tic o u l di n c r e a s et h ec e l ln u m b e rt o4 0 x l o s c f u m lw h e nt h ei n o c u l a mc o n c e n t r a t i o nw a s5 ，t h eo r i g i n a t ep hw a s7 0 ，t h e i n c u b a t i o nt i m ew a s4 8ha n da c t i v a t i n gs e e db yh e a t m e a nw h i l e ，t h ea m o r m to fc b u t y r i c u mw a s2 0 x 1 0 c f u m lw i t hp hc o n t r o l l i n g ；w h i c hm e a n st h ea c i dp r o d u c e db y c b u t y r i c u mi n h i b i t et h eg r o w t ha n dp r o l i f e r a t i o no fi t s e l f ( 4 ) w ea l s oo p t i m i z e dt h ed r y i n gt e c h n o l o g y , a n df o u n dt h a tt h es u r v i v a lr a t ew a s v e r ys m a l lw i t hd r y i n gb ys p r a y o nt h eo t h e rh a n d i tc o u l db eb e t t e rw h e nm i x e dw i t h w h e a tb r a na n dd r y i n gb e l o w5 5 b y d r y i n go v c n ( 5 ) a t r i a l f o r f e e d i n g w e a n l i n g p i g s v a l i d a t e d t h e e f f e c t o f d i s e a s e p r e v e n t i o n a n d g r o w t hp r o m o t i n g k e yw o r d s ：c l o s t r i d i u mb u t y r i c u m ；i s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o n ；i n h i b i t i o nt e s t ；f e r m e n t o p t i m i z e ；p r o b i o t i c s 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 否 如需保密，解密时间年 月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究7 - - 作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：肆柯责时间：力叩年 月口日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文。本人同意华中农业大学可以用- t 同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 黼鲐蹲蚵责删名：名羔髟 签名目期： 川年月归日 签名日期办哆年易月。日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 前言 1 1 研究背景 抗生素是一种低分子量的，在生物生命活动过程中产生的次生代谢产物或人工 衍生物，在很低浓度时( 一般是指低于ig l ) 能抑制或杀死其他微生物的生长( 李 梅，1 9 9 5 ) 。抗生素的大规模使用始于2 0 世纪4 0 年代，半个多世纪以来，它不仅拯救 了数以亿计的人的生命，而且对畜牧养殖业的发展起到了积极的推动作用。 但随着抗生素在饲料添加剂中的广泛使用，它的弊端正日益凸现，如导致动物 胃肠道菌群失调，产生耐药性和药物残留等，引发了一系列公共安全，环境保护和 畜禽产品质量方面的问题。鉴于此，反对在饲料中添加抗生素的呼声越来越高。瑞 典和瑞士分别于1 9 8 6 和1 9 9 9 年全面禁止在饲料中使用抗生素；日本等也对饲用抗生 素的种类、使用方法、剂量和配伍等作了严格限制；欧盟也己于2 0 0 6 年将此前允许 在饲料中使用的最后4 种抗生素( 莫能霉素、盐霉素、阿维霉素、黄霉素) 予以禁用， 意味着欧盟将全面禁止在饲料中投放任何抗生素( p e r r e t e n , 2 0 0 3 ) 。同时，一些国家 还把抗生素在动物产品中的残留作为产品的进出口贸易壁垒( 赵海林，2 0 0 5 ) 。在这 种情况下，寻求一种无毒、无残留、应用效果好的饲料添加剂显得尤为必要，益生 菌的研究开发便随之引起各国的重视。 1 2 猪消化道微生态菌群 动物胚胎是无菌的，仔猪刚出生时，新生动物通过母体产道获得母体的微生物， 这些微生物具有动物种属特异性。分娩到体外环境的几个小时内，就发生微生物在 胃肠道的定植、演替过程，形成一个庞大的微生物群落，动物胃肠道黏膜、隐窝和 绒毛上皮等部位都存在微生物。这些微生物与其宿主在长期进化中，形成了相互依 赖，相互制约的统一的整体( j e n s e n , 1 9 9 7 ) 。在人和动物的肠道中，有3 0 0 5 0 0 种 微生物，活菌数量可达1 0 1 4 亿，占动物体重的1 6 0 1 5 0 ，其中专性厌氧菌达9 7 9 9 ( 郭兴华，2 0 0 2 ) 。 1 2 1 微生态菌群平衡 定植于胃肠道的菌群按照对宿主的作用可分为三类：共生菌为专性厌氧菌， 是肠道的优势菌群，这些菌对宿主是有利无害的。条件致病菌在正常情况下，胃 肠道微生态处于平衡状态，这些细菌数量少，不会致病，而且是维持微生态群落种 群平衡的必要组成部分，但在病理情况下，数量异常增多，可能致病。病原菌大 多为外籍菌群，生态平衡时这类菌数量很少，不会致病，但是一旦数量超出正常水 平，就会引起发病( 郭兴华，2 0 0 2 ) 。 酒窖底泥中丁酸梭菌的分离及特性研究 动物正常的胃肠道固有微生物菌群是相当稳定的，可以通过宿主和自身的调节 机制达到平衡状态。肠道菌群主要通过以下几个方面达到平衡：1 ) 宿主因素：在 胃酸作用下大部分细菌被杀死。肠道蠕动使得大部分细菌排出体外。肠道分泌 物如胆酸、溶菌酶等可抑制细菌生长。2 ) 微生物因素：好氧菌和兼性厌氧菌生长 过程中利用氧，有利于厌氧菌的生长繁殖。许多细菌产生细菌素、过氧化氢等物 质抑制其他菌的生长繁殖。一些细菌产生有机酸，降低肠道p h 值，对其他菌的 生长产生抑制。双歧杆菌等占据肠上皮细胞粘附位点，抑制过路菌的定植。不 同菌群对营养物质的争夺也限制了微生物的过渡增殖f 郝生宏，2 0 0 4 ) 。 1 2 2 正常微生态菌群的作用 正常微生态菌群对宿主的生长发育、消化吸收、营养转化等起着极为重要的作 用，主要表现在以下几个方面：1 ) 营养正常微生态菌群通过对碳水化合物、蛋白 质和脂肪的分解，产生宿主必需的维生素和消化酶，参与宿主对营养物质的消化分 解和吸收。2 ) 免疫正常微生态菌群能提高动物免疫力。p e r d i g o n 等报道，小鼠口 服干酪乳杆菌可激活肠相关淋巴细胞组织中的淋巴细胞，从而显著提高肠腔中分泌 型i g a 的浓度( p e r d i g o ne ta 1 ，1 9 8 6 ) 。3 ) 生物拮抗正常微生物还可以通过生物屏 障，产生细菌素、过氧化氢和短链脂肪酸等化学屏障，争夺营养物质等生物拮抗作 用，抵抗致病菌的入侵，保护宿主。孟庆翔等归纳了畜禽肠道菌群对动物肠道和健 康的主要影响，见图1 ( 孟庆翔等，2 0 0 1 ) 。 图1 1 畜禽肠道正常菌群对于肠道和健康的主要影响( 梦庆翔，2 0 0 1 ) f i g 1 1t h em a i ne f f e c t so fn o r m a li n t e s t i n a lf l o r ao nt h eh e a l t ho f l i v e s t o c ka n d p o u l t r y ( m e n g ，2 0 0 1 ) 2 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 2 3 消化道微生态菌群失调 菌群失调是指肠道正常菌群的种类、数量和比例发生异常变化、偏离正常的生 理组合，转变为病理性组合的状态。生态平衡和生态失调是可以相互转化的，转化 的条件来自微生物、宿主与环境三个方面。幼畜消化道内的微生物菌群会受到许多 因素丽不断发生变化，如断奶、日粮和环境变化、冷热刺激、药物治疗、抗生素治 疗、拥挤、饥饿、营养不良等，可引起微生物菌群失去原有的平衡，引起宿主发病 ( 康白等，1 9 7 5 ) 。如仔猪和犊牛断奶时由母乳转向采食固体饲料容易引起腹泻。 1 2 4 猪消化道微生态菌群的调控 目前，对病原微生物引起的腹泻主要用抗生素、化学药物来治疗。但随着抗生 素的广泛使用，其弊端也日益明显，如引起内源感染和二重感染、耐药菌的产生、机 体免疫力下降以及药物的残留等，使抗生素的应用受到限制。人们为寻找一种能克 服抗生素种种弊端，无毒、无残留、无耐药性的替代品，研制开发了益生菌、益生 元、酸化剂、酶制剂、中草药制剂等。其中，益生菌作为一种新型的饲料添加剂， 能促进动物胃肠道正常微生物区系的建立，保持和恢复肠绒毛的正常结构，增强畜 禽免疫力，减少疾病的发生，促进生长，提高畜禽日增重，改善畜禽产品质量，具 有显著的经济效益和社会效益。 1 3 抗生素的作用及安全性问题 1 3 1 饲用抗生素在动物生产中的作用 抗生素作为饲料添加剂在养殖业的应用已有6 0 多年的历史，它通过抑制病原微 生物的增值，减少其代谢毒素对动物机体的毒害作用，对预防动物疾病，提高养殖 业的产量和质量起到了积极的作用。调查表明，抗生素在养殖业上的应用可使每年 肉鸡产量提高3 2 ，蛋产量提高1 5 ，猪肉产量提高4 ，牛肉产量提高4 ( 朱 蓓蕾，1 9 9 4 ) 。抗生素在动物生产中的作用主要表现在：1 ) 促进动物生长和改善饲 料报酬。抗生素可促进动物生长和改善饲料报酬，降低腹泻，且对幼年动物的改善 作用尤为明显( t a n n o c k e t a l , 1 9 9 9 ) 。改善酮体组成。抗生素不但可以提高猪的生 产性能，而且可提高其瘦肉率，增大猪肌细胞，增强肌肉蛋白质生物合成能力 ( s c h e u e r m a n n ，1 9 9 3 ) 。3 1 改善繁殖性能，减少死亡率。抗生素可增加母猪受胎率， 提高窝产仔数，并能减少仔猪死亡率。 1 3 。2 饲用抗生素应用过程中存在的问题 随着抗生素的大量使用，它的负面效应也日益突出，直接影响人类的生活质量。 3 酒窖底泥中丁酸梭菌的分离及特性研究 主要表现在： 1 ) 耐药菌株的产生细菌的耐药性是由于细菌自发突变和环境定向选择的结果。 微生物自发突变率虽然只有1 0 - s 1 0 - - 9 ( 周德庆，1 9 9 3 ) ，但是在含药的胃肠环境中， 只有耐药菌才能生存；同时，随着耐药因子r 质粒在种内和种间的传播，整个病原菌 群逐渐向抗药性方向转变。病原菌的耐药性使抗生素的治疗效果降低甚至失效，从而 延误病情，给养殖业带来了一定的经济损失，对病人的生命也是一个巨大的危害。 2 ) 药物残留饲料中部分抗生素添加剂经动物肠道吸收后在机体组织中沉积， 残留在畜禽产品内，通过食物链传递给其他动物或人类，在体内产生一系列的毒副 作用。而一些性质稳定的抗生素在被排泄到环境中后仍能稳定存在一段时间，从而 造成环境中的药物残留，对生态平衡造成影响。毒理学试验表明，许多抗生素都有 致癌、致畸和致突变作用。 3 ) 破坏菌群平衡在动物的体表和体内充满了各种各样的微生物，正常情况下 宿主体内各微生物菌群间相互促进和制约，维持个体微生态系统的动态平衡。抗生 素的使用不仅抑制或杀灭了病原微生物，同时也影响了体内有益菌的定植、生长和 繁殖，破坏了微生态平衡，造成各种消化系统疾病，还容易引起二次感染( 康白， 1 9 9 6 ) 。 4 ) 降低免疫力大量抗生素被摄入机体后，会随血液循环分布到淋巴结、肾、 肝等组织器官，逐渐削弱动物机体的免疫力。抗生素能抑制免疫系统的发育，减少 免疫系统的活动，降低了动物的免疫应激性。抗生素还会导致抗原质量下降，直接 影响免疫过程，从而对疫苗的预防接种产生不良影响。 1 4 益生菌研究进展 1 4 1 益生菌概述 微生态制剂( m i c r o b i a le c o l o g i c a la g e n t s ) 是在微生态学理论指导下，用来纠正 微生物生态系统平衡，提高宿主健康状态的益生菌，或其代谢产物和促进生长的物 质制品。包括益生菌( p r o b i o t i c s ) 、益生元( p r e b i o t i c s ) 和合生元( s y n b i o t i c s ) 三 大类，目前应用最多的是益生菌。还有资料显示微生态制剂即益生菌。 益生菌一词最早由l i l l e y 和s t i l l w e l l 于1 9 6 5 年提出，定义为一种微生物分泌的 能够促进另一种微生物生长的物质。1 9 7 4 年p a r k e r 将益生菌定义为“有助于肠道微 生物保持平衡的微生物或相关物质”。1 9 8 9 年f u l l e r 又将此定义修改为“能够促进肠 道内微生物平衡，对宿主产生有益作用的活得微生物制剂”。后来学者h a v e n a a r ( 1 9 9 2 ) ，g u a m e r ( 1 9 9 8 ) 等相继给出了益生菌的进一步定义。关于益生菌的精确 定义，虽然众说纷纭，但都包含了以下两个基本性质：一是益生菌是活的微生物： 二是通过摄入充足的数量，对宿主产生功能性健康益处( f u l l e r , e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 4 华中农业大学2 1 1 0 7 届硕士学位论文 1 - 4 2 益生菌筛选标准 目前来说，用于益生菌的菌株主要有以下两种来源：1 ) 从健康动物体内分离； 2 ) 从动物体外其他途径获得( 如从土壤、青贮饲料中分离等) 。随着益生菌研究的 深入，其评估标准也逐渐建立起来，主要基于安全性、有效性和生产性能三方面考 虑。1 ) 安全性：组成微生态制剂的微生物首先都经过了菌株的鉴定，明确了其属、 种、株；分离肠道来源的益生菌最好从本种动物体内分离；菌株必须不产生任 何内外毒素，即无毒、无致病性、无副作用；明确菌株的抗生素耐药谱，不能携 带可转移的抗生素抗性基因。2 ) 有效性；菌株能耐受消化道内的环境，耐受胃酸 和胆盐；菌株应具有较好的粘附性能，能在动物消化道表面定植；菌株具有增 强动物免疫力，提高动物抗病力，促进生长的功能；菌株应具有产生有益代谢产 物的功能，如维生素、各种消化酶、有机酸、细菌素等；菌株要有利于促进动物 体内正常菌群平衡或预防菌群失调。3 ) 生产性能：菌株应易于培养，对各种工艺 条件的耐受能力较强；菌株应在产品保藏和使用的过程中保持稳定的存活状态。 并非每一种益生菌都必须具备以上特征，但用于益生菌制剂时，应尽可能选择满足 上述特点的微生物菌株( 刘燕，2 0 0 6 ) 。 1 4 3 益生菌菌株及种类 1 4 1 1 益生菌菌株 益生菌菌种的安全性问题一直是研究、生产和使用益生菌最关注的问题。1 9 8 9 年美国食品及药品管理局公布了可以用作饲料添加剂的4 2 种微生物( 见表1 ) 。 表1 1 a a f c o 认为安全的微生物菌种 t a b l e1 1m i c r o - o r g a n i s m sg e n e r a l l yr e c o g n i z e da ss a f eb ya a f c o 菌种名( 拉丁文名)菌种名( 拉丁文名) 黑曲霉( d 俨嚼池l n i g e r ) 米曲霉( d 驴d 谢池，o r y z a e ) 凝结芽孢杆菌( b a c i l l u sc o a g u l a n s ) 缓慢芽孢杆菌( b a c i l l u sl e n t u s ) 地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n 跏丌，l 妇) 短小芽孢杆菌( b a c i l l u sp u m i l u s ) 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) 嗜淀粉拟杆菌( b a c t e r o i d e sa m y l o p h i l u s ) 多毛拟杆菌( b a c t e r o i d e sc a p i l l o s u s ) 纤维二塘乳杆菌( 1 a c t o b a c i l l u sc e l l o b l o s u s ) 弯曲乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s c u r v a m s ) 戴耳布吕克氏乳酸杆菌( l a c t o b a c i l l u s d e l b r u e k i i ) 发酵乳酸杆菌( l a c t o b a c i l l u s f e r m e n 地, n ) 瑞士乳酸杆菌( l a c t o b a c i l l u sh e l b e t i c u s ) 乳酸乳酸杆菌( l a c t o b a c i l l u sl a c t i s ) 胚芽乳酸杆菌( l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r w n ) 罗氏乳酸杆菌( l a c t o b a c i l l u sr e u t e r i i ) 肠系膜明串珠菌( l e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e s ) 5 酒窖底泥中丁酸梭菌的分离及特性研究 栖瘤胃拟杆菌( b a c t e r o i d e s 肿柚自d k ) 产琥珀拟杆菌c b a c t e r o i d e ss u c c i n o g e n e s ) 青春双歧杆菌g i f u t o b a c t e r i u ma d o l e s c e n t l s ) 动物双歧杆菌( b i f u t o b a c t e r i u ma n i m a l i s ) 婴儿双歧杆菌( b i f u l o b a c t e r i n mi n f a n t i s ) 长双歧杆菌( b i f u t o b a c t e r i u m 砌珥) 嗜热双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u m t h e r m o p h i l u m ) 短双歧杆菌( b i f u t o b a c t e r i u mb r e v i s ) 保加乖j 亚乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u ) 嗜酸乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ) 干酪乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sc a s e d 两叉双歧杆菌( b i f l d o b a c t e r i u mb i f i d i u m ) 乳酸小球菌( p e d i o c o c c u sa c i d i l a c t i c i i ) 啤酒小球菌( p e d i o c o c c u sc e r e v i s i a e ) 戊糖片球菌( p e d i o c o c c u s p e n t o s a c e u s ) 弗氏丙酸杆菌( p r o p i o n i b a c t e r i u m f r e u d e n r e l c h i i ) 谢氏丙酸杆菌( p r o f w n i b a c t e r i u ms h e r m a n i i ) 酿酒窖母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s e a e ) 乳酸链球菌( e n t e r o c o c c u sc r e m o r i b ) 二乙酰乳酸链球菌( e n t e r a c o c c u sa z a c e t y t a c a s ) 粪肠球菌( 慨c u s f a e c u m ) 中链肠球菌( e n t e r o c o c c u si n t e r m e d i u s ) 乳酸肠球菌( e n t e r o c a c c u sl a c 出) 嗜热肠球菌( e n t e r o c o c c u st h e r o m o p h i l u s ) 我国对微生物用于饲料添加剂的安全性问题也越来越重视，农业部2 0 0 3 年公布 了可在饲料中添加的1 5 种微生物( 见表2 ) 。 表1 22 0 0 3 年中华人民共和国允许使用的安全微生物 t a b l e1 2s a f em l c r o - o r g a n i s m sa p p r o v e db ym o p p 1 lc h i n ai n2 0 0 3 资料来源：饲料标签标准实施指南( 2 0 0 4 ) 1 4 1 1 益生菌分类 根据益生菌的菌种类型不同，把益生菌分为乳酸菌类、芽孢杆菌类、双歧杆菌 类、酵母菌类为主的几个大类。 ( 1 ) 乳酸菌类乳酸菌是一类能从可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的总 称，为肠道中的正常微生物。乳酸菌具有较强的耐酸性，能够产生细菌素，但在生 长过程中不形成芽孢，抗逆性较差，6 5 7 5 条件下死亡，因而在饲料制粒及制剂 6 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 储藏过程中，容易失活。微胶囊化可以解决这一问题，但是会增加成本，在应用过 程中受到一定的限制。用于动物益生菌的乳酸菌主要有：干酪乳杆菌、植物乳杆菌、 粪链球菌、屎链球菌、乳酸片球菌、嗜酸乳杆菌、乳链球菌等。 ( 2 ) 芽孢杆菌类一些芽孢杆菌是从动物体外分离、鉴定的有益芽孢杆菌，为 肠道过路菌，不能定植于肠道中。除现已广泛用于人体整肠药物和动物益生菌的丁 馥梭菌为厌氧菌外，其他益生芽孢杆菌多为好氧菌或兼性厌氧菌，它们能产生内生 芽孢，抗逆性强，能耐酸碱和高温高压，在饲料加工和储存过程中不易失活；而且 对培养物质营养要求不高，生产加工工艺容易掌握，与其他菌种相比，具有独特的 优势。目前报道较多的芽孢杆菌菌种有：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、腊样芽孢 杆菌、东洋芽孢杆菌和丁酸梭状芽孢杆菌等。 ( 3 ) 双歧杆菌类双歧杆菌是人体正常优势菌群，目前应用较多的有两叉双歧 杆菌、长双歧杆菌、短双歧秆菌、婴儿双歧杆菌、假双歧杆菌。和乳酸菌相比，双 歧杆菌对营养成分的要求严格，培养基中必须含有生长素或酵母膏才能生长；而且 对厌氧条件要求严格，在低p h 值环境中存活时间短。 ( 4 ) 酵母菌酵母菌中含有丰富的蛋白质、b 族维生素、消化酶、矿物质等多 种营养成分和某些协同因子，具有增强动物免疫力，增加饲料适口性，促进动物对 饲料的消化吸收等功能。目前农业部允许用于益生菌的酵母有：酿酒窖母、啤酒窖 母、产朊假丝酵母等。 其他用于动物益生菌的微生物还有光合细菌、霉菌、放线菌、拟杆菌、优杆菌 和蛭弧菌等。 1 4 4 益生菌的应用效果 益生菌制剂在畜牧生产中的效果主要表现在以下几个方面：1 ) 有些益生菌菌株 具有显著的促进生长的作用，并能增强畜禽免疫力。2 ) 益生菌可以提高动物消化吸 收能力，降低料肉比，增加经济效益。3 ) 益生茵能显著减轻动物粪尿恶臭，降低氨 浓度，减少蚊蝇等虫害，改善饲养环境，有利于动物身体健康。 k o m e g a y 等证实嗜酸乳杆菌能增加断奶仔猪和生长肥育猪日增重和提高饲料转 化率( k o m e g a y ，1 9 8 6 ) 。张国龙等用腊样芽孢杆菌饲喂断奶仔猪发现其生长效果差 异较大，但能抑制仔猪肠道后段大肠杆菌的增殖，显著提高超氧化物岐化酶水品( 张 国龙，1 9 9 3 ) 。任延生等( 1 9 9 6 ) 报道，益生菌对仔猪黄白痢预防保护率达8 5 1 6 。 聂实践等( 1 9 9 9 ) 应用益菌多添加到仔猪日粮中，仔猪腹泻发病头次减少2 2 9 ， 腹泻时间缩短3 5 天。陈理盾等( 1 9 9 9 ) 发现妊娠后期母猪饲料中添加益生菌能降 低仔猪黄白痢发生率。黄俊等( 2 0 0 3 ) 根据微生态理论，筛选出3 株乳酸菌、2 株 芽孢菌、2 株酵母菌、1 株光合菌、1 株酪酸菌，经过厌氧固体发酵生产出新型微生 物饲料添加剂。通过育肥猪的养殖试验，发现2 添加量组比对照组提高日增重8 7 酒窖底泥中丁酸梭菌的分离及特性研究 ，提高饲料利用率1 0 ，降低粪便n h 3 含量6 1 0 。与之相反，李丰成等( 1 9 9 7 ) 在生长猪日粮中添加e m 发酵饲料试验的日增重和饲料报酬均差异不明显。 有关益生菌在动物应用方面的报道还有很多，但结果很不一致，总的来说正效 应多余负效应。潘康成等对近年来的部分资料进行了统计学处理，所得结果见表1 - - 3 ( 潘康成等，2 0 0 2 ) 。 表1 3 微生态制剂使用效果统计 t a b l e1 3t h ee f f e c ts t a t i s t i c so fp r o b i o t i c sb s e di nc l i n i c 注：数值变化范围”平均值 f u l l e r 曾指出这可能与饲喂了抗生素添加剂有关。潘康成等认为，这可能与饲料 营养水平、成分、动物所处的环境、状态，益生菌所用宿主的范围以及使用方式、 方法、剂量有关，而且与益生菌制品的质量也有很大的关系。微生态制剂的质量不 仅体现在其含菌量，而且体现在菌株保藏性能及加工稳定性等方面。 1 4 5 益生菌研究理论依据 1 4 5 1 生态平衡理论 在微生态系统内的微群落水平上，少数优势种群对整个群落起着决定作用。一 旦因某种原因而失去优势种群，则微群落就会解体而失调。利用宿主体内的正常微 生物优势菌群成员的益生菌，加工制成微生态制剂，可以调节失调的菌群，使宿主 体内恢复正常的微生态平衡，达到防病治病的目的。 8 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 4 5 1 生物拮抗理论 生物拮抗理论又称为生物屏障理论，肠道内正常菌群直接参与机体生物防御的 屏障结构，包括化学屏障和生物屏障。化学屏障是指肠内主要菌群的代谢产物，例 如乙酸、乳酸、丙酸、过氧化氢及细菌素等活性物质可以阻止或杀灭病原微生物在 体内的定植。生物屏障使指定植于黏膜或皮肤上皮细胞之间的正常微生物菌群所形 成的生物膜样结构，阻止病原微生物的定植，起着占位，争夺营养，发挥生物拮抗 作用。 1 4 5 2 生物夺氧理论 根据正常微生态菌群的自然定植规律，人或动物的肠道在出生时是无菌的，出 生后被一系列微生物定植。定植的顺序先是需氧菌，然后是兼性厌氧菌，随后是厌 氧菌。厌氧菌虽然不能先定植，但是在整个微生态系统中其数量占据首位，并保持 着一定的生态平衡。利用培育的好氧微生物，降低局部环境氧分子浓度和氧化还原 电位，造成适合正常肠道优势菌生长的微环境，促进厌氧菌大量繁殖生长，最终达 到微生态平衡。 1 4 5 3 “三流运转”理论 微生态制剂可以作为非特异性免疫调节因子，提高机体血红细胞的吞噬能力和 促进b 淋巴细胞产生抗体的能力；还可以降解肠道内的有毒物质( 如氨、酚、内毒 素等) ，促进肠蠕动，维持黏膜结构完整，从而保证了微生态系中基因流、能量流和 物质流的正常运转。 1 4 6 益生菌作用机理 益生菌制剂虽然在应用上取得了较好的效果，但在改善肠道微生态平衡的机制 研究方面还处于初始阶段，可能的机制有以下几个方面。 1 4 6 1 拮抗动物病原菌并维持肠道正常的微生态平衡 根据肠道细菌对寄生动物的有利或有害作用将其划分为有益菌群、有害茵群和 利害均备菌三类( g i b s o n , 1 9 9 5 ) 。有益菌包括乳酸杆菌和双歧杆菌等；利害均备菌 包括拟杆菌、大肠杆菌和韦荣氏菌等。有害菌包括病原菌和肠道致病菌，如伤寒沙 门氏菌、志贺氏菌、假单胞菌、肠道病原性大肠杆菌等。有害菌对宿主的损害包括： 导致肠炎、腹泻、病原菌感染及其它综合症状；产生致癌物质；产生流化氢、 氨等有害物质；致肠道腐败等。 9 酒窖底泥中丁酸梭菌的分离及特性研究 正常情况下，动物肠道微生物种群及其数量处于一个动态的微生态平衡状态， 当机体受到某些应激因素的影响，这种平衡可能被破坏，导致体内菌群比例失调， 需氧菌如大肠杆菌增加，并使蛋白质分解产生胺、氨等有害物质，动物表现下痢等 病理状态，生产性能下降。应用益生菌，可以补充和恢复优势菌群的数量、种类和 比例，防止细菌移位。恢复微生态平衡，维持肠道健康。 研究表明，饲喂芽孢杆菌能产生蛋白多肽类抗菌物质，拮抗动物病原菌：此外 还能使动物空肠内容物乳酸、丙酸、乙酸等含量上升，口h 下降，抑制有害菌的生长 繁殖。乳酸菌可以产生多种抗有害物质，如有机酸、过氧化氢、酶类、细菌素等拮 抗病原菌。产生的有机酸包括乳酸、乙酸、丙酸和丁酸等可使肠道环境p h 下降， 对病原性细菌有抑制作用，产生过氧化氢从而抑制病原菌的生长繁殖，使有益微生 物在细菌种问的相互竞争中占优势。t 双歧杆菌和乳酸杆菌还产生胞外糖萤酶，可降 解肠黏膜上皮细胞的特异性糖类，阻止致病菌和毒素对上皮细胞的粘附和侵入( 孔 青，2 0 0 6 ) 。 1 4 6 2 抑制病原菌繁殖，阻止病原菌吸附于肠壁，促进其排出体外 粘附于肠粘膜是细菌定植和侵害宿主的前提。有益菌可以跟病原菌竞争定植位 点，当有益菌占据肠粘膜表面，就形成一个生物学屏障，在空间上构成肠道的定植 抗力，并通过细胞代谢阻止病原菌、条件致病菌的定植和入侵，保护宿主免受致病 菌的侵害。f u l l e r 等及s t a v r i c 等研究表明，乳杆菌能定植于鸡和猪肠道上皮，与动 物体建立一种共生关系，调节肠道菌群的平衡，并能有效的防止肠道致病菌( 如沙 门氏菌) 对动物的感染( f u l l e re ta l , 1 9 9 2 ) 。试验证明，雏鸡使用微生态制剂后，大 肠和盲肠内肠球菌的数量减少到原来的0 0 0 1 0 0 1 ，大肠杆菌减少到原来的1 0 ，多形性细菌减少到原来的0 0 1 以下 1 4 6 3 改善体内外生态环境，减少氨、胺等有害物质产生 氨、胺、吲哚、硫化氢、靛基质等物质对动物肠道粘膜细胞有明显的毒害作用。 乳酸菌等在肠道生长繁殖能产生有机酸，细菌素等抑制物质，可抑制肠内大肠杆菌 等腐败细菌的生长，降低脲酶的活性，进而减少蛋白质向氨、胺等有害物质的转化， 使肠内氨的浓度降低，并减少向外界排泄，改善了畜禽的生活环境。江朝元给母猪 饲喂腊样芽孢杆菌制剂后，使母猪肠道内的有益微生物增加而潜在的致病微生物减 少，因而粪便中的有益微生物数量增多，致病性微生物减少，当仔猪接触母猪奶头、 粪便及场地、用具等时获得的有益菌多，有害菌少，预防仔猪下痢的有效率达8 5 以上( 江朝元，1 9 9 2 ) 。s a n d e r s 等研究发现，芽孢杆菌可以产生一种未知物质结合 粪中尿素或尿酸分解的氨，减少氨气的释放。芽孢杆菌在大肠内产生的氨基氧化酶 及分解硫化氢的酶类可以将臭源吲哚类化合物完全氧化成无臭无毒害和对环境无污 l o 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 染的物质，同时芽孢杆菌还有利用氨的酶类，可以降低血氨浓度( s a n d e r s ，2 0 0 3 ) 。 p a r k 等添加益生素( 含多种微生物的混合制剂) 于公鸡日粮中，显著降低了公鸡盲 肠内容物的氨含量( p a r k ，2 0 0 6 ) 。 微生态制剂中某些菌属( 如嗜胺菌) 可利用消化道内游离的氨、胺及吲哚等有 害物质，扭转蛋白质向胺及氨的转化，使粪便和血中氨下降，排出的氨也减少，且 排出的粪中还含有大量的活性菌体，可以利用剩余的氨。 1 4 6 4 提高饲料转化率，合成营养物质，促进动物体生长 饲料发酵后产生的有枧酸可促进矿物质的吸收和利用。很多益生菌繁殖时会产 生各种酶，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪分解酶、水解酶、果胶酶、葡聚糖酶、纤维素 酶和植酸酶等活性消化酶，促进动物对饲料的消化和利用。另外，益生菌中有许多 菌体如光合细菌、酵母菌等本身就含有丰富的营养物质，可以被动物摄取利用。再 者，乳酸菌、双歧杆菌等益生菌能够合成多种动物必需的维生素如：叶酸、b 族维 生素、k 族维生素等，并能够促进机体对蛋白质、钙、铁等的消化吸收，从而促进 畜禽生长。 李维炯等( 2 3 ) 发现，益生菌发酵饲料中植酸酶在处理第4 天酶活达到最大， 由0 0 2 u 增加为0 3 2 u 。且饲料中植酸的含量随发酵时间的延长而逐渐下降，从最 初的1 5 6 下降到0 0 9 。发酵饲料p h 值下降和产生的少量植酸酶是降低饲料中 植酸的可能原因。同时b 淀粉酶活性在第3 6 天较高，较发酵前增加了一倍。猪饲 料经过e m 发酵后，饲料中各种氨基酸含量比发酵前明显提高，幅