（营养与食品卫生学专业论文）maillard反应型可可香料制备研究.pdf

摘要 摘要 美拉德反应( m a i l l a r dr e a 幽) 是食品热加工过程中各种风味的重要来源，化学反应机理相对复 杂。 本文主要研究利用m a i l l a r d 反应制各可可香料的方法和应用，探讨了可能存在的机理。本论文 主要内容和实验结果如下： 1 ，论文中采用了p l a c k e t t o b u r m a a 试验设计，筛选对可可风味有主要贡献的氨基酸和还原糖。 最终确定反应原料为2 9 亮氨酸、1 5 9 苯丙氨酸、1 9 精氨酸，l g 甘氨酸、l g 谷氨酸、o 5 9 丝氨酸和 两种还原糖( 即3 9 葡萄糖、9 9 果糖) 。 2 、通过均匀试验设计确定最佳反应条件：温度1 2 4 ，时间2 0 m i n ，水分含量为7 3 9 。统计 分析结果表明，水分含量对反应体系的影响最大。 3 、在原有反应型可可香料的基础上，对其进行调香修饰制备出可可香精，应用于饼干、硬糖和 冰淇淋。感官评价结果表明，与市售复配可可香精相比，具有良好的热稳定性。在烟草中的应用试 验发现，反应1 6 r a i n 的可可香料加香效果最为显著，随后进行的在烟草中的裂解g - c - m s 分析证明 了这一点。 4 、通过对反应型可可香料的m a i l l a r d 反应体系的研究，确定反应型可可香料在水分含量为 1 0 2 0 时更易形成致香成分。此外，果糖有利于产生更多的吡嗪类物质( 如烷基吡嗪) ，而葡萄糖 则有助于醛类物质的形成。同时，确定反应前5 分钟为m a i l l a r d 反应的最初阶段，此时氨基酸和还 原糖大量降低。本文还确定了两种可可醛的生成机理。 5 ，探讨了微波法制备反应型可可香料，在与油浴法相同的原料情况下，其最佳的反应条件为反 应时间为6 s t a i n ，水量：二醇量m l 为3 2 5 ：1 7 ，5 。比较油浴法和微波法制备反应型可可香料中的致香 成分和含量，表明微波法能够取代油浴法用来制备反应型可可香料。 关键词：m a i l l a r d 反应，反应型可可香料, p l a c k e t t - b t m n a n 试验设计，葡萄糖，果糖，氨基酸, g c m s 法，油 浴，微波 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t 1 1 ”m a i l l a r dr e a c t i o na c t u a l l yi n c l u d e sas e r i e so fc o m p l e xc h e m i c a lr e a c t i o n s 1 e a d m gt ot h e f o r m a t i o n o f f l a v o r sc o n s i d e r e d i m p o r t a n t i n h e a t e d f o o d p r o c e s s i n g 1 1 ”m a i ns t u d yo ft h i sp a p e rw a st h em e t i i o do fp r e p a r i n gc o c o ar e a c t i o nf l a v o rt h o u g hm a i l l a r d r e a c t i o na n di t sa p p l i c a t i o n a tl h es m et i m e w ed i s c u s sp o s s i b l ye x i s t e n tm e c h a n i s m n ”m a i nc o n t e n t a n dr e s u l t sa r ea sf o l l o w ： 1 嶂m a i na m i n oa c i d sa n dr e d u c m gs u g a rw e r eo b t a i n e dt h r o u g ht h ep l a c k e t t - b o r m a ne x p e r i m e n t d e s i g na d o p t i n gf b rm ef i r s tt i m e 1 1 l em a t e r i a l so fc o c o ar e a c t i o nf l a v o rw e l e u c i n e ( 2 9 ) ，p h e n y l a l a n i n e ( 1 5 ) ，g l y c i n e ( 1 9 ) ，a r g i n i n e ( 1 9 ) ，g l u t a m i ca c i d ( 1 9 ) ，t i n e ( o 5 9 ) a n dr e d u c i n gs u g a r s ( 3 9g l u c o s ea n d9 9 f r u c t o s e ) 2 t h eb e s tc o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e dt h r o u g hu n i f o r md e s i g n t h et e m p e r a t u r ea n dt h em o i s t u r ec o n t e n to f t h i ss y s t e mw e r er e s p e c t i v e l y1 2 4 f o r2 0 m i na n d7 3 9 a tt h es a m et i m e w ef o u n dt h a tt h em o i s t u r e c o n t e n tw a st h eb e s ti m p o r t a n ts i g n i f i c a n tf a c t o ri nt h i ss y s t e m 3 t h ec o c o ae s s e n c ew a sp r o d u c e db ym o d i f i c a t i o no f c o c o ar e a c t i o nf l a v o rt oa p p l yi nb i s c u i t , h a r dc a n d y a n di c ee l - c a i n i ts h o w e dt h e r m a ls t a b i l i t ya d v a n t a g ec o m p a r e dw i t hs e l l i n gc o m p o u n dc o c o ae s s e n c ei n m a r k 吮t h ep r o d u c to f1 6 r a i nm a r k e d l yi m p r o v e dt o b a c c os m o k i n g t h ea n a l y s i so fg c - m s p y r o l y s i s a l s oc e r t i f i e da b o v ep o i n l 4 t h cm a i l l a r dr e a c t i o ns y s t e mo fc o c o ar e a c t i o nf l a v o rw a ss m d i e d w ef o u n dt h a tm o i s t u r ec o n t e n ti n r a n g eo f1 0 - - 2 0 0 , 4a n da c i d i cc o n d i t i o nf a v o r e dt ot h ef o r m a t i o no f t h es o m em a i na r o m a t i cc o m p o u n d s ，i n a d d i t i o n ，f r u c t o s ew a gb e n e f i c i a lt ot h ef o r m a t i o no fp y r a z i n e s , w h i l em o r ea l d e h y d e sp r o d u c e di nt h e r e a c t i o no f g l u c o s e i t w a s t h e p r i l n m , s t a g e o f m a i u a r dr e a c t i o n b e f o r e 5 m i n ，i n t h i s t i m ea m i n oa c i d s a n d r e d u c i n g “l g a r sw ag r e a tl o to fr e d u c i n g 1 1 ”f o r m a t i o np l o c c s so ft w oc o c o aa l d e h y d e ( 5 - m e t h y l - 2 - i s o p r o p y l - 2 - h e x e n a la n d5 - m c t h y l - 2 - p h e n y l - 2 - h e x e n a l ) w a sm a d ec l e a r 5 w eu s em i c r o w a v eo v e ni n s t e a do fo i lb a t ht op r o d u c tc o t ? o f fr e a c t i o nf l a v o r t h eb e a tc o n d i t i o n sw c r e o b t a i n e d 1 1 1 et i m eo f r e a c t i o nw a s6 8 m i na n dt h er a t i oo f m o i s t u r e # y c o lp r o p y l e n e ( g ，g ) w a s3 2 5 ：1 7 5 a st h es a n 增m a t e r i a la n da m o u n ta so i lb a t hm e t h o d t h ec o c o ar e a c t i o nf l a v o r sp r e p a r e db yt h et w o m e t h o d sw c r ec o m p a r e d t h er e s u l tw a ss h o w e dt h a tt h em i c r o w a v em e t h o d sc o u l dr e p l a c et h eo i lb a t h m e t h o d st op r o d u c ec o c o ar e a c t i o nf l a v o r k e yw o r d s ：m a i l l a r dr e a c t i o n ；c o c o ar e a c t i o nf l a v o r , p l a c k e t t - b u r m a nt e s td e s i g n ；g l u c o s e ；f r u c t o s e ； a m i n oa c i d s ；g a sc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e u - y ；o i lb a t h ；m i c r o w a v e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 日期：。7 年矿月刁日 第一章绪论 1 1 可可资源概况 第一章绪论 可可是世界上重要的热带经济作物，由于其具有浓郁芬芳的独特风味及重要的营养价值，成为 当今世界上三大嗜好性饮料之一( 茶、咖啡) ，经久不衰。可可更是巧克力的重要原料，也是各种甜 点、焙烤、小吃食品和饮料的香料成分。近几十年来，全球可可豆的消耗一直都呈稳定发展的态势。 上世纪9 0 年代中期以来，随着食品结构和消费习惯的变化以及对外贸易的拓展，可可及可可制品( 可 可脂、可可粉、可可浆) 应用范围的日趋扩大，我国可可加工行业发展迅猛。我国年平均可可豆进 口量是世界总产量的l 左右，约3 4 万t 左右，在世界8 2 个可可豆进口国中进口量排名世界第1 6 位。可见，我国对可可产品的需求量日益增大”j 。 由于自然条件的限制，可可只能在适宜的自然环境中种植生长即在南北纬2 0 0 以内，年平均气温 在2 4 2 8 ，年降雨量为1 3 0 0 m m ，土地肥沃，排水通畅的湿谷地或沿海平原，也就是分布在非洲、 拉丁美洲和亚洲三大洲。一棵可可树5 年树龄后所生产的可可豆才能加以利用，1 5 年树龄后可可树 的产量才会达到最高峰，并维持到3 0 年树龄左右，4 0 年树龄以上就不再产生效益。因此，可可树 不是一种高产植物。全世界的可可豆的产量正常年份约为3 0 0 3 5 0 万t 左右，其中2 3 在非洲，特 别集中在西非洲，而该洲中的加纳和尼日利亚是世界上提供可可资源最重要的地区；其次是拉丁美 洲，产量占总量的1 3 以下。而亚洲产量少，占总产量的l 。近些年亚洲增长速度较快，产量逐年 上升约占1 6 。而我国在2 0 世纪5 0 年代先后引种多批载种于海南西部和西双版纳成功，表明该地 区气候条件能适宜可可的生长u 叫 可可豆是一种期货商品。其生产国的政治形势，种植面积和产量以及世界可可豆期货市场各种 因素变化，都对可可豆的价格产生直接影响【，】。 1 2m a i l l a r d 反应制备可可香料的研究概况 食品在蒸煮、焙烤及煎炸中产生的食品香料，即食物经加热而分解、氧化，重排或降解，形成 香味前体，进而生成具有特殊风味的食品香料，一般称之为热加工食品香料，亦叫反应食品香料， 这类香气物质形成的化学机理就是m a i l l a r d 反应。m a i l l a r d 反应发生在还原糖和氨基酸或者是肽、蛋 白质之间，氨基酸来源的选择对反应的香气和味道有较大的影响。一种或几种氨基酸与还原糖系统 经过加热反应可生成逼真的各种香味。 m a i l l a r d 反应一般可以分成三个反应阶段，如图1 1 所示，足见m a i l l a r d 反应的复杂性： l 、初级反应阶段 还原糖的碳基与氨基之间进行加成，加成物迅速失去1 分子水转变为希夫碱( s t “f r o a s e ) ，再经环 化形成相应的n 取代的醛基胺，经a m a d o r i 重排转成有反应活性的1 一氨基1 一脱氧- 2 酮糖。初级 m a i u a r d 反应不引起褐色变，也不产生香味，但其产物是产生极重要的不挥发性香味物质的前驱物。 2 、高级反应阶段 在氨基酮糖和氨基醛糖等重要的不挥发性香味前驱物形成之后，m a i l a r d 反应变得更为复杂，反 应后产生还原酮、糠醛和不饱和c 基化合物等，这些不同的化合物依次反应，开始形成无氮及含氮 褐色可溶性化合物。此反应阶段主要包括3 条反应路线。第l 条路线还原酮路线。由m a i l l a r d 重排反应产物1 - 氨基1 脱氧2 酮糖在2 - 3 位置不可逆地烯醇化，从c 1 消去胺基生成甲基二碳基中间 体，其进一步反应产物如c 甲基醛类，酮醛类、二碳基化合物和还原酮等裂解产物； 第2 条路线0 翻i l o s e 和h l v i f 路线。a m a d o r i 产物在1 ，2 位置上烯醇化，并消去c ，上的经基， 江南大学硕士学位论文 加水分解并失去其含氮部分而生成3 脱氧o s u l o s e ，进而生成3 ，4 - 二脱氧o s u l o s e ，最后又脱水生成 糠醛类风味成分； 第3 条路线s t r e c k e r 降解。在s t r e c k e r 降解中，各种不同的特殊醛( 亦称s t r e c k e r 醛类) 是造成 食品不同香气的因素之一，而氨基酮经异构为烯醇胺，再经环化形成吡嗪类化合物。食品焙烤时产 生的浓郁香味，多为吡嗪产生。 3 、最终反应阶段 高级m a i l l a r d 反应阶段形成的众多活性中间体，如葡萄糖酮醛、3 一脱氧o s u l o s e ( 3 一d 6 ) 、3 , 4 一二 脱氧o s u l o s e ( 3 二d 6 ) 、h m f 、还原酮类、不饱和醛亚胺等，又可继续与氨基酸反应，最终都生成 类黑精色素褐色含氮色素。此过程包括醇醛缩合、醛氨聚合、环化合反应等。加热食品所具有的烤 香、焙烘香、炒香大都是与环化合反应有关。因其生成了诸如吡嗪、吡啶、吡咯等氮杂环化合物【6 】。 还原糖+ 弘氨基酸类 l n 葡基胺或n - 果糖基胺 l l 氨基1 脱氧- 2 酮醣( a m a d o r i 中间体) 或2 氨基- 2 - 脱氧一1 一醛醣( h e y n s 中间体) l 4 - 吡喃酮类 吡咯类 噻吩类 羟甲基丙酮 二羟基丙酮 羟基乙酰 乙二醛 丙酮醛 乙醇醛 甘油醛 氨基酸 s t r e c k e r 降解 醛类+ 十氨基酮类 ( + 乙硫磷醛，来自甲硫氨酸) ( + h 2 s 和n i l 3 ，来自半胱氨酸) l 杂环化 毗啶类噻唑类 吡嗪类 吡咯类 恶唑类 咪唑类 图1 - 1m a i l l a r d 反应途径示意图 天然可可风味的产生主要是通过发酵、干燥和焙烤三个过程。发酵是产生可可特异性香味的前 体条件( 游离氨基酸、短肽和还原糖) 。同时。发酵能大大降低可可碱和单宁的含量，改善涩味和苦 味。而后的干燥过程能使水分含量大大降低，大约到8 左右，酸含量降低、p h 升高。在焙烤过程 中，发酵产生的风味前体发生m a i l l a r d 反应，最终产生可可的特异性风味。m a i l l a r d 反应制备可可香 料的主要原理是基于对可可物质在加热过程中产生风味物质的反应的模拟【7 叫。 而国内多见的是肉类m a i l l a r d 反应香料的制备研究报道，对于可可味并未见报道。出于技术和 商业保密，国外多见的是专利文献。目前，m a i l l a r d 反应产生可可风味的方法大致有三种：其一， 酶水解植物蛋白。可可中产生风味前体的酶是天门冬氨酸内源蛋白酶i l 町和羧肽酶【”j ，它们可以通过 基因重组制备，也可以用其它酶替代。u s - a - 2 ，8 8 7 ，3 8 8 和u sa - 2 ，8 3 5 ，5 9 2 揭示出用玉米、小麦、大 麻、大豆、黑麦、燕麦、花生、大麦，动物和鱼蛋白的蛋白水解液和氨基酸反应人工制备可可，巧克 力风味。w 0 0 2 0 6 3 9 7 4 是通过在p h 2 5 酸化未发酵的完全或部分脱脂的可可液，用基于可可干重的 0 1 5 的蛋白酶( 风昧酶1 0 0 0 l 等) 在4 0 6 0 c 下水解1 4 8 小时，进行焙烤能产生强烈的可 可风味【1 2 】。通过生物技术手段制各可可风味前体亲水性短肽【l ”，在和氨基酸混合物、还原糖反应， 同样能生产浓郁的可可风味；其二，将一些可可提取物补充到反应体系中，达到更逼真的效果。国 外有以果糖、几种氨基酸、少量可可提取物、水和丙二醇混合物制备巧克力味的热反应型香精的实 例【1 4 l ；其三，仅用氨基酸和还原糖达到最逼真的可可风味。u s - a - 5 ，6 7 6 ，9 9 3 揭示出增强可可风味 2 第一章绪论 前，国外市场上出售有以m a i l l a r d 反应产物制备的巧克力香精。 1 3 立题背景和意义 天然可可粉风味较弱，应用于食品或烟草中时，其用量较大，易增加食品的成本。而且，在风 味饮料中应用时，由于颗粒较大，容易发生下沉，从而影响了饮料的感观品质。另外，可可的种植 需要独特的地理环境，而且其产量受制于气候、战争等多种因素，因此价格极不稳定。为了克服天 然可可粉紧张的供应局面，增强食品的可可风味，降低原料成本，同时满足人们对可可风味的需求， 可可的这种商业重要性刺激了人们对其风味性质的进行研究。而天然提取的可可酊或可可浸膏对技 术的要求很高，制备方法繁锁，价格昂贵，产量少，状态不易添加到食品中。经单体调配的香精是 目前生产香精、香料的常用方法，价格低廉，但风味不足，不够逼真，稳定性差，同时安全性值得 考虑。 人民生活水平提高，对食品的色、香、味提出了更高的要求。回归自然已是一种时尚，利用 m a i l l a r d 反应产生各种天然风味是食品风味研究的潮流。m a i l l a r d 反应技术在香精领域中的应用打破 了传统的香精调配和生产工艺的范畴，是一全新的香精香料生产应用技术，产品不仅有良好的耐热 性，而且能在加热时产生平常难以得到的香气，产生更自然、更诱人、更逼真的香味效果，具有调 配技术无法比拟的作用。但有时香味强度还是不够，需要进一步调配。利用m a i u a r d 反应生成的香 料在国际上认为是属于天然香料范畴”7 ，被美国食品药品管理局( f d a ) 认定为是一般公认安全 的产品( g l 认s ) f 1 2 1 。同时。m a i u a r d 反应香料具有许多的生理功能，如对矿物质的吸收和排泄的影响、 具有类似于食物纤维的作用、抗氧化作用，对亚硝胺生成的抑制作用、对过剩氧的消去作用、对免 疫系统的生理作用和抗突变作用“”。 1 4 本论文的主要研究内容 在以上介绍的m a i l l a r d 反应制备可可风味的三种方法中，第一种方法，用酶法水解产生风味前 体，其中重要的酶一羧肽酶价格相当昂贵，虽有专利报道可用其它酶代替，但经本人试验，并没产 生应有的效果；第二种方法，添加天然的可可提起物，虽能达到很好的效果，但经济上不合算，也 未揭示产生风味的本质。因此，本人从最基本、最重要的氨基酸和还原糖发生的m a i l l a r d 反应入手， 制备反应型可可风味。主要内容如下： l 、在比较焙烤前后天然可可粉中游离氨基酸含量变化的基础上，通过p l a c k e t t - b u n n m 试验设 计筛选对可可风味具有主要贡献的氨基酸和还原糖； 2 、采用油浴加热方法。应用均匀试验设计，考察反应体系的温度、时问、水分含量三个重要参 数对m a i l l a r d 反应产物可可风味的影响，并对m a i l l a r d 反应产物中致香成分进行g - c m s 分析和感官 评价。探讨微波加热方法制备m a i l l a r d 反应型可可香料的可能性； 3 、在均匀试验设计中，基于水分含量严重影响m a i l l a r d 反应的现象，研究不同水分含量对 m a i l l a r f l 反应的影响、果糖和葡萄糖分别对可可风味物质生成的影响，以及反应时间与体系中氨基 酸、还原糖的残留量和致香成分生成量的关系； 4 、研究m a i l l a r d 反应型可可香料在食品和烟草中的应用情况。 江南大学硕士学位论文 2 1 引言 第二章m a i l l a r d 反应型可可香料的研制 如绪论所述，由于可可风味物质的前体是短肽、游离氨基酸和还原糖( 葡萄糖和果糖) ，国外有 报道用酶( 天门冬氨酸内源蛋白酶和羧肽酶) 水解植物蛋白或基因重组技术合成前体短肽，这两种 方法所用费用相当高，不利于工业化生产本人在初步研究的基础上发现，用风味酶水解植物蛋白 时，由于此酶作用广泛生成的副产品较多，不利于可可风味的形成，而添加可可提取物成本也较高。 r o h a n 和s t e w a r t 用缬氨酸和亮氨酸与葡萄糖加热反应生产类似巧克力香味田】。h e r b e r tf o s t e r 证 明苏氨酸或缬氨酸与葡萄糖一起加热可产生类似巧克力的香味1 2 3 1 。l a n e 和n u r s t e n 则采用丝氨酸或 酪氨酸与葡萄糖一起加热产生类似巧克力的香味。但是这些前人所反应出的产品仅表现出可可的 某一特征风味，气味单一、不够浓厚，不能作为可可香料用于实际生产。本人期望通过研究选出能 够制备出可可香料的几种主要氨基酸和还原糖。 在u s - a _ 5 ，6 7 6 , 9 9 3 专利中报道，以可可脂为基质混合氨基酸与还原糖反应可产生可可风味【1 5 1 ， 但通过实验发现此法并不可行，反应物在其中不能均匀分散。经过摸索，采用丙二醇作为反应介质。 在提取致香成分的方法选择上，由于s d e 需在较高温度下进行，采用此法会使m a i l l a r d 产物继续反 应，得到的结果不可靠。而由于可可风味本身香气较弱、柔和，s p m e 对其风味的提取极为有限， 所以采用室温下溶剂提取的方法，目的是能更真实地反映产品特性又能最大限度地提取其中的致香 成分。 本章在确定制各反应型可可香料的原料基础上，采用均匀试验设计，进一步优化m a i l l a t d 反应 参数。再由专业食品调香师对所制各的产品进行感官评价，又对其中的主要致香成分进行g c - m s 分析。 2 2 材料和仪器 2 2 1 原料与试剂 干燥过的可可豆( 品种为福拉斯蒂罗) 葡萄糖( 分析纯) l 氨基酸( 生化级) 果糖( 生化级) 正戊烷( 色谱纯9 9 ) 无水乙醚( 分析纯) 无水硫酸钠( 化学纯) 柠檬酸三钠( 分析纯) 2 2 2 主要仪器 a g i l e n t6 8 9 0 - 5 9 7 3 气相色谱质谱联用仪 a g i l e n t1 1 0 0 液相色谱仪 z x - - 9 8 型旋转蒸发器 4 无锡上可食品有限公司 国药集团化学试剂有限公司 上海康捷生物科技发展有限公司 国药集团化学试剂有限公司 l a n c a s t e r 公司 国药集团化学试剂有限公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 美国a g i l e n t 公司 美国a g i l e n t 公司 上海有机化学研究所 第二章m a i l l a r d 反应型可可香料的研制 d j 0 2 粉碎机 b e c k m a n - c o u r e r 2 2 r 离心机 油浴h e - - 4 天平a r r v 7 0 c n x s 6 0 0 w 数控超声波清洗机 2 3 实验方法 2 3 1 天然可可粉的制各 上海淀久中药机械制造有限公司 美国b e c k m a n - c o u l t e r 公司 德国j u l a b o 公司 奥豪斯仪器( 上海) 有限公司 鑫能信超声设备( 集团) 有限公司 去除外种皮的可可豆粉碎并过目筛，在1 2 0 1 2 下焙烤2 0 r a i n 。 2 3 2 天然可可粉焙烤前后游离氨基酸的提取 称取3 9 ( 精确到o o o l g ) 焙烤前后脱脂可可粉( 索氏提取1 0 h 左右) ，用2 0 m l 2 0 班柠檬酸钠 溶液( p h 2 2 ) ，超声波提取3 h ，4 1 0 0 x g 离心获得的上清液经过滤后，用2 0 9 l 柠檬酸钠溶液( p h 2 2 ) 定容2 5 m l ，微孔滤膜过滤，进样。 2 3 3 游离氨基酸分析的条件 色谱柱：4 0 x 2 5 0 m mc 1 8 柱温：4 0 流速：1 o m l l m i n 波长：3 3 8 n m ，2 6 2 m n ( p r o ) 流动相：a ：2 0 r e t o o l 醋酸钠溶液 b ：2 0 m m o l 醋酸钠溶液：甲醇：乙腈= 1 ：2 ：2 ( v v ) 进样量：1u i 2 3 4 用于p l a c k e t t - b u r m a n ( p b ) 试验设计分析的m a i l l a r d 反应产物制备 p l a e k e t t - b u r r n a n ( p b ) 试验设计是一种经济而有效的二水平试验设计方法。1 1 个二水平变量的p b 设计仅需要1 2 次试验( 如表2 - l 所示) ，就可达到良好的效果且因子的交互作用仅部分的与主因子 发生混淆”j 。 p b 试验的m a i l l a r d 反应条件：根据表2 - 2 中氨基酸和还原糖的种类和用量，按表2 1 中的p b 试验顺序进行1 2 次反应，以8 0 9 丙二醇为溶剂，加入2 0 m l 水，在冷凝回流条件下油浴快速升温到 1 2 4 ( 2 反应2 0 r a i n ，搅拌，搅拌速率为3 0 0 r m i n 。反应结束循环水冷却至室温2 5 左右，反应产物保 存在2 0 冰箱内 江南大学硕士学位论文 表2 - 11 1 个因素的p l a c k e t t - b u r m a n 试验设计表 试验实验因素 序号x lx 2x 3x 4 x 5x 6x 7x 8x 9x 1 0x 1 l 表2 - 2p l a c k e t t - b u r m a n 设计因子水平范围 x 1 x 2 x 3x 4x 5x 6x 7x 8x 9x 1 0x 1 1 因素缬氨酸甘氨酸苯丙氨亮氨酸酪氨酸苏氨酸丝氨酸谷氨酸精氨酸葡萄糖 果糖 生生堕墨丛 生 生堡堡 丛 生 丝 水 + l1 21 20 80 80 80 50 50 50 251 0 平- 10000000001 05 2 3 5m a i l l a r d 反应产物的风味物质提取 5 0 0 m l 三角瓶中称取5 0 9 ( 精确到o o o l g ) 2 3 4 中制备的m a i u a r d 反应产物，加入6 0m l 正戊 烷乙醚混合液( 2 ：1 ) 室温下磁力搅拌提取4 h ，用分液漏斗分离得到的有机相中加入无水n a 2 s 0 4 过夜，过滤后滤液倒入具刻度的浓缩瓶中，样品在3 9 c 下旋转蒸发浓缩到l m l ，供g - c - m s 分析。 2 3 6m a i l l a r d 反应产物的g c m s 分析条件 色谱柱：l i p - i n n o w a x ( 6 0 m x 0 2 5 p m 0 2 5 r a m ) 载气：h e 流量：1 m l m i n 进样口温度：2 5 0 分流比：5 0 ：1 进样量：l u l 2 c m i n 、i o c m i n 程序升温：6 0 c ，1 8 0 c 2 2 0 瑚m i i i 离子源：e i 源 离子源温度：2 3 0 扫描范围：1 0 - 4 5 0 a i n u 进样条件：自动进样 采用计算机和人工解析g c m s 图谱，每个峰同时用n i s tl i b r a r y 和w i l e yl i b r a r y 进行匹配检 索定性，确认其化学成分。 6 h d 0 d 4dj d 4 d 州h d 以4 d d dhdd以州 d 以h d h 以d 0 h d h h j d d h d 0 h d 州d o d 4 以 “d d d d 0 d “4 h 4 4 h 4 4 4 “d h 0 4 0 4 d h h h j d d d d d h j j “j 0 4 “4 “ 1 2 3 4 5 6 7 s 9 m n 坦 第二章m a i l l a * d 反应型可可香料的研制 2 3 7 均匀试验设计进行优化反应参数 将p b 试验设计筛选出的氨基酸和还原糖以及确定的反应量，以保持丙二醇与水的总重量为l o o g 的基础上，按表2 - 3 中条件所示进行均匀试验反应，其它条件同2 3 4 。本实验期优化反应参数，更 好地应用于生产实践。 表2 - 3u 5 3 均匀试验设计因素水平表 样品编号温度x i c时间x 2 m i n 水：丙二醇量( g g ) x 3 ( x 3 对应水分含量) l9 41 52 0 ：8 01 6 8 l 21 0 42 5o ：1 0 00 31 1 41 03 0 ：7 02 5 2 1 41 2 42 01 0 ：9 08 a 0 51 3 43 04 0 ：6 03 3 6 1 2 3 8f r i e d m a n 排序检验法评价均匀试验设计的反应产物 由7 名专业的评香师对五种样品按嗜好程度进行排序。秩次由大到小，代表样品由优到劣。捧 序的结果采用f r i e d m a n 检验对样品之间是否存在显著差异作出判定，公式如下： ，= 高( 砰枷z 2 + 霹+ 瑚川( 川) 式中：h 平香师数o p _ _ 样品数； r 1 、p 2 、p 3 r p _ - j 个评香师对p 中样品评价的秩和 2 3 9 反应型可可香料的感官分析 要求8 名专业评香师在光线充足、柔和适宜，温度为2 5 c ，空气新鲜，无香气及邪杂气味，安 静、无噪音的品评室中用闻香纸品评。每位评香师先讨论产品的单一风味特性，然后汇总8 名评香 师的分析结果，根据平均值画出风味剖面图，并对产物的综合印象分进行两两t 检验( a - - o 0 1 ) ，确定 其中每两种产品的差异性。根据表2 - 4 中的内容进行打分。 表2 _ 4 感官分析问答表 7 江南大学硕士学位论文 2 3 1 0 对最终确定的反应型可可香料其致香成分和含量进行g c - m s 分析 将p b 试验设计筛选出的氨基酸和还原糖以及确定的相应反应量作为制备反应型可可香料的原 料，反应条件采用均匀试验得到的最优结果，其它反应操作和风味物质的提取同2 , 3 a 和2 3 5 ，加 入1 0 0 u 1 的正十七烷做为内标。 2 4 结果与讨论 2 4 1 焙烤前后天然可可粉中游离氨基酸含量的变化 如表2 - 5 所示，焙烤前后天然可可粉中氨基酸损失量从大到小依次是p h e 、l e u 、a r g 、t y t 、g l u 、 v a l 、o l y 、s e x 、t h r 、a l a 、l y s 、p r o 、n e 、m e t 、h i s 。e d y 和n e l s o n 的研究渊中前9 种损失量最大 的氨基酸与本实验结果一致，差别是这9 种氨基酸损失量大小的捧序不同。某种氨基酸在焙烤过程 中损失量越大，可能更说明该种氢基酸对m a i l l a r d 反应的贡献越大。为此，氨基酸的选择为p h e 、 l e u 、a r g ，t y r 、g l u 、v a l 、s e t 、t h r ，g i y 这9 种，还原糖的选择为天然可可豆中仅含有的葡萄糖 和果糖两种还原糖进行后续的p b 试验分析。表2 - 5 中，除半胱氨酸( c y s ) 外，各种氨基酸含量测定 的相对标准偏差都在允许范围( 5 ) 内。由于半胱氨酸是含硫氨基酸，不会应用在可可香料的制备中。 表2 - 5 天然可可粉焙烤前后游离氨基酸的变化 注：。”焙烤前减去焙烤后；匕”说明在焙烤后含量有增加 2 4 2p b 试验的结果分析 结合文献报道，确定3 一甲基- 正丁醛、苯甲醛、苯乙醛、5 - 甲基- 2 - 异丙基2 己烯醛、甲基吡 嗪、二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、4 - 甲基戊酸、1 , 3 二氧戊环类作为可可风味关键致香成分。a n d r e w 用稀释分析法分析可可香气，认为具有麦芽香气的3 一甲基丁醛的风味稀释指数最高嗍。苯甲醛是氨 基酸的斯特雷克尔反应生成，具有令人愉快的杏仁香，坚果香和水果香口”。5 - 甲基2 异丙基2 己烯 醛和5 一甲基- 2 一苯基2 己烯醛均称为可可醛，具有草香、木香、果香，巧克力香气，花香、苦的、巧 毫 第二章m a i l l a r d 反应型可可香料的研制 克力味道，是重要的可可特征风味。烷基吡嗪( 甲基、二甲基、三甲基) 均具有浓郁的坚果香、可 可粉的气味田】。4 - 甲基戊酸稀释后具有干酪香、奶香、果香 2 9 , 3 0 。1 , 3 二氧戊环( 乙二醇缩甲醛) 衍 生物，其是相应的醛与溶剂丙二醇的反应产物，具有令人愉快的清甜香、青香、蔬菜香、杏仁香气 等。食用香料评审权威机构美国f e m a 认定1 , 3 二氧戊环为可食用合成香料1 ”。此p b 试验设计 的结果是以峰面积作为标准进行分析，采用s a sv 8 软件的r e g 程序对1 2 个试验样品中选出的1 1 种 主要致香成分的峰面积分别进行逐步线性回归分析，找出对每种致香成分有主要贡献的氨基酸和还 原糖。 表2 - 6 的统计分析结果表明，苯丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、谷氨酸、精氨酸、甘氨酸分别对选 出的几种重要致香成分具有最显著的影响，并星正相关性。而两种还原糖中葡萄糖对醛类表现出显 著影响，果糖对吡嗪类致香成分有显著影响。故通过p b 试验筛选出以上6 种氨基酸和2 种还原糖 作为m a i l l a r d 反应制备可可香料的原料。每种氨基酸用量是根据其之间的重要性，( 如亮氨酸对8 种 致香成分有贡献，3 种致香成分有最主要的贡献) ，还原糖中葡萄糖和果糖的比例以及氨基酸与还原 糖总量之间的比例均参照天然可可粉中的比例，氨基酸的总量以反应后产品中没有可见沉淀为宜。 因此，最终确定6 种氨基酸( 即2 9 亮氨酸、1 5 9 苯丙氨酸、l g 精氨酸、1 9 甘氨酸、l g 谷氨酸、 o 5 9 丝氨酸) 和2 种还原糖( 即3 9 葡萄糖、9 9 果糖) 作为制备反应型可可香料的原料。 9 蓉 堇誉 ooo 蜃醯限惜琳 掣椰硝忙域錾ov屯墨_坦 。一一oo n o o o 口一8 o n n o o o1 9 0 0 o n o o o n 0 0 o = 0 0 o 1 9 h o o _ 1 0 0 o 寸n o o o 一0 0 o a n o o o o o 口口_loo- _ 【i o o o _ 口o o o n 0 0 o 。 n h o o o _oi)oo oanoo 0 6 _ o o - n n 8 o c i o o o t 0 8 o 9 8 o 口c o o - ”n o o n 卜寸0 o o o o n n 0 0 o - 口o o o n o o o o n 0 0 0 o 糕薛骄-ch 镫镊醐 毒谧卜醐 - c 登害_ 霉 臣瞥善醐 鉴善醐 蜚菩螭旺 镒襞己z锵*晶瑚沾 g o o o 谧裴巾-z醐区球曲醐逸 -oooo i _ e o o o 链z 将谧 将 据眯a氅精龌链酶磐甾聪扭 籍晡律4斑)蓍剁a甾骊橡a甾蝻器箭季龌 锱 菩垛 裔蝻区将 求餐临毹随纠口詹 嚣求掣椰吲窨求镁收旃靛钲醐腻毒带v眯姆拳螺繇籀酋- 呷n 噼 议嵇掣扑书匿扑k怔h 第二章m a i l l a r d 反应型可可香料的研制 2 4 3f r i e d m a n 排序检验法评价均匀试验设计的反应产物的结果 表2 - 7 7 名评香师对5 个样品的捧序表 如表2 7 ，通过比较五种样品的秩和对样品之间是否具有显著性差别作出评价。根据2 3 8 中的 公式计算得到，f = 1 8 5 1 4 3 。查附录1 可知，在o 0 l 显著水平上，临界值g t ( 5 ，7 ) = 1 3 2 8 f = 1 8 5 1 4 3 ， 因此可以判定样品之间存在显著性差异，从而证明了感官评价的有效性。 2 4 4 均匀设计优化试验的结果分析 均匀设计能够让试验点在试验范围内充分均匀分散，给试验者更多的选择，从而有可能用较少 的试验次数获得期望的结果。m a i l l a r d 反应制备可可香料，操作因素的范围需要考虑得较为宽泛， 所以选用均匀试验设计优化反应型可可香料的操作参数是非常合适的。 将表2 - 8 中的均匀试验设计的感官评价结果，采用s a s 软件进行逐步线性回归分析，各因素的 交互项和平方项未见显著性，故得到回归方程为： y = 0 6 9 x 1 - 0 6 1 x 2 - 0 6 3 5 x 3 3 2 7 6 。经过方程的检验分析，p - - 0 0 3 5 4 l o m i n