（植物学专业论文）脱水胁迫导致的植物细胞质外体和细胞微环境的改变.pdf

山东师范大学硕士学位论文 脱水胁迫导致的植物细胞质外体和细胞微环境的改变 摘要 植物的生命过程经常要受到各种环境胁迫导致的脱水胁迫的影响。脱水胁迫 导致植物细胞质外体和细胞微环境的改变，这种改变会对植物细胞的生理过程产 生各秘次生作用。这种改变目前很少受到人们的关注，可能主要是由于受到研究 手段的限制。本研究对比了各种研究植物细胞质外体和细胞微环境的离子变化的 测定方法，参考压力槽挤压法和灌注淋洗法并加以改进，进行了一种加压灌流 法抽提叶片质外体溶质的方法的探索，并应用这一方法对脱水胁迫导致的植物细 胞质外体和细胞微环境的改变进行了初步的分析研究。这种抽提方法是利用压力 室模拟产生人工根压，连续反复3 次将蒸馏水压入植物细胞间隙，然后通过与测 定植物组织水势相同的方法反向加压将压入细胞间隙的蒸馏水压出，从而将细胞 间隙溶液中的溶解物质冲洗出来，接下来迸一步分析洗出液的物质成分和含量。 实验表明，加压灌流法抽提叶片质外体溶质的方法能较好地抽提植物细胞间隙的 可溶性物质，同时又避免引起细胞的伤害导致细胞内容物流出，这种方法克服了 通过真空渗入后造成的植物细胞缺氧伤害，也避免了高速离心植物组织造成的机 械伤害和细胞内含物的泄露对叶片质外体溶液的干扰和混杂对叶片质外体溶质 的影响，使所得到的细胞外溶质具有较高的纯度，为未来进一步分析细胞外溶液 中的酶或其它有代表性的质外体具生物活性物质的分析奠定了基础。通过对脱水 胁迫导致的植物细胞质外体和细胞微环境的改变进行的分析表明，连翘 ( f o r s y t h i as u s p e n s et t u n b ) v a h l ) 和冬青卫矛( e u o n y m u s j a p o n i c u st h u n b ) 在 受到不同程度脱水胁迫时，叶片细胞随着脱水胁迫强度的加大细胞离子的外渗的 累计量也在不断加大，但细胞内离子外渗的速度在不同的区间内并无显著的改 变，即细胞膜的透性在所测范围内没有明显的改变。这一结果和传统认为的植物 在受到各种环境胁迫时细胞膜透性增大的理论有很大的不同，即传统理论认为的 在脱水胁迫条件下植物细胞膜透性的增加只是所测定细胞间隙溶出液电导率的 增加，它反映的是离子外渗的量随胁迫的不断进行造成的累积性增加而不是细胞 膜的透性的增加。虽然脱水胁迫同时造成了叶片质外体和共质体溶液中钠、钾离 子浓度的增加，但质外体比共质体溶液中钠、钾离子浓度的增加更高，导致了细 胞内外离子浓度梯度的改变和离子平衡膜电位的改变。这也说明，连续不断的脱 山东师范大学硕士学位论文 水胁迫造成细胞微环境的明显改变，使细胞内外的离子梯度变小甚至梯度逆转， 导致包括细胞内外离子平衡的膜电位的改变和逆转，细胞膜电位的去极化。这些 改变有可能引起细胞的次生生理改变并有可能与植物的抗性有关。 关键词：连翘；冬青卫矛；脱水胁迫；质外体；离子浓度：膜电位 分类号：q 9 4 5 7 8 山东师范大学硕士学位论文 t h ei m p a c to fd e h y d r a t i o ns t r e s so nt h e a p o p l a s t sa n dt h e m i c r o e n v i r o n m e n to fc e l i si np l a n tl e a v e s a b s t r a c t t h el i f ep r o c e s so f p l a n t si so f t e ns u b j e c t e dt ov a r i o u se n v i r o n m e n t a l s t r e s s e s o n eo fs u c hs t r e s si sd e h y d r a t i o ns t r e s st h a t r e s u l t s i nt h e c h a n g e si nt h ea p o p l a s t so rm i c r o e n v i r o n m e n t so fc e l l s ，l e a d i n gt o s u b s e q u e n ts e c o n d a r yc h a n g e si nt h ep h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e so fp l a n t c e l l s h o w e v e r , t h ei s s u eh a sa t t r a c t e dl i t t l ea t t e n t i o nu pt on o w , p e r h a p s d u et ot h ei a c ko fac o n v e n i e n ta n dr e l i a b l em e t h o d f o rt h i sr e a s o n ，w e h a v em a d ea l l a p p r o a c ht ot h ed e v e l o p m e n to fan o v e lo rm o d i f i e d m e t h o dt oi n v e s t i g a t et h ec h a n g e si nt h ec o n c e n t r a t i o no fa p o p l a s t i ci o n s u n d e rd e h y d r a t i o ns t r e s s t h ep r i n c i p l eo ft h em e t h o di sac o m b i n a t i o no f a p o p l a s t i cp e r f u s i o nw i t hb i d i s t i l l e d w a t e ra n dt h ep r e s s o u to ft h e a p o p l a s t i cs o l u t i o nm i x e dw i t ht h ep e r f u s e dw a t e r , w i t ht h ea p p l i c a t i o no f ap r e s s u r ec h a m b e rc o m m o n l yu s e di nt h ed e t e r m i n a t i o no fp l a n tw a t e r p o t e n t i a l i np r a c t i c e ，t h ep l a n tt w i g sb e i n gi n v e s t i g a t e dw e r ef i r s t s e a l e di n t ot h ep r e s s u r ec h a m b e rw i t ht h ec u te n di nt h ec h a m b e r i m m e r s e di nb i d i s t i l l e dw a t e rf i l l e di n t ot h ec h a m b e ri na d v a n c e ，w i t ht h e l e a v e so nt h et w i gp r o t r u d i n gt ot h ea t m o s p h e r e ，t h e nt h ec h a m b e rw a s p r e s s u r i z e dt of o r c ew a t e ri n t oa 1 1t h el e a v e so nt h et w i gi nt h es a m ew a y a st h er o o tp r e s s u r e a f t e r w a r d st h et w i gw a st a k eo u tf r o mt h ec h a m b e r a n d p u tu p w a r dd o w ni n t ot h ec h a m b e ra g a i nw i t i lt h ec u te n d o ft h et w i g p r o t r u d i n gt ot h ea t m o s p h e r e ，t h e nt h ec h a m b e rw a sp r e s s u r i z e dt op r e s s t h et h ea p o p l a s t i cs o l u t i o nm i x e dw i t ht h ep e r f u s e dw a t e ro u to ft h ec u t e n d t h em e t h o dh a st h ea d v a n t a g e so fb o t ht h em e t h o d so fp r e s s u r e s q u e e z ea n dv a c u u mi n f i l t r a t i o n ，b u th a se l i m i n a t e dt h ed i s a d v a n t a g e so f t h ei n j u r i e sc a u s e db yo v e rp r e s s u r i z a t i o na n da n o x i a i nt h i sw a yt h et h e i 稍 山东师范大学硕士学证论文 i m p a c to fd e h y d r a t i o ns t r e s so nt h ea p o p l a s t sa n dt h em i c r o - e n v i r o n m e n t o fc e i l si np l a n tl e a v e si n f o r s y t h i as u s p e n s e ( t h u n b ) v a h la n d e u o n y m u sj a p o n i c u st h u n b 。w e r es t u d i e da n da n a l y s e d t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h el e a k a g eo fe l e c t r o l y t e sf r o mc e l l st oa p o p l a s t i cs p a c e s i n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s ei n t h ei n t e n s i t yo fd e h y d r a t i o ns t r e s s h o w e v e r , i nc o n t r a s tt ot h ec o n v e n t i o n a lv i e wt h a td e h y d r a t i o ns t r e s sw i l l r e s u l ti ne n h a n c e dp e r m e a b i l i t yo fp l a s m am e m b r a n e ，o u rr e s u l ts h o w e d t h a tt h er a t eo fe l e c t r o l y t el e a k a g ed i dn o ts h o ws i g n i f i c a n tc h a n g ei nt h e d e h y d r a t i o np r o c e s s ，a l t h o u g ht h ea m o u n to fs o d i u ma n dp o t a s s i u md i d i n c r e a s ew i t he l e v a t e dd e h y d r a t i o nl e v e l s t h es t e p w i s ea n a l y s i ss h o w e d t h a tt h ei n c r e a s ei na p o p l a s t i ci o n sw a sd u et ot h ea c c u m u l a t i o no fi o n si n t h ee f f i u xf o l l o w i n gt h ed e h y d r a t i o np r o c e s sr a t h e rt h a nt h ee n h a n c e d p e r m e a b i l i t yo fp l a s m am e m b r a n e a l t h o u g hd e h y d r a t i o ns t r e s sr e s u l t e d i nt h ei n c r e a s e si ns o d i u ma n dp o t a s s i u mc o n c e n t r a t i o n sb o t hi nt h e s y m p l a s t sa n da p o p l a s t so f b o t hp l a n t s ，t h ei n c r e a s e si nt h ea p o p l a s t sw e r e m u c hf a s t e r , l e a d i n gt ot h ea l t e r a t i o no ft h ei o ng r a d i e n ta sw e l la st h e s h i f to fm e m b r a n ep o t e n t i a la c r o s st h ec e l lm e m b r a n e t h e s ec h a n g e s m a yb r h 培s e c o n d a r yp h y s i o l o g i c a lc h a n g e st op l a n t su n d e rd e h y d r a t i o n s t r e s s k e yw o r d s ：f o r s y t h i as u s p e n s a , e u o n y m u s j a p o n i c u s ；d e h y d r a t i o ns t r e s s ； a p o p l a t ；i o nc o n c e n t r a t i o n ；m e m b r a n ep o t e n t i a l c a t e g o r yn u m b e r ：q 9 4 5 7 8 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所傲的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 一 学位论文作者签名： 朝倦 导师签字： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂撞：可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：刘翻溶 签字日期：2 0 0 7 年6 月力日 二一 导师签字：雹，舀山 签字日期：2 0 07 年6 月。日 山东师范大学硕士学位论文 l 文献综述 1 1 质外体及其作用 质外体构成了植物细胞外部的徼环境。它在地上器官和根皮层的组织体积中 仅占5 或更少f 1 一，但它在植物生理方面有着不可低估的意义。植物质外体包括 细胞壁和细胞间隙部分，细胞壁以纤维索构成框架，一些化合物围绕着纤维素纤 丝并将它们粘连在一起。这些化合物包括半纤维素、糖蛋白和果胶质等。次生壁 还含有大量的木质素。果胶的半乳糖醛酸的羟基离解而带负电荷，致使细胞壁具 有一定的阳离子结合量，能够吸附一定量的离子，因为这种吸附力相对较弱，同 时质外体中生物大分子的间隙较大o o o h ) ，水分和溶质分子在其中能自由扩散 p 】。因此，质外体中吸附的离子很容易与外界进行离子交换。这部分空间称为水 分自由空间( w a t e r f r e es p a c e ，w f s ) 。达到扩散乎衡时，组织内的自由空间的溶 液与外液浓度相同。与水分自由空间相对应的是杜南自由空间( d f s ) 。d f s 涉及 自由离子位于离子化的固定电荷静电场范围内，它以存在不扩散阴离子吸收阳离 子并使之不再自由扩散为前提【4 】。扩散平衡后组织内自由空间的溶液比外液浓度 要高得多。存在于杜南相的空间溶质数量不反映空间体积大小，只反映衬质材料 上羧基的多少，即带电量多少。虽然人们习惯于将质外体分为d f s 和w f s ，但 d f s 和w f s 并没有截然的界限，因为静电相互作用随带电聚合物的距离变远而 逐渐消失。d f s 在某种意义上取决于离子化电荷的浓度和介质中的离子强度。 d f s 的体积是可变的，除了因为含木质化的材料外，还因为带电聚合物间静电作 用或介质和自由空间渗透梯度变化均可改变细胞壁物质的膨胀状态，使d f s 体 积发生变化( 5 1 。由于质外体溶液和质外体物质的上述特点，使得质外体对于细胞 来说有着多重的作用。 1 1 1 离子库作用 。 质外体体积很小，膜净流量的小变化就可引起质外体溶质浓度的大小变化， 所以说溶质运进或运出质外体是快速调节膨压的易行方式【2 】。某组织质外体中存 在一定量的离子就可及时、迅速地满足其生理活动需要，另外还具有一定的屏蔽 效应。据估计保卫细胞及相邻细胞的质外体体积可能包含1 qp m o l 的固定阳离 子，这些数据说明气孔周围的质外体的离子库作用，它提供了用于气孔运动相当 的k + 离子。质外体的这种库功能在保卫细胞得到了很好说明；气孔开放时，i ，+ 山东师范大学硕士学位论文 离子从表皮细胞转移到保卫细胞，气孔关闭，k + 向相反方向转移；在鸭跖草的表 皮带中，气孔受光启动开放时，来源于保卫细胞的旷瞬时地使质外体p h ( p h w c ) 降低2 个p h 单位，产生的跨膜电化学势差驱使k + 的吸收。当气孔关闭时，保卫 细胞和周围的表皮细胞呈稳定的p h 中性1 6 。 豆科植物小叶的感性运动是由于伸张细胞和屈缩细胞彼此膨压相反变化引 起的，发生在两组细胞间的k + 离子大幅度变化是原因之一，当然也与矿在细胞 和质外体的诤流动有关 7 1 。有人对菜豆p h a s e l o u s 叶枕的伸张和屈缩细胞切向壁 进行研究，发现膨胀状态叶枕细胞具有k + 离子的最低质外体水平，而在胞内却 达到k + 的最高水平；另一方面，当叶枕细胞缩小时，胞外k + 浓度增加2 倍，同 时伴随胞内k + 的减少。进而总结出叶片运动过程中，细胞得到或失去的3 0 - - 4 0 0 , 的k + 源于原生质体和邻近质外体的穿梭运动，其余6 0 7 0 贝j j 与更远的组织进行 交换嘲。 叶枕质外体区域k + 的积累被商浓度的负的固定电荷所易化，尤其在运动细 胞的细胞壁中更是如此。比较在伸张细胞的细胞壁中伴随细胞膨胀时质外体p h 的变化，以及这些细胞壁中固定电荷的滴定曲线，可计算出在酸化作用期间有一 半阴离子基团质子化，由质子化作用所屏蔽的固定电荷的数量接近从质外体消失 的k + 的数量【9 】。 1 1 2h + 共运 旷共运不同于简单的扩散和杜南电势引起的离子吸收，是一种耗能的过程。 一般由a t p 酶催化分解a t p 提供能量，主动将f + 分泌至质外体，增加质外体 i + 的电化学势，使一些离子通过h + 共运方式吸收。许多种轮藻在碱溶液中应用 i - i c 0 3 - 进行碳同化，它们的节间细胞表面至轴向形成交替的酸带和碱带，酸带区 域吸收h c 0 3 ，细胞通过酸带处膜上的h + - a t p a s e 释放h + 到质外体中，因而产 生跨膜的电化学势差，这样h c 0 3 便可与旷通过共运方式进人细胞质而完成碳 的固定；碱带主要分泌由细胞质产生的o h ，以保证h + - a t p a s e 释放旷到质外 体中的作用顺利进行。显然轮藻吸收h c 0 3 ，是由主动分泌 i + 来协助进行的【1 0 1 。 王r 分泌诱导的p h 转变值取决于王r 的转运速率和细胞壁对矿扩散的阻力两 个因素。已了解的几种解剖结构的变化似乎可以把适于高速率分泌 r 的条件与 未搅动层( 层流流动受液体与固体表面相互作用而限制的介质区域) 对一分泌 2 山东师范大学硕士学位论文 的高阻力结合在一起。这种结合可能保持局部的质外体p h 在较低水平，而不受 外界p h 大幅变化的影响，这有利于舻共运的正常进行。在伊乐藻属e l o d e a 和 眼子菜属p o t a m o g e t o n 转移细胞的细胞壁的凹入部分就具有一部分这样的功能 【1 ”。此外，这种功能也见于f e 2 + 胁迫下的植物根转移细胞和膨胀根尖等【1 2 1 。 1 1 3 质外体p h 和酸性生长 经典的酸生长理论认为：i a a 通过促进主动矿分泌来酸化质外体，因而增 加跨膜的电势差和增加k ，的吸收，并加速与细胞壁松弛和细胞膨大有关的活化 作用【1 3 1 ，进而促进细胞的生长。在保证 r 电极和细胞壁有良好的接触时，可以 观察到质外体的酸化和i a a 促进的生长启动之间有准确的一致性。支持这个理 论的实验事实是：外源的舻离子可以部分地模拟i a a 对与细胞膨大有关的细胞 壁松弛效应。 但是关于酸生长理论还有两种争论。第一，真正启动自然条件下的细胞壁膨 胀的质外体p h 值没有取得一致数据。第二，不能肯定p h 是调节i a a 的效应物， 或是i 茂a 和p h 额外地对细胞壁延伸起作用。 嘴 当把细胞壁置于张力和酸诱导膨胀条件下表现出两个阶段变化初始突发 阶段和紧接的速率稳定的膨胀过程。前者随时间呈指数性衰减，后者持续凡小时 速率不变并有可能参与细胞延伸过程。这种长时期伸长在p h 6 时受到促进。在 黄瓜下胚轴和燕麦胚芽鞘的分离细胞壁中，发现p h 4 时伸长达到最大值 1 4 , 1 5 1 。 另外有人用活体玉米胚芽鞘片断通过外源缓冲剂控制质外体p h 值，发现生长速 率显著增加发生在p h 4 5 时，生长速率达最大值在p h 为2 5 时。还有人观察到 在不同p h 下，外加i a a 导致不育玉米胚芽鞘初始伸长的连续增长，甚至在p h 值不允许酸诱导生长的条件下也是如此。因此，比较酸诱导与l a a 诱导的细胞 生长并不能得出生长组织中质外体p h 的一个估计值，这也许可以说明旷离子并 不是细胞壁膨大中l a a 活动的唯一调节者【1 4 15 1 。 1 1 4 细胞膨大和水分运输 生长组织的细胞表现膨大伸长来自于水分吸收，从而产生静水压力作用于细 胞壁使其延伸。另一方面亦需要生长素诱导的细胞壁本身软化过程。就吸水来说， 木质部的水分运到生长组织必需有一定的水势梯度。生长组织具有低水势的典型 是0 3 m p a 。假设这一数值代表了水分运动驱动力大小，由其引起的水分运进伸 山东师范大学硕士学位论文 长细胞将是有限的。这一限制不是由驱动力本身造成，而是水分通过组织产生的 阻力造成的【1 6 1 。 c o s g r o v e 等推理如果0 2 5m p a 的水势能维持豌豆茎快速生长所需要的水流 量，那么生长速率应与高水势和高膨压有关。他们应用压力探针测定鲜豌豆苗的 膨压，以及通过杀死、低温、迭n 化合物及生长素施用等不同方法改变生长速 率，这些处理改变生长速率达2 0 倍，然而组织的膨压和水势几乎不受影响。膨 压的最大变化是0 0 5m p a 。相关的实验也显示导水率在不同的生长速率下是相 同的。于是他们想到自由空间溶质量的变化可能与生长组织的低水势有关，他们 的实验显示豌豆茎顶端细胞壁溶液的渗透势较高，而基部渗透势较低。这些研究 的结论是生长组织的水势很低，用很小的水势梯度就能维持生长所需的水流量。 这解释了生长组织通常为低水势的原因【1 7 1 。 质外体参与水分和离子的吸收运输，也参与同化物的运输。由于它没有原生 质层及其他屏障阻挡，物质移动在开放系统中进行，所以运输速度很快，基本是 物理过程。植物组织对溶质吸收之所以表现为初期很快，而后逐渐缓慢，原因是 由于溶质先经过自由空间的快速运动，而后才通过原生质膜向胞内积累【l 踟。 1 1 5 胞外酶的活性 如上面讨论的那样，排列于细胞壁上的酶可能处于由细胞壁和膜表面固定电 荷产生的静电荷的活性范围内。如果底物或效应物被离子化，那么这种束缚酶的 表观动力学行为将依赖于细胞壁的静电性质。更进一步说明胞外酶的行为可能源 于局部p n 值对这些酶结合到细胞壁上的效应，这可控制胞外酶的动力学参数和 稳定性。例如，悬铃木属s y c a m o r e 和大豆细胞胞外磷酸酶表现出细胞壁固定电 荷对阴离子底物的静电排斥效应。这些酶当纯化为可溶形式时，表现米氏动力学； 当束缚到细胞壁上时，表现出明显的合作活动。当细胞壁的静电电荷由于移除 c a 2 + 而增加时，合作性受促进；如果静电场被高离子强度屏蔽时，合作性则消 失【1 9 1 。在携带一种离子化的底物和产物的酶的带电表面附近，扩散和静电现象 的复杂表现可产生底物和产物浓度的不稳定性，并蔓延至表面。这些过程可从大 豆细胞生长的模型得到说明，大豆细胞生长过程包括由纤维素微纤丝滑动调节的 壁延伸阶段，紧接着是部分半乳糖醛酸甲基酯的水解作用阶段，这两步是拮抗的。 就细胞壁的静电性质来说，壁的电荷密度在第一步减少而在第二步表现增加，在 4 i i j 东师范大学硕士学位论文 p h s 8 范围内参与延伸的酶由于降低p h 而被活化，同时果胶甲基酯酶受抑制。 这种系统的理论分析指出，这两组酶系活性的互相控制是由质外体p h 的变化调 节的，质外体p h 的变化则是两个阶段的细胞壁在电荷密度上的相反变化的结果 刚。 1 1 6 质外体与植物抗逆性的关系 质外体也是植物细胞与外部环境进行物质交换的缓冲区，对调节细胞内外的 物质运输、营养平衡有重要作用。当植物的环境发生改变时，首先是引起植物细 胞的微环境的改变。植物细胞的微环境( 质外体) 由于体积小，微小的化学或物 理变化就能引起它的显著改变。由于细胞在其生命过程中一直与其微环境处在动 态平衡和物质交换过程中，园此植物细胞的徼环境的改交将迅速引起细胞内部的 生理变化。特别重要的是，当植物受到干旱胁迫时，质外体会发生强烈的变化。 首先，由于植物在有膨压时质外体溶液的渗透浓度永远小于细胞浆的渗透浓度， 当受到干旱胁迫的植物组织失水而导致水势下降时，组织的质外体将不能从细胞 得到有效的水分补给，结果是整个质外体的溶液体积变小，质外体的水空气界 面向细胞壁内部的微孔退缩，产生更高的张力，并将这一张力经过活细胞传递给 木质部导管中的溶液。另一方面，质外体的溶液体积变小的结果是质外体溶液浓 度的拜高，造成细胞内、外离子浓度差或浓度梯度的改变。由于细胞膜的膜电位 取决于膜两侧的离子浓度比，因此细胞内、外离子浓度差或浓度梯度的改变将导 致细胞膜电位的改变。然而，正常的细胞通常要维持正常的生理膜电位，才能够 维持正常的物质运输和其它的生理过程。目前已知由i - f - a t p 质子泵产生的膜电 位不仅能够驱动细胞内外离子、有机酸、糖等溶质的运输f 2 1 2 2 1 ，也能直接影响细 胞p h 、气孔开闭、同化物在韧皮部的装载以及景天酸代谢植物的苹果酸运输等 生理过程田】。 l 。l j 质外体是植物细胞的重要信号源 新近的研究还表明，质外体是植物细胞的重要信号源。当植物遭受生物或非 生物环境刺激时，可能首先引起质外体信号系统的变化并传递到近邻的细胞，因 而质外体在细胞间信号传递和信息交流上起重要作用，从而成为协调植物细胞分 化、器官形成和整体生长发育的决定性因素之一【硼。 1 1 8 质外体作为病原体侵害的接触点 山东师范大学硕士学位论文 质外体对防御真菌的侵入起着主要作用。这里既是产生用以诱导防御反应信 号的部位，又是与防御有关的化合物积累的部位。矿质元素营养对质外体的结构 和生物化学有决定性的影响，丽质外体又对植物抵御瘸原侵入有很大作用。ca _ “ 参与了用于分解果胶质的酶活性的调节，这样可形成一个果胶质结构，并能诱导 具有防御作用的化合物局部或系统地在质外体中积累。硅可以增加抵御病原菌和 有害病虫入侵的阻力，形成抵御侵入的障碍，并可活化酚类的物质代谢。此外， 叶面施硫酸盐、磷酸盐、和碳酸盐在不同植物上可活化抵御许多病害的防御机制 嘲。 近年人们还发现了某些质外体蛋自在植物抗冻性中的作用，这些蛋白质分子 有显著的抑制冰晶形成的作用。从经过低温锻炼的黑麦叶片细胞间隙提出的蛋白 质，在渗透压计的冷冻或融冰过程中能抑制冰晶的生成、大小和形状。目前，虽 然这些蛋白质分子抑制冰晶形成的机瑾尚不明了，但由于蛋白质分子能抑制冰晶 形成，这就使植物组织和细胞在较低的温度下仍然保持处在过冷态的低温液相， 直接避免了组织的冻害。另外，细胞运输中质外体作用、运动细胞中快速大量的 离子转移也与质外体有关。 由于质外体在植物的生命过程中的这些重要作用，质外体的研究越来越受到 人们的关注。人们对质外体的研究焦点也从根细胞转移到地上部分，从阳离子交 换转到质外体p h 、k + 及渗透活性溶质。另一方面化学渗透假说的传播和酸生长 理论的发展促进人们对细胞表面p h 给予关注。同时，也由于质外体在植物的生 命过程中的这些重要作用，经过人们的不断努力，发展出了很多的质外体研究测 定方法。 1 2 质外体的研究方法 1 2 1 植物地上部质外体的测定方法 在质外体的研究中，根系质外体已有很多成熟的方法，并取得较多成果，两 植物地上部质外体的研究方法相对较少，且不很成熟。 1 2 1 1 差减法 、 此方法是利用常规的湿灰化法分别将完整的叶片和分离出的原生质体内各种 元素提取出来，然后用邻二氮杂菲( p h e n a n t h r o l i n e ) 测定，二者的差值就是质外体 内元素的含量【坷。应用此法时需要对原生质体较好地分离和准确定量，否则将 6 山东师范大学硕士学位论文 会影响质外体内成分含量，造成误差。 1 2 1 2 汁液提取法 质外体汁液的提取方法大致可分为淋洗法和离心法两大类。须先提取质外体 内的成分，然后再进行测定。 1 2 121 淋洗法淋洗法包括灌注淋洗法和溶质扩散法。 ( 1 ) 灌注淋洗法：此方法是1 9 7 0 年b e m s t e i n 2 7 1 提出的，试验选用了两面均分布 气孔的大叶片。用去离子水淋洗叶片的一面，然后用真空抽滤的方法将水分从叶 片的另一面气孔抽出，以试管收集滤液。此方法可以连续获得较多的滤液。但这 种方法未考虑到抽滤速率对细胞膜破坏引起的质外体污染。因此，在试验过程中， 需检测提取液中胞内酶的活性，以估测提取过程中所造成的污染程度。此外，淋 洗液会稀释质外体汁液，导致测定质外体p h 等项目时不易得到理想的结果。此 法需在低温下进行，以避免光合作用对质外体汁液组成的影响。为了保持质膜稳 定性，也可以用c a s 0 4 溶液代替去离子水淋洗液，但这可能对某些测定结果产生 v 影响。7 实验过程中需保证装置的良好密闭性，以防止灌注用去离子水渗漏造成误 差叨。 。 此法同样可用于茎部的质外体汁液的提取。选取完整植株或茎切段，在压力 的作用下淋洗液从完整植株茎部气孔溢出，或从切段的切1 2 1 泌出，用试管收集即 可。此法操 乍简便，目前应用较多。 j ( 2 ) 溶质扩散法：1 9 9 0 年l o n g 和w i d d e r s 采用此方法成功地测定了叶片质外体 中钾离子的含量。将叶片的表皮去除后，质外体中的离子扩散到淋洗液中，根据 离子扩散量和扩散时间的相关性计算出钾离子的含量。此法适用于易剥离表皮的 植物叶片以及质外体中易扩散的离子( 如k + 、n a + 等) 的测定，操作简便，不需要 很精密的仪器，具有简单实验设备的实验室即可应用。但受温度影响很大，并且 测定对问较长。 1 2 1 2 。2 离心法离心法可分为直接离心法和压力槽挤压法。 ( 1 ) 直接离心法：将植物材料( 茎段或叶片) 置于特定容器( 如针管) 内，经过离心， 可收集到质外体汁液。通过测定苹果酸脱氢酶的活性，来选取最佳离心时间和最 佳离心力，以减少切1 2 1 胞浆造成的污染。1 9 8 0 年t e r r y 等人用此法成功地提取了 豌豆质外体汁液。用酸溶液淋洗豌豆幼苗的茎段切口后，在离心力的作用下，使 7 山东师范大学硕士学位论文 质外体的汁液分离出来。他们发现，离心力在5 0 0 - - - 3 0 0 0 x g 范围内，细胞膜几乎 未受到损坏，膜内渗出物质污染小于1 5 ，计算时可以忽略不计。 d a n n e l 等【2 8 l 于1 9 9 5 年也用此法收集了叶片的质外体汁液。他们的试验表明， 在2 0 0 0 2 5 0 0 g 离心力下、离心1 5 m i n 后收集到的汁液，其酶活性趋于稳定，污 染小于1 。此法能够直接快速收取比较纯净的质外体汁液，是目前提取植株叶 片汁液较好的方法。 ( 2 ) 压力槽挤压法：j a c h c 钍a 【2 9 】利用密闭器中的高压气体对叶片进行挤压，以收 集从叶柄渗出的质外体汁液。试验证明，在o 2 4 加3 4m p a 的压力范围内收集的 汁液主要是细小的叶脉中流出的，它们基本上可以代表质外体汁液。为了比较准 确地判断收集的汁液是否是质外体汁液，最好是以测定指示酶( 如苹果酸脱氢酶) 活性加以验证。这种方法能够得到较纯净的质外液，但操作繁琐，需用的仪器要 求严格，所提取的汁液受细胞污染的可能性大，但比较适合于研究植株叶片不同 部位质外体汁液组成的变化。 1 2 2 植物根系质外体测定方法 目前，在根质外体的研究中，最常用的方法是代换法【3 0 1 。其基本原理是：根 系质外体空间受到大量非扩散性负电荷影响后，离子进入自由空间的种类和数量 服从道南( d o n - n a n ) 平衡的规律。此法可以用于测定根系阳离子交换量、阴离子 吸附量和根自由空间的养分含量。 1 2 2 1 阳离子交换量的测定 首先制备氢质根，就是用h + 取代吸附在根表面的可交换阳离子，然后用中 性盐( p h 7 0 的1t 0 0 1 l 1k c l 溶液) 取代可交换的矿，根据矿浓度的变化计算根 系阳离子交换量，用0 0 1t 0 0 1 l 1 k o h 滴定至p h7 0 。制备氢质根可以用淋洗法 或电渗析法。前者以h c i 作为代换剂制备氢质根；后者则是利用电渗析的原理， 通过半透膜除去根系上的游离电解质和吸附的离子，丽制成氢质根。试验中可以 选用新鲜材料或干根，制成的根放置时间不宜过长；用k o h 滴定的时间一般控 制在5r a i n 内，否则会影响测定结果。此外，植物的生理年龄对测定值也产生一 定的影响，通常单子叶植物苗龄以3 0d 左右，豆科植物苗龄以2 5d 左右为好。 1 2 2 2 阴离子吸附量的测定 根表面吸附的阴离子可以用一定浓度的o h 或有机酸取代，也可以用阴离予 山东师范大学硕士学位论文 交换树脂进行交换，一般多用o 1t 0 0 1 l 1n a o h 溶液作为代换剂。试验中应选 用新鲜的根作为材料，对代换剂的浓度应严格控制，浓度过高将导致细胞死亡； 取样部位应力求一致；培养介质的p h 不能超过6 0 ，否则代换值将偏低。 1 2 2 3 根自由空间养分含量的测定 根自由空间的可扩散离子与沉积或吸附在自由空间的金属离子的测定方法 不同。可扩散离子测定是选用新鲜的根系为实验材料，用蒸馏水将离子浸提出来。 整个过程在4 c 的低温下进行，以降低根系代谢活力；样品处理时间不宣太长， 对根的伤害应降到最低程度，否则测定结果偏高。可交换的金属离子则用 n a - e d t a 交换出离子。实验用植株的苗龄一般为7 3 0 d 。获得的溶液用常规方 法测定其中元素的含量。代换法测定的结果受代换剂的影响较大，代换剂的浓度 和代换时间都会影响结果。 虽然目前普遍采用提取质外体汁液的方法测定质外体内的各种成分，但是这 些方法存在不少缺点，如提取过程中提取液易受到污染；质外体组分会发生变化； 只能提取易溶性的物质；无法对局部质外体进行定位研究等。这些问题常给研究 工作带来很多困扰。可采用直接测定一定位质外体的方法。 1 2 3 质外体的还原测定法 根、叶质外体中的某些微量元素( 如铁) 可以通过还原的方法进行测定。 1 2 3 1 根质外体铁的测定 用2 - 2 联吡啶- 连二亚硫酸钠( n a 2 s 2 0 4 ) 将质外体中的f e ( i i i ) 还原为f e ( i i ) ， f e ( ) 与2 2 联吡啶螯合可生成红色的螯合物。通过比色的方法测定f e ( i i ) 联吡 啶的吸光值，换算出含铁量。此法可以直接测定出根质外体的含铁量，但在测定 过程中不可避免会由根表面吸附的铁造成一定的污染。这是目前测定根质外体铁 常用的方法。 1 2 3 2 叶片质外体铁的测定 此法由s i j m o n s 于1 9 8 6 年提出【3 l 】。利用b p d s ( b a t h o p h e n a n - t h r o l i n e d i s u l f o n i e a c i d ) 将f e ( 1 l i ) 还原为f e ( i i ) ，生成f e ( b p d s ) 3 进行比色，通过换算常 数m e c = 2 2 5 0 0 ，换算出铁含量。此方法可以直接测定叶片质外体中铁的含量， 是目前较常用的。还原法步骤比较简单，能很好地反映植物的正常生理状况，在 植物含铁量测定中应用比较普遍。 9 山东师范大学硕士学位论文 1 2 4 质外体空间体积的测定 为了进一步了解质外体的各种功能，质外体空间的研究也很重要。目前测定 质外体空间体积使用较多的方法有：1 4 c 甘露糖醇示踪法、硅油法、旋光法、染料 法等【3 2 】。1 4 c 甘露糖醇示踪法是最常用的方法。将擦去部分表皮的茎段在标记的 甘露糖酵中培养，根据甘露糖醇流出量确定自由空间水分的体积。此法测定值比 较准确，精确度较高，但是测定所需仪器价格较贵，并需要相应的防护措施。硅 油法是用于测定质外体内空气所占体积的一种方法。先后用水和硅油充满质外体 空间，利用硅油相对于水增加的质量和油的密度计算出空气体积的百分数。旋光 法是用糖( 如蜜二糖或果糖) 作为介质，培养植物细胞或其它种类的植物样品，按 照培养溶液的旋光度前后变化确定质外体空间的体积。 1 2 5 质外体原位测定法 1 2 5 1 压力钳技术( p r e s s u r e c l a m pt e c h n i q u e ) m a g n a n i 等人【3 3 】曾采用压力钳技术测定草莓根系质外体的水导度。此法是通 过外部加压使一定的水流由主茎木质部流入根系质外体，产生一定的静水压，然 后去掉外部压力，形成减压状况，于是根中水分从主茎木质部流出，从而收集汁 液。这种方法不仅可以测定根质外体的水导度，也可以测定根质外体的组分。但 此法也有某些不足，如会出现质外体汁液的稀释和质外体汁液组分不能被完全提 取出来等问题。 1 2 5 2 荧光探针和微电极技术 近几年，荧光探针和微电极技术发展迅速，也用于质外体的定位测定。如用 f i t c ( 异硫氰酸荧光素) 、l y c h ( 1 u e i f e ry e l l o w c h ) 等荧光物质测定或定位质外体中 的p h 值。由于荧光探针和微电极操作技术难度大，价格昂贵，目前还未广泛应 用于植物质外体的研究【3 卅。但普遍认为此技术有良好的应用前景。选择性微电 极技术是一种不仅能直接测定活的生物细胞或细胞器内的离子或分子活度，而且 能对相邻的位置、功能和代谢速率不同的特定微区细胞表面离子或分子流( f l u x ) 分别测定的电生理方法。具有操作简便、实时、非入侵性( 测定离子或分子流) 、 灵敏度高( 可达l o 1 2m o l e s c m 。2 s 1 ) 等优点。因为它是用微型化( 尖端直径为 o 5 5 1 2m ) 的离子或分子选择性电极直接对准样品测定，不同于其它化学测定 需取样品，所以能连续测定和自动监测，具有潜在的应用前景【3 4 1 。植物质外体 l o 山东师范大学硕士学位论文 作为矿质离子储藏、运输和反应的空间，对植物的生长至关重要，与很多重要的 生理功能都有关系。但是，由于研究方法的局限，相关研究进展缓慢。 1 3 本研究的目的和意义 本研究通过对细胞电解质外渗量以及离子含量的测定，分析质外体和共质体 溶液的离子总含量，根据共质体的渗透势和离子含量的比例关系以及细胞内外的 膜电位变化，了解不同水分状况下细胞的微环境的改变。 本试验结果对研究植物细胞受到脱水胁迫时细胞间隙中溶质和电解质渗出 量的增加是由细胞膜透性增大所引起，还是由于其他因素所造成的，将具有重要 的参考价值；同时通过了解植物组织受到脱水胁迫时细胞微环境的变化，以及分 析这些变化可能导致的次生生理反应，为进一步研究植物对水分胁迫的抗性提供 思路。 2 材料和方法 2 1 材料及基本处理方法 实验采用鲁东大学校园内5 月中旬至5 月底同一地方露天生长的木本植物卫 矛科的冬青卫矛( e u o n y m u s j a p o n i c u st h u n b ) 和木犀科的连翘( f o r s y t h i a s u s p e n s e ( t h u n b ) w i n ) 的当年新生健康枝条作为材料，经过反复加压灌流并用 一 压力室冲