（动物学专业论文）小鼠双尾c基因克隆、bicc1蛋白多克隆抗体制备及初步应用.pdf

内蒙古人学顾十学位论文 缩略语 m d c k i m c d 3 g 3 p d h h e p e s t e m e d i p t g d a p i d e p c e d t a p v d f p m s f p a g e b s a f b s p c r s d s d - m e g s t d a b t m b p f a p b s r t o d r p m 英文缩略语 英文名称 m a d i n - d a r b yc a n i n ek i d n e y i n n e rm e d u l l a r yc o l l e c t i n gd u c t g l y c e r a l d e h y d e s - 3 - - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e h y d r o x y e t h y lp i p e r a z i n ee t h a n e s u l f o n i ca c i d t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e i s o p r o p y lp d t h i o g a l a c t o s i d e 4 ，6 - d i a m i d i n o 一2 - p h e n y l i n d o l e d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a c e t i ca c i d p o l y v i n y l i d e n ef l u o r i d e p h e n y l m e t h y ls u l f o n y l f l u o r i d e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s b o v i n es e r u ma l b u m i n f e t a 】b o v i n es e r u m p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 1 3 - m e r c a p t o e t h a n o l g l u t m h i o n e s t r a n s f e r a s e d i a m i n o b e n z i d i n e t e t r a b e n z i d i n e p a r a f o r m a l d e h y d e p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e r e v e r s et r a n s c r i p t i o n o p t i c a ld e n s i t y r o t a t ep e rm i n u t e 4 中文全称 马达二氏犬肾细胞系 小鼠肾髓质集合管内层细胞系3 甘油醛3 磷酸脱氢酶 羟乙基哌嗪乙磺酸 n ，n ，n ，7 n - 四甲基乙二胺 异丙基一b - d 一硫代半乳糖苷 4 ，6 二脒基2 苯基吲哚二盐酸盐 焦磷酸二乙酯 乙二胺四乙酸 聚偏乙烯氟化物 苯甲基磺酰氯 聚丙烯酰胺凝胶电泳 牛血清白蛋白 胎牛血清 聚合酶链式反应， 十二烷基磺酸钠 p 巯基乙醇 谷胱甘肽巯基转移酶 3 ，3 二氨基苯联胺 四甲基联苯胺 多聚甲醛 磷酸盐缓冲盐水 反转录 吸光度 每分钟转速 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究j 二作及取得的研究成果。除本文已 经注明引川的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得凼墓直太堂及 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同1 ：作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：趣 日期：丛壁! 么：f 篁日期： 在学期间研究成果使用承诺书 心。 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：内蒙占火学有权将学位论文的全 部内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘，允许编入有关数据库进行检索， 也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。为保护学院和导师的知识产权，作者在学期 间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后使用涉及在学期间主要研究内容或研究成果，须征得内蒙古 大学就读期间导师的同意；若用于发表论文，版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表。 学位论文作者签名：煎垒友 日期：垄堡厶! 歹 指导教师签名： 日期： | | ： 戴宝贞小鼠双尾c 基因克隆、b i c c l 蛋白多克降抗体制备及初步心用 小鼠双尾c 基因克隆、b i c c l 蛋白多克隆抗体制备 及初步应用 摘要 双尾c 基因( b i c a u d a l - c ) 首先在果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 中被发现， 其功能丧失导致果蝇胚胎滤泡细胞的错误迁移、头部的缺失和双尾结构的形成。 多个物种都含有该基因的同源基因，其中小鼠同源基因b i c c l 的缺失导致小鼠产 生与人类多囊肾疾病高度相似的症状，但其具体功能还未知。 克隆小鼠b i c c l 基因( g e n e i d ：8 3 6 7 5 ) 是研究其基因产物功能的基础，本 研究以小鼠肾脏组织总r n a 为模板体外反转录为e d n a ，通过分段巢式p c r 及 酶切连接的方法获得了全长约3 k b 、无突变的小鼠b i c c le d n a 序列，并成功构 建其真核表达载体p c m v - t a g4 a - b i c c l 。 根据生物信息学分析结果，选择两个免疫原性较好的蛋白区段6 1 e 一1 9 9 a 和 7 11 q 8 5 8 d 作为抗原，p c r 扩增相应的小鼠b i c c l c d n a 编码片段，并成功构建 其原核表达载体；i p t g 诱导表达，回收并纯化融合蛋白g s t - b i c c l n 。h i s 6 和 g s t - b i c e l n h i s 6 ，制备两种兔抗b i c e l 蛋白多克隆抗体。 w e s t e r nb l o t 证实这两种抗体具有高度特异性，并用细胞免疫荧光方法及免 疫组织化学方法初步分析了该蛋白主要定位于鼠肾细胞的细胞质内，为进一步 研究b i c c l 基因产物的生物功能奠定了良好基础。 关键词：小鼠双尾c 基因，b i c c l ，克隆，原核表达，多克隆抗体 内蒙古大学硕i ：学位论文 c l o n i n go ft h em o u s e 昼，( ：移d 删c 一jg e n e 、 p r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no fa n t i b i c c1 p o l y c l o n a la n t i b o d y a b s t r a c t t h eb i c a u d a l - c i c og e n ew a sf i r s td i s c o v e r e di nd r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ， i t sn o r m a lf u n c t i o ni sr e q u i r e df o rc o r r e c tt a r g e t i n go ft h em i g r a t i n ga n t e r i o rf o l l i c l e c e l l sa n df o ra n t e r i o r - p o s t e r i o rp a r e m i n go ft h ed r o s o p h i l ao o c y t e m o u s eb i c c l g e n ei sah o m o l o g eo fd r o s o p h i l ab i c a u d a l - cg e n e ，w h o s em u t a t i o nc a u s e sa p h e n o t y p es e m b l e sw i t hh u m a np o l y c y s t i ck i d n e yd i s e a s e ，b u t t h ed e t a i l so f b i c cl i n v o l v e di nc y s t o g e n e s i sa r es t i l le l u s i v e h e r ew ec l o n e dt h ef u l l - l e n g t hc d n a s e q u e n c eo fb i c c lg e n eb y n e s tp c ra n dd i g e s t l i g a t em e t h o d s ，t h e nc o n s t r u c t e da r e c o m b i n a n te u k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i dp c m v t a g4 a b i c c l b a s e do nt h e b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i sr e s u l t so fm o u s eb i c cl ，t h ed n af r a g m e n te n c o d i n g n - t e r m i n a l1 3 9a m i n oa c i d s ( 6 1 e 一1 9 9 a ) a n dc t e r m i n a l1 4 8a m i n oa c i d s ( 7 11 q 一8 5 8 d ) o f b i c c 1w a so b t a i n e db yp c ra n dw a sc l o n e di n t oa p r o k a r y o t i cg s t - f u s i o np r o t e i n e x p r e s s i o nv e c t o r f u s i o np r o t e i ng s t - b i c c l - n p h i s 6w e r ee x p r e s s e da f t e ri p t g i n d u c t i o n ，a n dt h e np u r i f i e df r o mt h et o t a lp r o t e i n so f e c o l ir o s e t t ac e l l s t r a n s f o r m e db yt h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sp g e x - h i s c 3 - g s t - b i c c l - n c w e p r e p a r e dt w op o l y c l o n ea n t i b o d i e sa g a i n s tm o u s eb i c c lp r o t e i nw i t hh i g hs p e c i f i c i t y 2 戴宝贝小鼠双尾c 基凼免降、b i c c l 蟹臼多死隆抗体制箭及训步m 用 b yi m m u n i z i n gr a b b i tw i t h t h e s et w op u r i f i e df u s i o np r o t e i n s t h es p e c i f i c i t yo ft h e a f f i n i t y - p u r i f i e da n t i b o d i e sw a se x a m i n e db yw e s t e r n b l o t w es t a i n e dc u l t u r e dc e l l s a n dm o u s ek i d n e yp a r a f f i ns e c t i o n sw i t ht h i sa n t i b o d ya n df o u n dt h a tb i c cl i sm a i n l y l o c a l i z e da tc y t o p l a s m t h e s ew o r kw i l ll a yaf o u n d a t i o nf o rf u r t h e rr e s e a r c ho nt h e b i o l o g i c a lf u n c t i o no fm o u s e b i c c lg e n e k e y w o r d s ：m o u s eb i c a u d a l - cj ，b i c c l ，c l o n e ，p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ， p o l y c l o n a la n t i b o d y 3 蛾宝贞小鼠双尾c 基冈克隆、b i o c l 蛋( j 多克降抗体制各及初步心用 上- j - 刖吾 双尾一c 基因( b i c a u d a l - c ) 首先在果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 中被发现，其功能丧失 导致果蝇胚胎头部的缺失和双尾结构的形成 i , 2 , 3 1 。随后相继在线虫、爪蟾、小鼠和人类等物 种中发现了果蝇b i c a u d a l - c ( d b i c c ) 的同源基因【4 】。这些同源基因在进化上高度保守：其 蛋白产物均含有n 端若干个k h 结构域( kh o m o l o g yr n a b i n d i n gd o m a i n ) 和c 端的一个s a m ( s t e r i l ea l p h am o t i f ) 结构域【5 】，它们是蛋白发挥生物功能的关键结构域【6 , 1 1 】。k h 结构域是r n a 结合结构域，含有该结构域的蛋白通过与r n a 结合，参与m r n a 的剪接和翻译，并维持r n a 的稳定性【5 - 9 。b i c a u d a l c 蛋白c 末端的s a m ( s t e r i l ea l p h a m o t i f ) 结构域则被认为介导蛋白质 之间以及蛋白质与核酸之间的相互作用 1 0 , i i 】。 不同物种b i c a u d a l - c 同源基因的功能已部分阐明。在较低等的生物如线虫和果蝇中， b i c a u d a l c 与胚胎发育密切相关，而在较高等的生物如小鼠，该基因则参与了部分器官尤其是 肾脏的i f 常形成【1 2 】。秀丽隐杆线虫( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) 的g l d 3 蛋白能够促进生殖细胞 减数分裂并引发精子发生过程【l - 3 j ；g l d 3 可与g l d 一2 形成复合体激活g l d 1 的表达，从而调 控细胞从有丝分裂转向减数分裂i l4 。除了前述果蝇b i c c 蛋白在发育中的作用，最近c h i c o i n e 等通过制备果蝇b i c a u d a l c 蛋白的抗体并利用免疫沉淀的方法从果蝇卵中分离了b i c a u d a l c 特 异结合的r n a ，其中包括b i c a u d a l - c 自身m r n a 和一些参与卵发生及细胞骨架调控的基因 m r n a ”】。爪蟾( x e n o p u s ) 的x b i c c 蛋白则通过与r n a 的结合涉及早期胚胎发育的胚层特化 1 1 2 , 1 6 l 。而小鼠b i c c l 和人类b i c c l 基因功能目前还知之甚少【1 7 , 1 8 1 。 b i c c l 基因突变的小鼠表现出与人类多囊。肾疾病高度相似的症状，因而该基因突变的小鼠 成为研究人类多囊肾疾病发病机制的理想模型。例女n j e p k ( j u v e n i l ec o n g e n i t a lp o l y c y s t i ck i d n e y d i s e a s e ) 纯合子小鼠模型的表型与人类常染色体显性多囊肾疾病( a u t o s o m a ld o m i n a n t p o l y c y s t i ck i d n e yd i s e a s e ，a d p k d ) 极为相似，双侧所有肾单元均发生囊肿，一般出生后1 0 d 死亡【l 9 1 1 j c p k 纯合子小鼠的b i c c l 基因在3 号外显子上的一个碱基发生突变( g _ a ) ，导致3 号 外显子缺失并在4 号外显子中提自 产生终止密码子，其蛋白质产物b i c e l j 呲p 只有9 3 个氨基酸， 缺失了k h l 的大部分及k h 2 、k h 3 和s a m 结构域【1 8 】。最近b o u v r e t t e 等的研究发现，小鼠b i c c l 蛋白在体外能够与r n a 结合，其k h 3 结构域对于r n a 的结合是必需的，因此b i c c l j 呲p 蛋白在体 外无法与r n a 结合1 4 】。此外，该基因的突变还影响其他器官如肝脏和胰腺的正常发育和生理 5 内蒙古大学硕士学位论文 功能【1 9 - 2 1 1 。 以上证明b i c c l 基因突变与小鼠多囊肾的形成密切相关，提示该基因产物的功能可能与 人类多囊肾疾病的发生相关；而小鼠b i c c l 蛋白是高度保守的双尾c 蛋白家族成员，提示b i c c l 可能是通过k h 、s a m 结构域与其他蛋白或r n a 形成复合体并介导基因表达调控从而在肾 发育和功能发挥中起着至关重要的作用。但b i c c l 具体是通过与哪些蛋白或核酸形成复合体 并调控哪些基因的表达来参与肾发育等这些复杂过程的还不清楚。 本研究拟通过克隆小鼠的全长b i c c l 基因并构建其真核表达载体，为实验研究提供最初 的实验基础材料；根据生物信息学分析结果，选择抗原性较好的蛋白区段作为免疫原，构建 其原核表达载体，诱导融合蛋白的可溶性表达，制备两种兔抗小鼠b i c c l 蛋白的多克隆抗体； 尝试通过细胞免疫荧光染色及免疫组织化学方法检测该蛋白在鼠肾细胞内的表达分布，从而 为进一步研究小鼠b 纪c ，基因的功能奠定基础。 6 娥宝贞小鼠双尾c 摹因克隆、b i c c l 蛋白多克隆抗体制备及初步应用 第一部分小鼠双尾c 基因b i c a u d a l - c - 1 的克隆 一引言 目前，线虫、果蝇、爪蟾的b i c a u d a l - c 同源基因的功能已部分阐明【1 2 。16 1 ，而小鼠b i c c l 和人类b i c c l 基因功能目前还知之甚少f 1 7 , 1 8 】。b i c c l 基因突变的小鼠表现出与人类多囊肾疾 病高度相似的症状，为揭示其基因产物与肾脏发育、功能维持的密切关系，首先要从获取该 基因全长入手，因此我们提取雄性c 5 7 b l 6 小鼠肾脏组织的总r n a 、体外反转录为c d n a ， 通过分段巢式p c r 及酶切连接的方法获得了全长2 9 3 0 b p 、无突变的小鼠b i c c lc d n a 序列， 并将其连入真核表达载体p c m v - t a g4 a ，为进一步的研究提供实验基础。 二实验结果 1 克隆策略的设计 自n c b i 检索小鼠b i c c l 的c d n a 序列( 见附录一) ，分析酶切位点及g c 含量，确定分 段克隆策略：因其c d n a 序列的1 - 2 0 0 b p 片段的g c 高达7 3 2 ，且在1 9 8 b p 处含有x h o i 酶切位点，故决定单独克隆这一段序列，剩余部分在11 6 5 b p 的a a t l i 酶切位点处一分为二分 别克隆。具体策略见图1 ，相关引物信息见表1 ，详细信息见附录一。 蕾一 ic = - ：3 lt - - 上一 哟- - o o o o o o - - l l t t 。1_丌 u j 5 端引入s a cl 3 端引入b a m hi 注：贼表示高g c ，7 3 2 ；c 今外侧引物； 内侧引物；数字表示核苷酸位点 图1 ：b i c c l 基因克隆策略示意图 f i g 1t h es t r a t e g yi nb i c c l c l o n i n g 1 9 内蒙古大学硕士学位论文 表1b i c c l 基因克隆相关引物信息 t a b l e 1a l lp r i m e r sf o rb i c c l 童p c r 名称 序列 位置长度 g c t m 扩增片段长度 ( b p )( ) ( b p ) b i c c l f l l5 a c g c g t g g g t c g c a c c 3 。 4 1 6 7 5 6 1 1 b i c c l r 1 15 c g a t c t t c a g t t t g g a c g g c 3 3 1 42 05 56 0 43 1 1 b i c c l f 1 2 5 鱼鱼i a t g g c c t c g c a g a g 3 2 02 05 55 8 ( 6 4 3 1( 4 5 2 ) 2 7 7 b i c c l r 1 25 c a a t c t g c g t g t 丌g t c t c c t 3 2 9 0 2 l4 7 6 5 7 7 b i c c l - i 您l5 t c 下t g c a c a g c c c g g a g 3 1 4 4 1 7 6 4 75 7 9 1 3 7 5 b i c c l r 2 1 5 c a c a g t g t a g g a c t g g g a g t a c c 3 。 1 5 1 82 35 6 55 7 9 b i c c l f 2 25 g g a g t g g a g c g a g g a g c 3 1 5 71 77 0 65 5 3 1 0 4 5 b i c c l r 2 2 5 g c t c g g c t g t t t g g g c 5 1 2 0 l1 66 8 85 7 4 b i c c l - f 3 15 c a g c c a g t c c c c g a t c c c a a 3 6 7 72 06 56 7 4 2 3 5 5 b i c c l 1 b l 5 g c a g g c g a g t g c a g t g a a g 3 3 0 3 11 96 3 25 9 8 b i c c l f 3 2 5 g g a a c a g c t g g a c g t c t r ，d 3 1 1 5 02 25 05 8 3 18 0 6 b i c c l - r 3 25 g g a t c c c c a g c g g c c a c t g a c 3 2 9 5 0 2 l7 1 47 0 3 ( 7 3 3 )( 5 2 5 ) f 3 3 5 c a g c a g t c g t g a g c a c c t g g c a a g 2 4 2 8 3 06 08 3 6 同复突变校止 t g g a a g 3 2 4 5 7b i c c l i l l4 号克 i b 3 5 。c t t c c a c t t g c c a g g t g c t c a c g a c 2 4 2 8 3 06 08 3 6隆2 4 4 2 位点突 t g c t g 3 。2 4 5 7变 2 提取小鼠肾脏总r n a 、反转录获得c d n a 将总r n a 取1 “l 、2 “1 分别上样电泳，见图2 ，1 8 s 、2 8 sr n a 条带清晰并未见明显降解。 根据小鼠g a p d h 序列设计一对引物：5 吲物为：5 g a c c a c a g t c c a t g c c a t c a c t - 3 ； 3 引物为：5 t c c a c c a c c c t g t t g c t g l a 3 。，以扩增g a p d h 基因检验合成的c d n a 质量。 小鼠g a p d h 的p c r 产物电泳见图3 ，可见4 5 2 b p 处唯一的清晰条带，证明体外转录的c d n a 质量能够满足下一步克隆基因的要求。 蛾i 贞小鼠取尾c 螭w 克、b i c c 【自# 克隆抗仆制# 艇衲$ 血用 聚合酶做巢式 4b i c c l - i 连a , p g e m t e a s y 载体 将b i c c l - i 片段p c r 产物电泳回收并加a 尾后，按照p r o m e g a 公司t 4 连接酶说明书连入 p g e m - t e a s y 载体中( 如图5 ，载体m c s 信息见附录三) ，连接产物转化e c o l i d h 5 a 感受态，次 日挑3 个克隆、摇菌、提质粒p g e m - t e a s y - b i c c l i l # 、2 # 、鲥，并利用n o t i ( 载体多克隆位 点中古有) 酶切鉴定是否连入b i c c l i 片段，结果如图6 ，3 个质粒均切出约3 0 0 b p 的目的片段和 2 9 8 5 b p 的线性化载体片段。将3 个质粒全部送钡4 序，结果p g e m - te a s y b i c c l i - 3 # 克隆无突变。 自蒙古人学碗l 学位沧史 r 、色割 图5 ：重组质粒p g e m te a s y - b i e c l - l 示意图图6 ：p g e m - te a s y - b i c e l - i 经 研i 单酶切产物电泳图 f i g5p l a s m i d m a po f p g e m te a s y - b i c c l 。i f i 9 6 r e s t r i c t i o ne n z y m e sa n a l y s i so f p g e m - tc a s y - b i c c l - i m ：1 k b p l u s d n a m a r k e r ； 】- 3 ：p g e m te a s y - b i c c l i i # - 3 # n o t l 5 巢式p c r 扩增b i c c l 一片段 利用表1 中的两对引物：b i c c l f 2 1 ，r 2 1 和f 2 2 、r 2 2 ，以及高保真- p f u d n a 聚合酶做巢式 p c r ，结果扩增出约1 0 4 5 b p 处的唯一条带，与预期大小一致，电泳结果见图7 。 用7 ：b i c c l - i i 巢式p c r 产物电泳 f i g7 a g a r o s e g e le l c c t r o p h o r e s i so f b i c f l i in e s tp c rp r o d u c t s m ：d l - 2 0 0 0d n am a r k e ：i ：p c rp r o d u c t so f b k c l l i 6b i c e l i i 连入p g e m t e a s y 载体 将b i c c l - i i 片段p c r 产物电泳回收并加a 尾后，按k 臻, , p r o m e g a 公司t 4 连接酶说明书连人 p g e m - te a s y 载体中( 如图8 ) 连接产物转化e c o l i d h 5 a 感受态，次日挑5 个克隆、摇菌、提 质粒p g e m - te a s y - b i c c l - i i - 1 # 一5 # ，并利用n o ti 酶切鉴定是否连入b i c c l - i i 片段，结果如图9 ， 5 个质粒均切出约1 0 8 0 b p 的目的片段和2 9 8 0 b p 的线性化载体片段。将5 个质粒全部送测序，结 果( 见附录二) p g e m t e a ! s y - b i c c l i 一3 # 和删克隆分别在1 0 6 2 b p ( c 8 9 - 。鹊，g l n _ a r g ) 和6 6 9 b p ( g g g - g a g ，g l y 叶g l u ) 处各自有一个突变位点( 见附录二) ，其余克隆均有两个以上的突 变位点。 蔫壹 一， 毗， 一 圈 一 固 蛐| ! l - _ 牛一 置 辩i 贞小鼠尾c 幕目克隧、b i c c l 虽自多克睡抗体制薪厦静步应月 图8 ：重组质粒p o b m - tc a s y - b i c c l - 1 l 示意图 圉9 ：p g e m te a s y - b i e c l i i 经m l 单酶切产物电泳固 f i g8p l a s m i d m a po f p g e m - te a s y - b i c c - i i f i 9 9 r e s ”i c t i o ne i z y m e $ a n a l y s i so f p g e m t e a s y 。b i c c l i m ：1 k b p l u s d n a m a r k e r ： l 一5 ：p g e m - te a s y - b i c c l - i i i # - 5 # n o t i 7p g e m te a s y - b i c c l i i 一3 # 和4 # 互换无突变片段 利用p g e m t e a s y 载体中的印 i 酶切位点和b i c c l i i 中8 5 7 b p 处的h i n d i l i 酶切位点，s p i ti 、 h i n d1 1 1 双酶切p g e m te a s y - b i c c l - 1 1 - 3 # 和4 # ，均能切出6 8 0 b p 和2 9 9 2 b p 片段r 回收p g e m t e a s y b i c c l i i 3 # 的6 8 0 b p 酶切片段 l l p g e m te a s y - b i c c l i i - 群的2 9 9 2 b p 酶切片段，t 4 连接酶连 接并转化e c o l ld h 5 a 感受奄，次日挑1 0 个兑隆、摇菌、提质粒p g e m t e a s y b i c c i i i 3 4 i 杠1 0 # ，并利用n o ti 酶切鉴定是否连接成功，结果如图1 0 ，5 个质粒均切出 约1 0 8 0 如酐j b i c c l 一1 1 片跚0 2 9 8 0 b p f i c j 线性化载体片段。将前3 个质粒送测序，结果均无突变位 点，保留p g e m t e 拈y - b i c c l 1 1 - 3 4 1 # 克隆。 图1 0 ：互捷后质粒n o e m te a s y - b i c c l i i 一3 4 厦m i 酶切后产物电泳图 f i g 1 0 t h e d g e m - te a s y - b i c c l - i i 3 4 - l k l 0 p t a s m i d sa n d i t s r e s t r i c t i o ne n z y m e sa n a l y s i s m ：i k bp l u sd n am a r k e r = l - 1 0 ：d g e m - tc a s y - b i c c l 。1 1 3 4 1 # 一l o 托 1 - j dd g e m - t e a s y - b i t e l 一j f - 3 4 - 1 # 一1 0 # 1 n o t i 内蒙古 学碗学位论立 8 巢式p c r 扩增b i c c l i i i 片段 利用表l 中的两对引物：b i c c l f 3 l 、r 3 1 和f 3 2 、r 3 2 ，以及l a t a g d n a 聚合酶做巢式p c r 结果扩增出约1 8 0 6 b p 处的唯一条带，与预期大小一致，电泳结果见图1 1 。 m1 瞎i1b i c 口1 1 1 1 巢式p c r 产物电泳 f i 9 1 l a g a r o s e g e le l e e t r o p h o r e s i so f b i c c l i i in e 女p c rp r o d u c t s m ：i k bp l u s d n a m a r k e r ；i ：p c r p r o d u c t s o f b i c c l - j i i 9 b l o c l - 1 1 1 连入p g e m - t e a s y 载体 将b i c c l i i i 片段p c r 产物电泳回收后按照p r o m 。g a 公司t 4 连接酶说明书连入p g e m - te a s y 载体中( 如周1 2 ) ，连接产物转化e c o l i d h 5 a 感受态，次日挑5 个克隆、摇菌、提质粒p g e m t e a s y - b i c c l - i l l 一1 # 一5 # ，并利用n o ti ( 载体多克隆位点中舍有) 酶切鉴定是否连入b i c c l 一1 i i 片 段，结果如图1 3 所示，5 个质粒均切出约1 8 4 5 b p 的目的片段和2 9 8 0 b p 的线性化载体片段，同时 用p s tl ( b i c c l i i i 中的2 0 1 7 b p 处和载体多克隆位点中含有) 单酶切鉴定这5 个质粒，均切出9 8 2 b p ；手口3 8 4 2 b p 两条带，结果如图1 4 。将5 个质粒全部送测序，结果p g e m - t e a s y - b i c c l i i i 4 # 克隆只 在2 4 4 2 b p 处有一个突变位点( c a c c g c ，h i s - a r g ) ( 见附录二) ，其余克隆均有两个以上的突变 位点。 图1 2 ：重组质粒口g e m - te a s y - b i e c l 一l 示毒图 f 9 1 2p l a s m i d m a p o f p g e m - t e a s y - b i c c l 。i i i 自小鼠m ec 珐目克降、b i c c l 生自$ 克抗体制* 初步m 月 堕茎夏至兰堡! 堂堡里三 1j 连接b i c c l i $ f l b i c c l 1 1 片段 如图1 6 所示，利f i p g e m te a s y 载体中的s a li 酶切位点及b i c c l i h b i c c l i i q a1 9 8 b p 删 x h o i 酶切位点，s a l i 、x h 0 1 取酶切p g e m t e a s y - b i c c l - i 3 # u p g e m - te a s y - b i c c l - 儿一3 4 1 # ，分 别能切出3 1 5 5 b p 、1 3 7 b p 币f f 9 4 0 b p 、3 1 2 0 b p 片段回收3 1 5 5 b p ( p g e m - te a s y b i c c l - j 硝线性化 片段) 和9 4 0 b p ( b i c c l - l i 片段) 的酶切片段，t 4 连接酶连接并转化e c o l i d h 5 a 感受志，次同 挑5 个克隆、摇菌、提质粒p g e m - tc a s y - b i c c l i i i l # 一5 # ，并利用n o t i ( 载体多克隆位点中 含有) 酶切鉴定是否连接成功，结果如图1 7 ，5 个质粒均切出约1 2 1 5 b p 的b i c c l i i i 片段和2 8 8 0 b 口 的线性化载体片段。将5 个质粒送测序，结果均无突变位点，保留p g e m te a s y b i c c l i i i 1 # 克隆。 p”慈4203 b p 。，r 霁 圈1 6 ：b i c c l - i 片段与b i c c l i i 片段连接策略示毒匿 f i g1 6s t r a t e g y f o r c o n s t r u c t i o n o f d g e m = te a s y - b i c c l - i - i i 宝贞女* 日尾c 基目克b 、b t c c i 噩白多克隆抗体制蔷初步心用 蚕雷蓦薹切 毋1 8 ：胁，一i 1 i 片段与肌由片段连接策略示毒图 f i 9 18s t r a t e g y 如rc o n s t r u c t i o no f 口g e m t e a s y - b i e c l 内颦古人学硕位论女 量 图1 9 ：p g e m - te a s y - b i c c l - i - # 和p g e m te a s y b i c c l - i l i - m u t l # 妊a a t lj 单醇 切产物电泳图 f i g1 9r e s t r i c t i o ne 呵m e sa n a l y s i so f p g e m te a s y b & e l i 一- l # a n dp g e m - t e a s y - b i c c l i i f m u t - l # m ：l k bp l u sd n am a r k e r 1 ：p g e m 恤t 卜b i c c l - i - “一i # ，a a l i ： 2 ：p g e m te a s y - b i c e l - i i i m u l - 1 舸a m l i 回收p g e m - te a s y - b i c c l i * 1 i l # 的1 1 8 0 b p 和p g e m t e a s y - b i c c l i i i - m u t - 1 # 的4 7 8 0 b p 酶 切片段将4 7 8 0 b p 片段经c i a p 去磷酸化处理后，t 4 连接酶连接并转化ee o l i d h 5 a 礴受态， 次日挑4 个克隆、摇菌、提质粒p g e m - t e a s y - b i c c l 一1 # 删，井利用p “i ( b i c c l 中的2 2 1 b p 、 2 0 1 7 b p 处和载体多克隆位点中含有) 酶切鉴定是否连接成功以及鉴定正反接，如图2 0 所示， 若为正插应该得到三条带：3 2 0 0 b p ，1 8 0 0 b p ，9 6 0 b p ：如果为反插，则应该得到三条带为：1 0 9 0 ， 9 6 0 ，3 9 1 0 b p 。结果如图2 l 所示：f 插对应2 号、4 号；反插对应1 号、3 号，保留p g e m t e a s y - b i c c l 一2 # 、4 # 克隆。 a 4 ”0 5【 i 匕1 ：“竺l ：1 邕竺i j r * ) h 展“ 竺! 塑竺塑 4 1 2 0 ：b i c c l1 - i i 连 p g e m - te a s y - b i c c l - i i i 的正反接酶切鍪定示意图 f i g2 0 t h e m e t h o do f c h e c k i n g b i c e l - i i i sd i r e c t i o n i np g e m - te a s y - b i c c l 图2 ip g e m - te a s y - b i e c l 经p s tl 单酶切产物电泳固 f i 9 2 ir e s t r i c t i o ne n z y m e s 卸a l y s i so f p g e m te a s y * b i c c l m ：1 k bp l u s d n a m a r k e r ：1 4 2p g e m te a s y - b i c c l l # 一4 制，“ 些圭生尘旦些里! 量塑里壁：! ! 竺! 堂皂兰至堡垫堡型墨丝型生竺旦 再燃p g e m - t e a s y b i c c l - 2 # 、甜克隆，用肺”d i l i ( 龇c ，基因8 5 7 b p 处) , d s a l ( 载体 多克隆位点中) 双酶切，酶切产物均为2 1 4 0 b p ，3 8 2 0 b p 两条带，与预计条带大小致，如图 2 2 所示，充分确认这两个质粒的正确性，送测序，结果证明均无突变。 m12 嗣 图2 2 ：p g e m te a s y - b i c c l 2 # 、4 # 经h i n d l l l 和