（微生物学专业论文）降解pbs菌株的选育及其解聚酶的研究.pdf

摘要 聚丁二酸丁二醇酯( p b s ) 于2 0 世纪9 0 年代进入材料研究领域，并迅速成为生物降解 塑料研究热点。其合成原料来源既可以是石油资源，也可以通过生物资源发酵得到，p b s 生物全降解塑料用途广泛，可用于包装、餐具、化妆品瓶及药品瓶、一次性医疗用品、 农用薄膜、农药及化肥缓释材料、生物医用高分子材料等领域。与其它生物降解塑料相 比，p b s 在热性能、加工性能和性价比方面有独特的优势，因此引起科技和产业界高度 关注。 本项工作的目的是从自然界中筛选出可降解p b s 的菌株，并对降解菌株进行驯化、 诱变，使其高效降解p b s ，并分离纯化出p b s 解聚酶，研究其酶学性质，为p b s 的应用 奠定基础。 本论文的主要结果如下： 1 由扰顺石油三厂排出的污泥中筛选出可降解p b s 的四株霉菌，分别为x h 0 5 0 1 、 x h 0 5 0 2 、x h 0 5 0 3 、x h 0 5 0 4 。对其中一种降解速率较快的真菌x h 0 5 0 l 进行初步鉴 定：x h 0 5 0 l 属于真菌门、子囊菌纲、真子囊菌亚纲、曲霉目、曲霉科、杂色曲 霉。 2 以x h 0 5 0 1 为出发菌株，通过紫外线复合氯化锂诱变及微波诱变，采用摇瓶培养 测定发酵液酶活力的复筛方法，获得具有遗传稳定性的p b s 降解菌株，编号为 x h 0 5 0 卜a ，测得该菌株的酶活高于原始出发菌株的3 8 8 9 。 3 对x h 0 5 0 l a 菌株产生的p b s 解聚酶进行了分离、纯化，并对其解聚酶的特性进 行了研究。纯化倍数约为1 2 2 6 ，酶活力回收率1 2 0 7 ，酶蛋白的相对分子质量 约为4 4 7 k d 。 4 酶最适反应温度和p h 分别为4 0 和8 6 。在温度3 0 以下和p h 8 。0 9 4 范围 内稳定。金属离子c a 2 + 、f e 2 + 对p b s 解聚酶有激活作用，而c u 2 + 、h 9 2 + 等金属离子 对此酶有抑制作用。 5 质谱仪测得酶降解p b s 的产物均为单体，即丁二酸丁二醇酯。 6 。扫描电镜观察降解后的p b s 膜，结果表明p b s 膜在没有降解之前，膜表面是光滑 平整的，降解后膜表面能明显看到蜂窝状孔洞。 关键词：聚丁二酸丁二醇酯( p b s ) ；p b s 解聚酶；降解p b s 菌株；生物降解特性 a b s t r a c t p o l y ( b u t y l e n es u c c i n a t e ) g o ti n t ot h em a t e r i a l sr e s e a r c hr e g i o ni nn l e19 9 0 s ，a n dq u i c k l yb e c o m e o n eo f h o t s p o ts t u f ro f b i o d e 伊a d a b l ep l a s t i c sr e s e a r c h t h es o u r c eo fs y n t h e s i sm a t 耐a lc a i l b ep e t r o l e u mr e s o u r c e ，a n di ta l s oc a nb eg o tb yf e r m e n t a t i o no fb i o t i cr e s o u r c e s p b s b i o d e g r a d a b l ep l a s t i ci su s e db r o a d l y ；i ti su s e m li nc a s i n g ，d i 肌e n a r e ，c o s m e t i cc a u s e ，d r u g b o t t l e ，a g r i c u l t u r ef i l m ，p e s t i c i d e ，f e r t i l i z e rs l o wr e l e a s es t u f a n dh i g hm o l e c u l a rm a t e r i a l r e g i o n c o m p a r et oo t h e rb i o d e 舒a d a b l ep l a s t i c s ，p b sh a v ep e c u l i a ra d v 锄t a g e si nt h e 肌a l p r o p e r t ya n dp r o c e s sp r o p e r t y ：t h e r e f o r e ，s c i e n c ea n dt e c l u l o l o g ya n di n d u s t r i a lc o n u n u i l i t y p a yh i g ha t t e n t i o no ni t t h ea i mo ft h i sw o r ki st ot 巧t of i n do u tt h em i c r o o 唱a n i s m sm ) mn a t u r ew h i c hc a nb e a b l et od e g r a d ep b s ，a n dt h ed o m e s t i c a t e da n dm u t a g e n i cd e 伊a d a t i o ns t r a i nc a i ld e 黟a d e p b sq u i c k l y ：p b sd e p o l y m e r a s eh a sb e e np u r i f i e da n ds o m ep r i m a r ya n a l y s i sh a sb e e n d o n e o ni tf o r l y i n gt h et h e o r e t i c a la n dp r a c t i c a lf o u n d a t i o n so fp b sa p p l i c a t i o n t h em a i nr e s u l t so b t a i n e df o mt h i sw o r ka r ea sf - 0 1 1 0 w s ： f o u rk i n d so fs t r a i n sa b l et od e g r a d ep b sw e r ei s o l a t e sf 而mt h em u dw h i c hw 嬲 d i s c h a r g e db yn o 3p e t r 0 1 一c o m p a n yo f f u s h u n ，c o d e da sx h 0 5 0 l 、x h 0 5 0 2 、x h 0 5 0 3 、 x h 0 5 0 4 o n ek i n do ff u n g iw h i c hh a v eaf 如td e 酉a d a t i o nr a t e ，c o d e da sx h 0 5 01 ，w e r e i d e n t m e dp r e l i m i n a r i l y ：x h 0 5 01b e l o n g st oa 咿e ，譬f f 觑sv p 坶f c d z d ， t h e 彳印p ，苫f 刀“j 坩船f c d 肠rx h 0 5 01 ，as t r a i no fd e 伊a d i n gp b s ，w a sm u t a t e db yu v m u t a g e n e s i sc o m p o u n d l i c l m u t a g e n e s i s a 1 1 dm i c r o w a v e m u t a g e n e s i s t h r o u g h s c r e e n i n gal o to fm u t a n t sw i t ht h em e t h o do fc u l t u r ef i l t r a t e ，o n em u t a n tw h i c hh a ss t a b l e c h a r a c t e ro fh e r e d i t yh a sb e e no b t a i n e d ，c o d e da sx h 0 5 0l a t h ea c t i v i t yo ft h ee n z y m e w h i c hi sa b s t r a c t e d 行o mx h 0 5 0 1 一ai s3 8 8 9 m o r em a i lt h a ti sf 而mx h 0 5 0 1 s o m er e s e a r c hh a sb e e nd o n eo nt h ep b sd 印o l y m e r a s ew h i c hi so b t a i n e df r o m x h 0 5 0 l - a t h ef i n a lp u r i n e d 肌z y m er 印r e s e n t e dm e1 2 0 7 r e c o v e r ) ra i l dt h e 12 2 6 f o l dp u r i f i e dp r o t e i nw i t ham o l e c u l a rw e i 曲to f4 4 7 l d t h em o s ts u i t a b l er e a c t i o nt e m p e r a t u r eo ft h i sp b sd e p o l y m e r a s ei s4 0 a i l dp hi s8 6 b e l o wt e m p e r a t u r e3 0 a j l db e t 、v e e np h8 4 9 o ，m ee n z y m ei ss t a b l e c 一+ a i l df e p c a na c t i v et h ee n z y m e ，b u tc u 计a n dh g 肘w i l lm a k ei tl o s ea c t i v a t i o n t h ed e g r a d e dp r o d u c tw i t hp b sd 印o l y m e r a u s ew a sm o n o m e rs u c c i i l i ca c i db u t a n e d i o l e s t e ra n a l y z e db yu s i n gm a s ss p e c n o m e t e r t h ed e 酽a d a t i o no fp b sf i l m sw a sm o n i t o r e db yu s i n gs e m b e f o r ed e 伊a d a t i o n ，t h e f i l mw a ss l i d e b u tt h e r ea r eo b v i o u sh o l e so nt h ef i l ma r e rd e 掣a d a t i o n k e y w o r d s ：p o l y ( b u t y l e n es u c c i n a t e )( p b s ) ；p b sd e p o l y r n e “峪e ；d e 目a d a t i o np b ss t r a i n ； b i o d e g r a d “0 nc h a r a c t e r i s t i c s i i 1 2 3 4 5 6 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所取得 的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了 明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：l 趟k 日期：扛j 二l 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东北 师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文 被垒阅和借阅。本人授权东北师范大学可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 本学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士学位论文全文数据库( 中国 学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论文全文数据库( 中国科学技术信息研 究所) 等数据库中，并以电子出版物形式出版发行和提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：堂翌 同 期：噬。( 。里 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名：二2 垒型 日期：巡：么：9 电话： 邮编： 东北师范大学硕士学位论文 引言 一、概述 进入新世纪以来，随着科技进步和社会生产力的极大提高，人类创造了前所未有的 物质财富，加速推进了文明发展的进程。与此同时，人口剧增、资源过度消耗、环境污 染、生态破坏等成为全球性的重大问题，严重地阻碍着经济的发展和人民生活质量的提 高，继而威胁着全人类的未来生存和发展。在这种严峻形势下，人类不得不重新审视自 己的社会经济行为和走过的历程，认识到通过高消耗追求经济数量增长和“先污染后治 理”的传统发展模式已不再适应当今和未来发展的要求，而必须努力寻求一条经济、社 会、环境和资源相互协调的、既能满足当代人的需求而又不对满足后代人需求的能力构 成危害的可持续发展的道路。 塑料制品已经被广泛应用于人们生产和生活的各个领域，塑料以其质轻、防水、耐 腐蚀、强度大等优良的性能受到人们的青睐。然而，塑料产品其原料主要来源于石化资 源，而石化资源的形成过程需经历千百万年，因此可视为不可再生资源。据资料报道， 世界可丌采和探明储量的石化资源，如按现在消费水平计算只能再提供5 0 1 0 0 年。因 此必须减轻对石油资源的依存，实施循环经济，保持可持续发展。而且，废弃塑料类材 料凶其难以收集回收而被视为“白色污染”，原因是塑料回归自然最终融入微生物循环 的过程( 即生物降解) 十分漫长，需要数百年甚至上千年，大量废弃的塑料制品因为其 不町降解性而带来了“白色污染的困扰。在造成环境污染的诸多因素中，塑料废弃物 造成的公害已引起了社会的广泛关注，发展环境降解塑料已成为当务之急。 降解塑料按引起降解的环境条件可分为光降解塑料、生物降解塑料、化学降解塑料、 组合降解塑料等。光降解塑料就是靠吸收太阳光，引起光化学反应而分解的塑料；生物 降解塑料是土壤中微生物能分解的塑料，借助于细菌或其水解酵素将材料分解为二氧化 碳、水、蜂巢状多孔材质和盐类；化学降解塑料是通过空气中的氧气或者土壤中水分的 作用而分解的塑料，包括氧化降解塑料和水解降解塑料。目前世界主要生产降解塑料的 国家有美国、同本、德国、意大利、加拿大、以色列等国，品种有光降解、光生物降 解、崩坏性生物降解、完全生物降解塑料等。其中，生物降解塑料在可降解塑料中最 具发展自仃途乜】。 二、生物降解塑料简介 ( 一) 生物降解聚合物的定义 国际上对生物降解材料的定义尚未统一，主要有以下几种： 同本通产省生物降解材料实用化检讨委员会于1 9 9 5 年3 月提出的定义是：使用中 东北师范大学硕士学位论文 保持和现有材料相同程度的功能，使用后能为自然界微生物作用分解为低分子物，并最 终分解为h 2 0 和c 0 2 等无机物的高分子材料口3 。 美国材料协会( a s t m ) 通过的生物降解塑料的定义是：生物降解塑料是指：在自 然界条件下，能为微生物所降解的塑料。 目前国际上严格意义上的生物降解聚合物的定义应该是：在有氧及无氧条件下，聚 合物在微生物及动植物体的作用下，其物理、化学性能发生下降及形成c 0 2 、 h 2 0 、 c h 4 及其他一些小分子量化合物的聚合物h 3 。这个过程包含了从聚合物中产生的进入生 物体的碳源及残渣。所有的碳应该平衡，所有的残渣按照环境评判标准来看应该无毒。 ( 二) 生物降解聚合物的分类 生物降解塑料包括天然树脂和合成树脂，天然的可降解塑料是由可再生资源( 例如 淀粉) 以及由可再生资源天然或者人工合成制得的一种可降解高分子材料，不可再生合 成可降解塑料是以石油化工产品为基础制得的。运用生物化工技术，国内外生产生物降 解塑料的技术已经趋向成熟，推出了多种完全生物降解的塑料产品，其中主要包括淀粉 类以及聚酯类，其中聚酯类包括聚乳酸( p l a ) 、聚羟基脂肪酸酯( p h a s ) 、聚己内酯 ( p c l ) 和聚丁二酸丁二醇酯( p b s ) 。脂肪族聚酯由于其生物降解性和经济性，已成 为国内外研究的热点。 ( 三) 生物降解聚合物的生物降解测试方法 聚合物的降解程度评价指标有：材料重量的减少量、材料结构与性能的变化、微生 物细胞数量和质量的增加( 聚合物是唯一碳源的情况) 、c 0 2 的生成量、0 2 消耗量等。“。 目前，生物降解评价通常采用的方法有：实验室微生物培养测定法，室外土壤掩埋 法、堆肥法等。对聚合物生物降解的测定还没有十分统一的方法，不同的方法有不同的 结果。 三、p b s 的研究概况 ( 一) p b s 基础物性 一种p b s 产品b i o n 0 1 e 6 1 为白色结晶型聚合物，其比重为1 2 左右，熔点为1 1 5 ， 燃烧热约为聚烯烃的1 2 左右。表1 和表2 给出的b i o n o l e 基础物性和力学性能数据表 明，b i o n o l e 与低密度聚乙烯( l d p e ) 、高密度聚乙烯( h d p e ) 和聚丙烯( p p ) 的基础物性 和力学性能相近，特别是从拉伸、弯曲、冲击特性等角度而言，b i o n 0 1 e 具有作为结构 材料所应有的基本特性。 2 东北师范大学硕士学位论文 表lb 菇戚e 与p e ，p p 的基础物性比较 | b 垃el 丑b s 泌p o p e r l 诞sc l fb l 哪d ea n dp e ，p p 瑟础物性b 西l e ( 甩s ) l d p em p ep p 密船( g 锄。) 1 2 6o 9 2o 。9 5o 9 0 结鼎化j 蔓p 3 0 4 5 7 04 5 熔点孤pc 1 1 4h 01 2 91 6 3 玻璃化溺腰蹿c 一3 2一1 2 0 1 2 0 5 结晶化温度艘c 7 5 9 5 1 1 5 5 分子量玉如1 0 4 5 3 0 分子量分布蝤挪毛 1 2 2 41 0 7 6 燃烧热p 0 羔。) 2 3 5 7 5 4 5 9 8 0 袭2b 妇l e 与p e ，p p 力学性能比较 蜀n e2、知c h a n i c a lp 重o 弦1 t i e sdb 钿n o l ea n dp e ，p p 力学性能 b i o 砌e p b s 片 p b s 颗粒，对堆肥中的微生物进行了分离鉴定，在所选 堆肥中主要分离出四种菌株：杂色曲霉菌、青霉菌、芽孢杆菌和直杆高温多孢菌，它们 对p b s 的降解能力各不相同，其中最有效降解p b s 的菌株是杂色曲霉菌旧。 四川大学通过堆肥生物降解实验研究了分子量的大小对p b s 的生物降解的影响，发 现并揭示了随降解的进行，生物降解速度加快：分子量越小的聚酯，其生物降解的速度 越快32 l 。 p b s 基生物降解塑料无论从环境保护，还是从合成生物医用功能高分子的角度，都 具有十分重要的理论研究与应用意义，就应用领域而言，p b s 基生物降解塑料作为可降 解性的包装塑料、可降解性的生物医用材料( 如医疗器件等) 等，符合环境保护与可持续 发展战略的要求，应用广泛，前景看好。目前的问题是：要想有效利用p b s 基塑料的生 物降解性，拓展其应用领域，必须在保证与现行塑料有同等性能的前提下，控制降解速 率，使p b s 基生物降解塑料适应各种应用环境的降解要求；进一步降低生产成本，改善 反应条件，使生产产业化、规模化以满足市场的需求。我国对生物降解性评价目前尚无 统一的标准，所以建立合理有效的生物降解性评价体系，使其成为生物降解塑料的成果 鉴定及技术转让等必要的依据和准则，也是今后的工作重点。总之，我们应立足实际， 6 东北师范大学硕士学位论文 从资源、技术、经济、市场、环保等方面综合考虑，积极开发研究符合我国国情的p b s 基 生物降解材料新领域。 四、本论文工作的目的 p b s 具有成本低、力学性能好( 介于p e 和p p 之间) 和加工性能优异( 可在p e 的 加工设备上加工成型) ，并因其良好的热稳定性和较高的分子量受到青睐。p b s 是一种 新型的生物降解聚合物材料，p b s 降解与应用的研究始于2 0 世纪9 0 年代，对于环境 友好材料和生物材料而言，p b s 基降解材料的制备与应用系新兴的研究领域。 目日，j 大部分报道都是关于p b s 合成改性的研究，少见降解性的报道。可生物降解性 是p b s 和p b s a 的一项重要性质，在微生物作用下最终降解成c 0 2 和水而对环境无害。通 过研究p b s 和p b s a 在微生物作用下的降解行为，了解聚合物的生物降解性能，对其应用 开发有重要的指导意义。在国内关于降解性的实验类文献只有堆肥条件下的降解性研 究，缺少降解p b s 酶学方面的研究。本项工作可以说是生物降解领域新的拓展，目的是 从自然界中筛选出降解p b s 的菌株，并对该菌株所产生的解聚酶的降解特性和生化特性 进行研究，为p b s 的研究与应用奠定理论基础。 7 东北师范大学硕士学位论文 一、实验材料与方法 1 1 实验材料 1 1 1 菌株来源 从采集的活性污泥中分离筛选出的可降解p b s 的菌株。 1 1 2 聚丁二酸丁二醇酯( p b s ) p b s 粉末和p b s 膜均由中科院长春应用化学研究所提供。 1 2 培养基的制备 1 2 1 分离菌种用培养基 ( n h 4 ) 2 s 0 4 1 o g ，k h 2 p 0 4 0 。2 9 ，k 2 h p 0 4 1 6 9 ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 2 9 ，n a c l 0 1 9 ， c a c l 2 2 h 2 0 0 0 2 9 ，f e s 0 4 7 h 2 0 0 0 1 9 ，n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0 0 5 m g ，n a 2 w 0 4 2 h 2 0 0 5 m g ， m n s 0 4 0 5 m g ，p b s l 5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m 1 ，p h = 7 2 1 2 2 鉴定菌种用培养基 察氏( c z 印e k ) 培养基：n a n 0 32 9 ， k 2 h p 0 41 9 ， k c lo 5 9 ， m g s 0 4 7 h 2 00 5 9 ， f e s 0 4o 0 1 9 ， 蔗糖3 0 9 ，琼脂1 5 - 2 0 9 ，p h 自然。 1 2 3 测定降解速率及酶活所用培养基 ( n h 4 ) 2 s 0 4 1 o g ，k h 2 p 0 4 0 2 9 ，k 2 h p 0 4 1 6 9 ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 2 9 ，n a c l 0 1g ， c a c l 2 2 h 2 0 0 0 2 9 ，f e s 0 4 7 h 2 0 0 0 1 9 ，n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0 0 5 m g ，n a 2 w 0 4 。2 h 2 0 0 5 m g ， m n s 0 4 0 5 m g ，p b s l 5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h = 7 2 1 3 培养方法 1 3 1 菌种分离培养方法 将采集的污泥放入上述分离用培养基中，并将p b s 作为唯一碳源，置恒温摇床( 2 8 ，1 1 0 r m i n ) 中振荡培养，直至浑浊的培养液变得澄清为止。取一定量的培养液，采 用平板稀释涂布法进行分离。选较大的菌落进一步纯化。 1 3 2 菌种鉴定培养方法口3 一町 ( 1 ) 载片培养法 此种方法是一种集培养与观察为一体的制片技术。应用察氏培养基，其营养成分稀 释1 2 ，琼脂用量为原配方的1 3 。应用时，图中所有物品一同灭菌。接种时取稀释培养 液滴于载玻片两端各一滴其直径约为o 5 m m ，取菌种接于培养基中，盖上盖玻片( 间距 1 4 n u n ) ，倒适量2 0 甘油保湿，2 8 温箱培养，定时进行显微镜观察和摄影( 如图l - 1 ) 。 东北师范大学硕士学位论文 图1 1载玻片培养法示意图 上：正面观：下：侧面观 1 平皿：2 u 形玻棒；3 盖玻片：4 培养物；5 载玻片；6 保湿用滤纸 ( 2 ) 插片培养法 在固体察氏培养基平板上划线接种，把灭菌的盖玻片在划线平板上以0 。- 4 5 。的 角度斜插入琼脂培养基内。将插片平板置2 8 温箱中培养，定时取出盖玻片于显微镜 下观察和摄影。 ( 3 ) 点植培养法 将无菌接种环蘸以极少量孢子，点植于平板培养基上的适当位置，使接种点位于等 边三角形的三个顶点上，将培养基倒置于2 8 的恒温箱中，培养5 d 后观察结果。 1 4 菌种鉴定方法嘶3 胡 按照常规真菌鉴定方法进行观察鉴定。 1 5p b s 降解速率的测定方法 1 5 1p b s 粉末降解速率的测定。 将无菌接种环蘸以极少量孢子，点植于平板培养基上的适当位置，使接种点位于等边 三角形的三个顶点上，将培养基倒置于2 8 的恒温箱中，培养5 天后观察结果。 1 5 2p b s 膜降解速率的测定。粥珀1； 将称重的p b s 膜( 长2 5 c m ，宽o 8 c m ，重约2 5 m g ) 放入摇瓶中，接入菌种后置2 8 摇床振荡培养( 1 1 0 r m i n ) ，定期取样。样品取出后，用蒸馏水冲洗干净，干燥后用分 析天平称量重量变化。 9 东北师范大学硕士学位论文 1 6 分生孢子悬液的制备 1 6 1 菌种活化 将保存的菌种转接到斜面培养基上，2 8 培养3 4 d 至出现大量分生孢子。 1 6 2 分生孢子悬液的制备 活化菌种以无菌水冲洗，将分生孢子冲洗入装有玻璃珠的三角瓶中，2 8 ，振荡 1 5 m i n ，使分生孢子分散。显微镜检查，孢子浓度为1 0 6 个m l ，适于诱变。 1 7 诱变处理及突变株的筛选n 0 。删 1 7 1 紫外复合氯化锂诱变 将处理好的分生孢子悬液加入“c l 使其浓度达到0 1 5 ，放到摇床上振荡8 h 进行 前处理。灭菌平皿中装有5 m 1 l i c l 处理好的分生孢子悬液，在磁力搅拌下用紫外灯( 3 0 w ， 照射距离1 0 c m ) 照射，照射时间为1 0 6 0 s ，处理后的悬液在无菌室红灯照射下适当稀 释。 1 7 2 微波诱变 取制备好的单孢子悬液5 m l 于培养皿内，放入家用微波炉( 微波源为2 4 5 0 m h z ，8 5 0 w ) 中，中等强度辐射。采取加盖冷却的辐射方式，辐射1 0 s ，冰上快速冷却1 0 s ，再辐射， 辐射时间累计为l o 一6 0 s ，处理后的悬液适当稀释。 1 7 3 初筛 取上述悬液o 1 m l 涂布于培养基上，避光培养3 4 d ，计数存活菌落，计算其存活率， 选取单菌落，点植法培养，观察并定期测量菌落大小。 1 7 4 复筛 根据初筛结果，从固体平皿中挑取需要的单菌落接入斜面培养基，待长满后接入液 体诱导培养基中，2 8 摇瓶培养，每隔2 4 小时取样，取样数次，检测发酵液中p b s 解 聚酶的活力。 1 8 酶活的测定( 比浊法) 1 8 1p b s 悬浮液的制备h 引 将p b s 粉末溶于氯仿中，所得溶液与十二烷基磺酸钠溶液混合，混合液经超声波 处理5 m i n ，制得p b s 乳化液，7 5 加热9 0 m i n 除去氯仿，得到p b s 悬浮液。 1 8 2 酶活测定及酶活单位定义h 铲删 以p b s 为底物用分光光度法测定p b s 解聚酶的活力，取3 m l p b s 乳化液置于4 0 的恒温水浴中，待平衡后加入粗酶液1 m l ，反应一定时间( 2 0 3 0 m i n ) 后，于6 5 0 n m 波长下测其吸光值( 降低值) 。 1 个酶活单位定义为：每分钟引起光吸收率降低o 0 0 1 ( a 6 5 0 n n l ) 单位所需的酶量。 l o 东北师范大学硕士学位论文 1 9 酶的最适反应温度的测定3 将p b s 悬浮液分别置于2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 的水浴中预热l o 分钟，然后加入一定量的酶液，保温3 0 分钟，以蒸馏水做空白对照。测定酶液在不同 反应温度下的酶活力单位。 1 1 0 酶的热稳定性的测定1 将酶液分别于2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 的水浴中保温，间隔一定时 问取样测酶活，绘制酶活性一保温时间曲线。 1 1 l 酶的最适反应p h 值的测定瞄门 配制1 0 种不同p h 的p b s 悬浮缓冲液( p h3 6 5 0 乙酸一乙酸钠缓冲液，p h5 8 8 o 磷酸盐缓冲液，p h 8 0 9 o 啊s 盐酸缓冲液，p h9 0 1 0 4 甘氨酸一氢氧化钠缓冲液) ，再 用p h 计校正，以保证溶液的p h 值。将一定量的酶液加入不同p h 值的p b s 悬浮缓冲 液中，构成一系列酶反应体系，于4 0 测酶活性，绘制酶活性一p h 曲线，找出所对应 的p h 值，即该酶的最适反应p h 值。 1 1 2 酶的p h 稳定性的测定3 将酶液与不同p h 值的缓冲液于2 0 保温1 小时后，再按标准酶活测定法测其酶活 力，以在最适反应p h 下保温所测定的酶活力为1 0 0 ，其余折合成剩余的百分数，以 此对保温p h 作图，便可得到该酶在上述条件下的p h 稳定曲线。 1 1 3 酶的分离纯化阮1 1 1 3 1 酶液的制备 经1 2 0 h 发酵后的5 0 0 0 m l 发酵液于4 、1 2 0 0 0 g 离心3 0 m i n ，弃去沉淀，上清液 即为粗酶。 1 1 3 2 超滤浓缩 根据分子量大小，使用超滤膜( 截留分子量1 0 0 0 0 ) 超滤浓缩。 1 1 3 3d e a e a 2 5 弱阴离子交换层析 用0 0 l m o l l 碱s h c l ( p h = 8 6 ) 缓冲液平衡d e a e a 2 5 柱，然后将超滤液上柱， 用同样的缓冲液大量洗脱未吸附的蛋白质，再用o o 5 m o l l n a c l 线性梯度缓冲液来洗 脱，流速3 0 m 胁，每管1 0m l ，于2 8 0 l l r n 进行紫外检测，记录洗脱液的吸收值变化。 1 1 3 4 除盐 将浓缩液装入透析袋中，外面用聚乙二醇粉末包埋4 8 h ，除去里面的多余的水分和 盐。 1 l 东北师范大学硕士学位论文 1 1 3 5 聚丙烯酰胺凝胶电泳 采用s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 法。采用不连续垂直板电泳系统， 分离胶浓度1 2 ，浓缩胶浓度5 ，采用t r i s - h c l 缓冲体系，考马斯亮蓝r 2 5 0 染色。 1 1 4 降解产物的测定5 用l d i 一1 7 0 0 激光解吸电离飞行质谱仪测定降解产物，仪器工作参数为：质量范 围：1 1 1 z0 1 0 0 0 ，排斥电压：3 0 k v ，吸引电压：9 3 l ( v ，检测器电压：一4 7 5 k v ，真空 度：1 1 0 一4 p a ，底物：2 5 一二羟基苯甲酸( d h b ) 。 1 1 5 电镜观察p b s 膜表面结构的变化 降解后的p b s 膜经喷金采用扫描电子显微镜( s e m ) 观察其表面形态结构。s e m 为 日立s 一5 7 0 ，加速电压为1 5 k v 。 1 1 6 主要仪器 ( 1 ) b e k m a n 离心机( 美国b e k m a n 公司) ( 2 ) j y 一9 2 型超声波细胞粉碎机( 宁波新芝科器研究所) ( 3 ) p a l l 超滤系统( p a l lf i l t r o n 公司) ( 4 ) a l p h a 卜2 型冷冻干燥机( c h r i s t 公司) ( 5 ) 低温层析柜 ( 6 ) h z q q x 全温振荡器 ( 7 ) s h b 一循环水式多用真空泵 ( 8 ) k q 一2 5 0 d b 型数控超声波清洗器 ( 9 ) 7 5 4 型紫外可见分光光度计 ( 1 0 ) 7 2 3 型可见分光光度计( 山东高密彩虹分析仪器有限公司) ( 1 1 ) m e t t l e rt o l e d o3 2 0p hm e t e r ( 1 2 ) l d i 1 7 0 0 激光解吸电离分行时间质谱仪 1 2 东北师范大学硕士学位论文 二、实验结果 2 1 菌种的分离与纯化 按照1 3 1 所述方法对扰顺石油三厂的活性污泥进行菌种的筛选和分离。将经摇瓶 富集培养后的菌液划线接种到以p b s 粉末为唯一碳源的平板培养基上。挑取单菌落进 行分离纯化。将获得的纯化菌株接种在斜面培养基上，4 保存待用。 2 2p b s 解聚酶高产菌株的筛选 2 2 1 不同菌株降解p b s 粉末的速率 采用点植法培养经过分离纯化得到的四种可降解p b s 的菌株，5 d 后测量菌落直径， 结果见表2 1 。 表2 1 不同菌株生长速率 2 2 2 不同菌株降解p b s 膜的速率 将x h 0 5 0 卜x h 0 5 0 4 菌株活化3 5 d 后，接种于以p b s 为唯一碳源的液体培养基，每 天同一时间取样，连续取得7 d 发酵液，分别测定发酵液中降解酶活性，绘制酶活性曲 线，结果如图2 1 所示。 2 1 5 0 5 0 23456 7 t d 一x h 0 5 0l 卜_ 一x h 0 5 0 2 勃x h 0 5 0 3 * 一x h 0 5 0 4 图2 1 不同菌株酶活曲线比较 1 3 东北师范大学硕士学位论文 通过对比可以发现，菌株x h 0 5 0 1 的酶活力相对较高，证明菌株x h 0 5 0 1 在筛选出的 菌株当中降解能力较强，故选择x h 0 5 0 1 菌株进行进一步的实验。 2 3 菌种的初步鉴定 对于筛选出来的可降解p b s 的四种菌株，根据它们的酶活测定结果，选择x h 0 5 0 1 菌种进行初步鉴定以及p b s 解聚酶性质的研究。 2 3 1 菌落特征 ( 1 ) 生长速度：2 8 培养3 d ，菌落直径为5 m m ( 图2 2 ) 。 ( 2 ) 质地：絮状。 ( 3 ) 颜色：培养初期白色，渐变粉红色。 ( 4 ) 边缘：光滑、不完整。 ( 5 ) 孢子数量：分生孢子丰富。 ( 6 ) 气味：具霉味。 1 4 东北师范大学硕士学位论文 图2 2x h 0 5 0 1 菌落生长情况 2 3 2 分生孢子阶段 菌丝比较发达，分枝成网状， 分支成伞状。菌丝属于真菌菌丝， 而峰硬的壁和无孔口的子囊果。 白色，有隔。孢子囊黑色，在孢囊梗顶端形成，末端 无性孢子是分生孢子，有性世代不常发生，具有明显 东北师范大学硕士学位论文 1 6 溪 鬻 一 图2 3) 【1 1 0 5 0 l 菌株的不同生长阶段 2 3 3 鉴定结果 由以上观察到的菌落特征，分生孢子阶段特征以及该菌的整个生长过程，根据魏景 超的真菌鉴定手册进行检索后得出结论：这种真菌是真菌门、予囊菌纲、真子囊菌亚纲、 曲霉目、曲霉科、杂色曲霉。 2 4 分生孢子的诱变 2 。4 1 致死率曲线 采用紫外线进行诱变，一般而言，致死率达到7 5 左右时，产生正突变的几率较高， 有利于进一步的筛选，图2 4 给出了x h 0 5 0 1 菌株分生孢子经紫外线照射后的致死率曲 线。 露 鬻 一 东北师范大学硕士学位论文 1 0 0 8 0 水 蒋6 0 赛4 0 2 0 o 1 02 03 04 05 06 0 弋 s 图2 - 4x h 0 5 0 1 菌株分生孢子经紫外线照射后的致死率曲线 由图2 4 可知，经紫外线照射3 0 s 后，x h 0 5 0 l 菌株分生孢子的致死率为7 3 5 ，致 死率接近7 5 ，因此，选用照射3 0 s 后的菌株做微波诱变。然后，经过平板初筛和摇瓶 复筛，得到一株遗传相对稳定的突变株，编号为) ( h 0 5 0 1 一a 。 2 4 2 原始菌株与突变菌株酶活性的比较 通过摇瓶发酵的方法，分别测定原始菌株x h 0 5 0 1 及其突变株x h 0 5 0 l a 降解p b s 粉末的速率。连续取7 d 的发酵液，测定酶活性，结果见图2 5 。由得到的数据计算出，突 变株最大酶活力比原始菌株提高3 8 8 9 3 o 234567 t d + x h 0 5 0 l + x h 0 5 0 1 一a 图2 5 原始菌株和突变株酶活力比较 东北师范大学硕士学位论文 2 4 3 遗传稳定性检测 将原始菌种x h 0 5 0 1 及筛选出的突变株x h 0 5 0 1 一a 连续传代培养，共传6 代，结果 表明，突变株x h 0 5 0 l a 降解特性能稳定遗传且总是优于原始菌株。鉴于突变株x h 0 5 0 1 一a 降解能力的增强，将其用于大批发酵，提纯降解酶。 2 5p b s 解聚酶的分离纯化( 所有操作均在4 下进行) 2 5 1 粗酶液的制备 制备x h 0 5 0 l 突变株发酵1 2 0 h 的粗酶液5 0 0 0 m l ，测定酶活力及蛋白浓度。 2 5 2 超滤浓缩 粗酶液经超滤器浓缩，截留分子量为1 0 0 0 0 ，测定酶活力及蛋白浓度。 2 5 3d e a e a 2 5 弱阴离子交换层析 用o 0 l m o l lt r i s h c l ( p h = 8 6 ) 缓冲液平衡d e a e a 2 5 柱，然后将超滤液用同样 的缓冲液中透析然后上柱分离，洗脱液与平衡缓冲液相同，流速3 0 m l 1 1 ，每管1 0m l ， 于2 8 0 n m 进行紫外检测，记录洗脱液的吸收值变化。测定各管的酶活。洗脱曲线见图 2 6 。 o 1 8 o 1 6 o 1 4 0 1 2 。o 1 o 0 8 o 0 6 o 0 4 0 0 2 o l6 l l1 6 2 12 63 13 64 l4 65 15 66 l6 67 17 68 18 69 l9 6 + 蛋白含量+ 酶活力 图2 6p b s 解聚酶的d e a e a 2 5 离子交换层析洗脱图 由图2 6 可以看出，酶液经d e a e a 2 5 离子交换层析分离后，x h 0 5 0 1 突变株p b s 解聚酶酶活高峰出现在4 4 管左右，同时在4 3 管左右有一相应的蛋白峰基本对应，在 2 0 管左右也有一蛋白峰，但是酶活不高。将处于酶活高峰的蛋白进行s d s 电泳，得到 单一的谱带。 1 9 一一e，nr蜒避 5 5 5 5 3 3 2 2 1 1 0 o 东北师范大学硕士学位论文 表2 2p b s 解聚酶的分离纯化 2 5 4 除盐 将浓缩液装入透析袋中，外面用聚乙二醇粉末包埋4 8 h ，除去罩面的多余的水分和 盐。 2 6 酶的基本性质 2 6 1 酶的分子量的测定 酶液经d e a e a 2 5 弱阴离子交换层析后，将其与兔磷酸化酶等6 种己知分子量的标 准蛋白进行s d s p a g e 电泳，结果如图2 7 ，图右侧为标准蛋白带，左侧即是由突变株 x h 0 5 0 1 的发酵液中提纯的解聚酶所对应的位置。再以相对迁移率对分子量作图。根据 该酶在s d s p a g e 电泳中的迁移行为，通过作图法求出其分子量为4 4 7 k d 。 9 7 4 0 0 兔磷酸化酶b 6 6 2 0 0 牛血清白蛋白 r a b b i tp h o s p h o r y l a s eb b o v i ns e l l l ma l b u m i n 4 3 0 0 0兔肌动蛋白 r a b b i ta c t i n 310 0 0牛碳酸酐酶b o v i nc a r b o n i ca n h y d r a s e 2 0 l o o 胰蛋白酶抑制剂t r y p s i ni n l l i b i t o r 1 4 4 0 0 鸡蛋白血清 h e ne g gw h i t el y s o z y m e 图2 7p b s 解聚酶的s d s p a g e 2 6 2 温度对酶活力和稳定性的影响 在不同温度( 1 0 7 0 ) 下测定酶活力，测得p b s 解聚酶的最适酶活温度为4 0 ，将酶液在不同温度下( 1 0 7 0 ) 保温2 h ，然后测其酶活力，结果( 见图2 8 ) 表明，此p b s 解聚酶有较好的热稳定性，在4 0 保温2 h ，酶活力保留5 3 ，但在5 5 保温2 h 后，酶几乎完全失活。 2 0 东北师范大学硕士学位论文 永 r 烘 避 莨 罂 水 r 烬 溢 靛 罂 1 02 03 04 05 06 07 0 t 。c 1 02 03 0 4 0 5 0 6 07 0 飞卜c 图2 8 不同温度下酶活力和稳定性的测定 a ：酶的最适温度b ：酶的温度稳定性 2 6 3p h 对酶活力和稳定性的影响 在不同p h 反应体系中测定酶活力，结果表明，此p b s 解聚酶的最适反应p h 为8 6 。 将p b s 解聚酶与不同的p