（动物学专业论文）人牛异种核移植构建异构胚的实验研究.pdf

王晓玲人一年异种核移植构建重构胚的实验研究 第一部分：实验论文 人一牛异种核移植构建异构胚的实验研究 摘要 治疗性克隆( t h e r a p e u t i cc l o n i n g ) 是体细胞核移植技术与人胚胎干细胞技术 相结合的产物。它是指以患者的体细胞作为供体，移入去核的卵母细胞内，将 异构胚培育至囊胚并从内细胞团中分离培养出胚胎干细胞，从而为患者提供与 其自身遗传物质一致的组织细胞或器官，用于患者疾病的治疗。目前“治疗性 克隆”己经成为研究热点，但由于人类卵母细胞来源非常有限且受到法律伦理 等多种因素的限制，很难获得足够数量的人卵母细胞用于实验研究。异种核移 植技术的出现则为解决这一难题提供了可能。本实验目的在于探讨牛成熟卵母 细胞能否支持人胎儿成纤维细胞核重编程，使异构胚在体外完成其早期发育， 并进一步优化异种核移植过程的融合条件、发育条件等各个环节。 一、人胎儿成纤维细胞的体外培养 1 通过绘制第六代人胎儿成纤维细胞生长曲线，研究了人胎儿成纤维细胞 的增殖规律。结果表明：人胎儿成纤维细胞生长旺盛，生长增殖的滞留期为1 2 天，对数生长期为3 - 6 天，平台期为7 8 天。 2 以d m s o 为冷冻保护剂，采用手工冷冻的方法对人j j 台j l , 成纤维细胞进行 冷冻保存。结果表明：人胎儿成纤维细胞可用该方法冷藏。 3 通过染色体核型分析，研究人胎儿成纤维细胞体外培养传至第1 0 代时 的状态。结果表明：人胎儿成纤维细胞体外培养传至第1 0 代时，染色体为正常 内蒙古大学硕士学位论文 二倍体的细胞比例为7 5 ，未见细胞内颗粒增多、折光性差等细胞老化现象。 4 以血清饥饿培养法和常规培养法处理第八代和第二十代人胎儿成纤维细 胞后，通过流式细胞仪分析细胞所处的周期。结果表明：血清饥饿培养法和常 规培养法均可使不同代次的人胎儿成纤维细胞同步于g d g l 期，但第二十代细胞 经饥饿培养后，g o g 1 期细胞的百分比显著高于其他三组。 二、人牛异种核移植构建异构胚 1 异种核移植实验表明：牛成熟卵母细胞可以支持人胎儿成纤维细胞核完 成重编程，异构胚可以在体外完成其早期发育。 2 以处于不同细胞周期的不同代数的人成纤维细胞为供体进行人牛异种 核移植，比较不同细胞周期的不同代数的供体细胞对核移植融合率、发育率和 囊胚率的影响。结果表明：经饥饿处理与未经饥饿处理的供体细胞均可支持异 构胚完成早期发育，但饥饿处理对于低代次细胞来说可能是非必要因素，但对 于高代次细胞则是提高核移植效率的必要步骤，饥饿处理可使核移植融合率和 发育率显著的提高。 3 比较了以4 冷藏和直接消化为供体细胞的准备方法时，异构胚的体外 发育情况。结果表明：两种方式都可用于核移植，且两组之间无显著差异。因 此，冷藏可作为一种简便有效的供体细胞准备方法。 4 比较了电压为1 6 0 v m m 、脉冲间隔1 s ，电压为1 8 0 v m m 、脉冲间隔1 s 和电压为2 0 0 v r a m 、脉冲间隔0 1 s 三组融合参数，通过融合率、卵裂率和异构 胚的死亡率选择效果最好的一组参数。结果表明：当融合参数为2 0 0 v m m ，脉 冲时长1 0 0 “s ，脉冲间隔o 1 s 时，异构胚的融合效果最好，融合率为6 1 9 0 。 5 比较了采用商品化的人胚胎发育液q u e e n s 和传统的牛胚胎发育液 三堕垒 全：墨翌苎壁垫塑堕兰塑暨竺墨竺堡墨 s o f a a 培养异构胚时，异构胚的体外发育情况。结果表明：二者均可支持异构 胚完成体外早期发育，且卵裂率、桑囊发育率上差异不显著。 6 通过胚胎染色体的数目及形态初步确定了人牛异种异构胚的核遗传物 质来源于人。 关键词：治疗性克隆，异种核移植，人胎儿成纤维细胞 内蒙古大学硕士学位论文 i n t e r s p e c i e sn u c l e a rt ra n s p i 。a n t 盯i o n b e t w e e nh u m a nan db o v i n e a b s t r a c t “t h e r a p e u t i cc l o n i n g ”i sb a s e do nt h et e c h n o l o g yo fs o m a t i cc e l ln u c l e a rt r a n s f e r a n dh u m a ne sc e l l i tu s e sp a t i e n t s s o m a t i cc e l l sa sd o n o ra n dt h ee n u c l e a t e do o c y t e a sr e c e p t o r a f t e rt h er e c o n s t r u c t e de m b r y o sa r ec u l t u r e dt ob l a s t o c y s t s ，c e l l si s o l a t e d f r o mt h ei n n e rc e l lm a s sa r eu s e dt oe s t a b l i s hn e we m b r y o n i cs t e mc e l ll i n e s t h ee s c e l ll i n e sc o n t a i n i n gt h ep a t i e n t sg e n e t i cm a t e r i a la r eu s e dt oc u r et h ep a t i e n th i m s e l f n o w “t h e r a p e u t i cc l o n i n g ”h a sb e e nr e s e a r c hh o t s p o t b e c a u s eo ft h er e s t r i c t i o no f l a wa n do t h e rf a c t o r s ，i ti sd i f f i c u l tt og a i ne n o u g hh u m a no o c y t e sf o rt h er e s e a r c h a s t h et e c h n o l o g yo fi n t e r s p e c i e sn u c l e a rt r a n s f e ra p p e a r e d ，i ti sp o s s i b l et os o l v et h e s e p r o b l e m s t h i ss t u d y f o c u s e do nw h e t h e rh u m a nf e t a lf i b r o b t a s tc e l l sc a nb e r e p r o g r a m m e d i nb o v i n eo o c y t e sa n dt h e a b i l i t y o fi nv i t r o d e v e l o p m e n to f h u m a n - b o v i n ei n t e r s p e c i e sr e c o n s t r u c t e de m b r y o s ，m e a n w h i l et h ef u s i o nc o n d i t i o n a n dc u l t u r es y s t e mo ft h er e c o n s t r u c t e de m b r y o sw e r er e s e r a c h e d 1 c u l t u r eo ft h eh u m a nf e t a lf i b r o b l a s tc e l l si nv i t r o ( 1 ) p r o l i f e r a t i o n p r o m o t i n gr u l eo ft h eh u m a nf e t a lf i b r o b l a s tc e l l si n6 山p a s s a g e r v 王晓玲人一牛异种核移植构建重构胚的实验研究 w e r es t u d i e db yd r a w i n gt h eg r o w t hc u r v e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eg r o w t h w a sv e r yp r o s p e r o u s l a t e n tp h a s ei s1 - 2d a y l o g a r i t h m i cg r o w t hp h a s ei s3 - 6d a y p l a t e a up h a s ei s7 - 8d a y ( 2 ) t h eh u m a n f e t a lf i b r o b l a s tc e l l sw e r e c r y o p r e s e r v e d w i t hd m s oa s c r y o p r o t e c t a n t si nm a n u a lw a y t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h i sc r y o - p r e s e r v a t i o n m e t h o di sa ne f f e c t i v ew a yf o rt h eh u m a nf e t a lf i b r o b l a s tc e l l s ( 3 ) t h eh u m a nf e t a lf i b r o b l a s tc e l l si n1 0 mp a s s a g ew e r eo b s e r v e db yt h ek a r y o t y p e a n a l y z e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t7 5 o f t h ec e l l sm a i n t a i n e dd i p l o i dk a r y o t y p e i n1 0 t hp a s s a g e s c e l la g i n gp h e n o m e n o nw a sn o to b e r v e d ( 4 ) t h eh u m a nf e t a lf i b r o b l a s tc e l lc y c l e sw e r ed e t e c t e db yf l o wc y t o m e t r ya f t e r c e l l si n8 血a n d2 0 mp a s s a g ew e r et r e a t e dw i t hs e r u ms t a r v a t i o na n dg e n e r a lc u l t u r e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eh u m a nf e t a lf i b r o b l a s tc e l l sc o u l db es y n c h r o n i z e dt o g o g 1b yb o t ht r e a t m e n t s a f t e rt h e2 0 也p a s s a g ec e l l sw e r et r e a t e db ys e r u m s t a r v a t i o n ，t h ec e l lp e r c e n t a g eo fg o g 1w a ss i g n i f i c a n th i g h e rt h a nt h a to ft h eo t h e r t h r e eg r o u p s 2 r e c o n s t r u c t i o no fh u m a n - b o v i n ee m b r y o sb yi n t e r s p e c i e sn u c l e a rt r a n s f e r ( 1 ) t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eh u m a nf e t a lf i b r o b l a s tc e l l sc o u l db e r e p r o g r a m m e di n b o v i n eo o c y t e sa n dr e c o n s t r u c t e de m b r y o sc o u l dd e v e l o pt o b l a s t o c y s ts t a g ei nv i t r o ( 2 ) w h e nt h ed o n o rc e l l sw e r ei nd i f f e r e n tc e l lc y c l e sa n dd i f f e r e n tp a s s a g e s ，t h e f u s i o nr a t e s ，c l e a v a g er a t e sa n db l a s t o c y s tr a t e so fr e c o n s t r u c t e de m b r y o sw e r e c o m p a r e d t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a ts t a r v a t i o nt r e a t m e n tm i g h tn o tb et h e v e s s e n t i a lf a c t o rf o rl o wp a s s a g ed o n o rc e l l s w h e nd o n o rc e l l sw e r ei nh i g h p a s s a g e s ，s t a r v a t i o nt r e a t m e n tw a st h ei m p o r t a n tw a yt oi n c r e a s ef u s i o nr a t e sa n d d e v e l o p m e n tr a t e ss i g n i f i c a n t l ya n di m p r o v et h ee f f i c i e n c yo fi n t e r s p e c i e sn u c l e a r t r a n s f e r ( 3 ) t h ee f f e c t so fd o n o rc e l lp r e p a r a t i o nm e t h o d s ( d i r e c t l yd i g e s t e da n ds t o r e da t4 、o nr e c o n s t r u c t e de m b r y o sw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tb o t ho f t w om e t h o d sc o u l db eu s e di nh u m a n b o v i n en u c l e a rt r a n s f e r t h e r ew a sn o t s i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c eb e t w e e nt w om e t h o d s r e f r i g e r a t i o ni s ac o n v e n i e n ta n d e f f i c i e n td o n o rc e l lp r e p a r a t i o nm e t h o d ( 4 ) h u m a n b o v i n er e c o n s t r u c t e de m b r y o sw e r ef u s da t t h r e ep a r a m e t e r s ，p u l s e - s t r e n g t h1 6 0 v r a m ，p u l s e i n t e r v a ll s ；1 8 0 v m m ，p u l s e i n t e r v a ll s ；2 0 0 v m m ， p u l s e - i n t e r v a l0 1 s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eb e s tf u s i o nr a t e s ( 6 1 9 0 ) w e r e o b t a i n e db yp u l s e s t r e n g t h2 0 0 v m m ，p u l s e w i d t h1 0 0 ，p u l s e 。i n t e r v a l0 1 s ( 5 ) h u m a n - b o v i n er e c o n s t r u c t e de m b r y o sw e r ec u l t u r e di nq u e e n s a n ds o f a a m e d i u mr e s p e c t i v e l y t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tb o t ho ft w om e d i u m sc o u l ds u s t a i n d e v e l o p m e n to fh u m a n b o v i n er e c o n s t r u c t e de m b r y o si n v i t r o t h e r ew a sn o t s i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c ei nc l e a v a g er a t e sa n dm o r u l a b l a s t o c y s t r a t e s ( 6 ) t h er e c o n s t r u c t e de m b r y o s w e r e a n a l y s i s e d i nn u m b e ra n d s h a p eo f c h r o m o s o m e s ，a n d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h en u c l e a r so fe m b r y o sw e r ed e r i v e df r o m h u m a ns o m a t i cc e l l s - 王晓玲人一牛异种核移植构建重构胚的实验研究 k e y w o r d s ：t h e r a p e u t i cc l o n i n g ，i n t e r s p e c i e sn u c l e a rt r a n s p l a n t a t i o n ，h u m a nf e t a l f i b r o b l a s tc e l l 王晓玲人一牛异种核移植构建重构胚的实验研究 缩略词表 ( a b b r e v i a t i o n s ) ，3 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除本文已 经注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果也不包含为获得囱墓直盍堂及 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 日 期： 在学期间研究成果使用承诺书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：内蒙古大学有权将学位论文的全 部内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘，允许编入有关数据库进行检索， 也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。为保护学院和导师的知识产权，作者在学期 间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后使用涉及在学期间主要研究内容或研究成果，须征得内蒙占 大学就读期间导师的同意；若用于发表论文版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表。 学位论文作者签名： 日期： 型指导黼签名：堡宣：哆 珥耳日辄州 内蒙古大学硕士学位论文 第一章人胎儿成纤维细胞的分离与体外培养 前言 自从1 9 9 7 年w i l m u t 等首次用成年乳腺细胞作为供体获得克隆绵羊d o l l y 以来l l l ，种间核 移植的研究便成为新的热点。而体细胞培养作为提供供体细胞的主要手段，决定着能否给核 移植提供稳定而适宜的供核细胞。哺乳动物细胞培养始于上个世纪初，经过近百年的发展， 现己成为一种重要的常规技术广泛的应用于生物、医学等各个研究领域。成纤维细胞是结缔 组织最丰富的细胞部分，具有较强的分裂增殖能力，适应性强，是最容易培养的动物细胞类 型之一。本试验进行了常规的人成纤维细胞的培养，并对血清饥饿处理后的细胞进行分析， 旨在探讨血清饥饿法处理细胞的效果。 细胞低温冷冻保存是细胞培养工作中的重要环节。冷冻保存不仅可以解决体外培养细胞 的老化问题，也可以较大批量的制作细胞以供长期使用，而且还能解决细胞的异地使用和运 输问题吼在克隆动物研究中，对体外培养的供体细胞的冷冻保存是十分必要的。本实验对 人胎儿成纤维细胞进行冷冻保存试验，旨在为异构胚的构建提供长久、稳定的细胞来源。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 主要仪器设备 c 0 2 培养箱( b i n d e r ) 、恒温水浴箱、超净工作台、超低温冰箱( s a n y o ) 、液氮容器、 离心机( 上海安亭，t g l 广1 6 g ) 、倒置相差显微镜( n i k o n ) 、血球计数板、流式细胞仪( b e c k m a n q u a n t a ) 。 1 1 2 主要试剂及耗材 d m e m 培养基为s i g m a 产品，无机盐类及d p b s ( 一) 为日本和光试剂，胰蛋白酶为 s i g m a 产品，标准胎牛血清为t b d 产品，其余试剂为国产分析纯，细胞培养板、培养瓶为 n u n c 产品，其余玻璃器皿及耗材均为国产。 王晓玲人一牛异种核移植构建重构胚的实验研究 1 1 3 溶液配方 ( 1 ) d m e m ( 高糖1 培养基 一 高糖d m e m 干粉1 瓶( 1 l ) ，溶于9 0 0 m l 三蒸水中，添加n a h c 0 33 7 9 ，h e p e s2 3 8 9 ， 调节p h 至7 2 - 7 4 ，加入青霉素及链霉素，使其终浓度分别为1 0 0 u m l 及1 0 0i _ t g m l ，磁力搅 拌助溶，然后定容至1 0 0 0 m l ，采用o 2 2 i t m 滤膜，正压过滤除菌，1 0 0 m 1 分装，4 。c 保存。使 用前添加胎牛血清( f b s ) ，使其终浓度为1 0 0 m l l 。 ( 2 ) 0 2 5 胰蛋白酶e d t a 分别称取胰蛋白酶o 2 5 9 、e d t a o 0 2 9 ，加入1 0 0 m l 六蒸水，o 2 2 r i m 滤器过滤灭菌后分 装入1 5 m l 的离心管中，一2 0 储存。 ( 3 ) 0 0 7 5 m 0 1 l k c i 溶液 o 5 5 9 2 9k c i 溶于1 0 0 m l 三蒸水中，磁力搅拌助溶。4 c 保存。 ( 4 ) 固定液 按甲醇：冰醋酸= 3 ：1 比例，用前配制。 ( 5 ) 1 ：1 0g i e m s a 染色液 g i e m s a 原液：p b s 缓冲液= 1 ：9 ( 6 ) 细胞冷冻液 一 f b s + 1 0 d m s o 1 2 研究方法 1 2 1 人胎儿成纤维细胞的培养 人胎儿成纤维细胞由上海交通大学医学部盛慧珍老师合作提供，扩增培养后冷冻保存， 并运回本实验室。到本实验室后，进行解冻并传代培养。 1 2 2 培养细胞的传代以及生长曲线的测定 传代培养：当培养细胞生长铺满培养皿底时，用0 2 5 胰蛋白酶e d t a 消化细胞。当成 纤维细胞变圆后吸弃消化液，加入含有血清的培养液中止消化，用吸管吹打使其快速悬浮， 悬液以1 5 0 0 r p m 离心，用培养液洗涤一次沉淀。重悬细胞，以1 5 1 0 5 个细胞孔接种于六孔 板中传代培养。如此进行多次传代。 传代细胞生长曲线的测定：将培养至第六代的人胎儿成纤维细胞用o 2 5 胰蛋白酶e d t a 消化，调整细胞浓度为2 1 0 4 m i ，接种于2 4 孔细胞板中，3 7 。c 、5 c 0 2 、饱和湿度培养。 每隔2 4 h 消化收集细胞，用血球计数板计数3 个孔的细胞数，每孑l 计数三次，求取平均值。 内蒙古大学硕士学位论文 每隔2 3 d 更换细胞培养液。连续七天计数，绘制生长曲线。 1 2 3 培养细胞的冷冻以及复苏 在3 7 c 条件下，用o 2 5 胰蛋白酶e d t a 消化贴壁生长至对数期( 传代培养3 - 5 天) 的 细胞5 m i n ，1 5 0 0 r p m 离心5 r a i n ，收集细胞，用细胞冷冻液以1 1 0 6 1 1 矿个m l 的浓度悬浮 细胞。细胞悬液装入2 m l 冷冻管中，先于4 c 放置0 5 h ，后用塑料泡沫包好在一2 0 c 放置2 h ， 结冰后在液氮表面停留5 m i n 后投入液氮内，长期保存。 从液氮罐中取出冻存管，3 8 c 的水浴1 - 2 m i n ，使其完全溶解。将冻存管放入超净工作台， 将细胞悬液移入l o m l 离心管中，加入培养液，1 5 0 0 r p m m i n 离心5 m i n ，弃上清，加入 d m e m + 1 0 f b s 重悬细胞，离心( 1 5 0 0 r p m m i n , 5 m i n ) 洗涤以去除冷冻保护剂，弃上清，加 入d m e m + 1 0 f b s 培养液重悬细胞接种于6 0 m m 培养皿中，3 7 。c 、5 c 0 2 、饱和湿度培养， 2 4 h 后更换培养液，生长至约7 0 8 0 汇合后，传代扩大培养。 1 2 4 人胎儿成纤维细胞的核型分析 ( 1 ) 取第1 0 代对数期细胞，用培养液制成细胞悬液，接种，移入培养箱中培养5 4 h 左右( 8 0 汇合) 。 ( 2 ) 向培养皿中加入终浓度为0 5 m l 的秋水仙素培养液，在培养箱中继续培养4 到6 h 。 终止培养后，轻轻摇动培养皿，并用吸管在细胞表面反复吹打，使处于分裂中期的细胞 吹起，收集培养液于离心管中，离心( 1 0 0 0 q o m ，5 - 1 0 r a i n ) ，弃上清。 ( 3 ) 逐滴加入o 5 m l 预热到3 7 。c 的0 0 7 5 m o l 的k c i 溶液，混匀。随即补加至5 m l ，用吸管 轻轻吹打均匀，3 7 静置3 0 r a i n ，使细胞膨胀。 ( 4 ) 向离心管中逐滴加入l m l4 c 预冷的新鲜固定液，混匀，预固定l m i n 左右，离心 ( 1 0 0 0 r p m ，5 1 0 m i n ) ，弃上清。 ( 5 ) 沿管壁缓缓加入预冷的新鲜固定液5 m l ，边加边振荡，并用吸管轻轻吹打均匀，固定 3 0 r a i n ，离心( 1 0 0 0 r p m 5 1 0 m i n ) ，弃上清。 ( 6 ) 重复步骤5 后，加入0 5 m l 固定液，充分分散细胞。 ( 7 ) 取2 0 。c 冰冻的载玻片，距离1 5 c m 左右高度向玻片滴1 2 滴细胞悬液，并轻轻吹开，使 细胞平铺于载玻片上，然后室温放置，令其自然干燥。 ( 8 ) 用新鲜g i e m s a 染色液染色2 0 3 0 m i n ，流水冲洗玻片背面，晾干。 ( 9 ) 显微镜下观察染色体数目。 1 2 5 细胞周期的分析 将实验分四组：第十代一般培养处理组( 1 0 f b s ) ，第十代血清饥饿组( o 5 f b s ) ， 王晓玲人一牛异种核移植构建重构胚的实验研究 第二十代一般培养处理组( 1 0 f b s ) ，第二十代血清饥饿组( 0 5 f b s ) 。将各组人胎儿成纤 维细胞移去培养液，用p b s 清洗2 3 次，加入消化液消化各组细胞，并收集于1 5 m l 离心管 中，用p b s 清洗2 3 次，弃上清，加l mlp b s 重悬细胞，制成单细胞悬液，加入2 m ld n a 荧光染料( b e c k m a n 公司d n a 染色试剂盒1 ，室温避光染色1 5 r a i n ，流式细胞仪分析。 l 2 6 统计学处理 实验所得数据应用s p s s l l 0 统计软件进行处理，采用方差分析探讨不同处理方法诱导人 胎儿成纤维细胞处于g o g 1 期情况。均数用i 表示，p 0 0 5 为显著差异，有统计学意义。 2 、结果 2 1 人胎儿成纤维细胞生长曲线的测定 o e 七 b 一 o 妊 暮 居 d od ld 2d 3d 4d 5d 6d 7 培养天数 图1 1 体外培养的人胎儿成纤维细胞的生长曲线 f i g1 1t h eg r o w t hc u r v eo fh u m a n f e t a lf i b r o b l a s tc e l l sc u l t u r e di nv i t r o 人胎儿成纤维细胞以2 6 8 x 1 0 4 孔接种于2 4 孔培养板中，每隔三天换液一次，每隔2 4 h 计数3 孔细胞数，取平均值。连续计数7 天，以培养天数为横坐标，三孔细胞数的平均值为 纵坐标绘制人胎儿成纤维细胞生长曲线。从图中可以看出人胎儿成纤维细胞生长增殖的滞留 期为o 一2 天，在培养至第三天进入对数生长期，细胞快速增加，至第六天时细胞数量达高峰 进入平台期。 沥加坫加0 0 内蒙古大学硕士学位论文 2 2 人胎儿成纤维细胞解冻复苏培养 冻存的人胎儿成纤维细1 地经解冻复苏培养，1 0h 后就已经贴壁，4 d 即可铺满培养皿，并 仍保持其j 下常形态。因此，常规的细胞冷冻保存及解冻复苏培养的方法也同样适用于人胎儿 成纤维细胞。( 见图版一1 ，2 ) 2 3 人胎儿成纤维细胞的核型分析 取第1 0 代人胎儿成纤维细胞制备中期相染色体，随机抽取3 2 个分散较好的中期相进行 染色体计数，其中2 4 个核型f 常，核型正常率为7 5 ；正常核型为2 n = 4 6 。( 见图1 2 ) 图1 2 第10 代人胎儿成纤维细胞中期染色体( 2 0 0 x 核型为2 n = 4 6 ) f i g 1 2m e t a p h a s ec h r o m o s o m e so fh u m a nf i b r o b l a s tc e l li n1 0 p a s s a g e ，2 n = 4 6 ( 2 0 0 x ) 2 4 细胞周期的分析 用流式细胞仪检测血清饥饿组和非饥饿组g 1 ( 3 0 、s 和g 2 m 各期细胞的百分率，结果见 表1 1 。由表1 1 可知，第二十代细胞经饥饿培养后，g l g o 期成纤维细胞的百分率为 ( 8 9 0 8 0 + _ 0 2 1 9 ) ，显著高于其他三组；第八代未经饥饿处理的成纤维细胞s 期的百分率为 ( 2 0 2 0 2 _ + 6 2 3 4 ) ，显普高f 第二十代细胞经饥饿培养的细胞( 7 4 4 5 _ + 0 3 2 5 ) ；第八代经 饥饿培养组g z m 期的百分率( 8 1 6 2 + _ 0 2 8 9 ) 显著高于第二十代饥饿组( 3 4 8 7 _ + 0 1 3 0 ) 和 非饥饿组( 4 7 7 8 + _ 0 3 5 4 ) 。( 见图版一3 ，4 ，5 ，6 ) 王晓玲人一牛异种核移植构建重构胚的实验研究 袁1 1 不同处理方法对成纤维细胞周期的影响( i s ) t a b l e1 1e f f e c t so fd i f f e r e n th e a m e n tm e t h o d s0 1 1c e l lc y c l e 注：同一列字母不同表示差异显著( p 0 0 5 ) n o t e ：i f f e r e n ts m a l ll e t t e r si ns a m ec o l u m ni n d i c a t es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p 0 0 5 ) 3 、讨论 在己经被用于成功获得克隆动物的供核体细胞中，胚胎成纤维细胞的应用最为广泛，尤 其在进行生产转基因、基因敲除等基因组修饰的大动物克隆时，胚胎成纤维细胞更是首选。 l e e 等比较了输卵管上皮细胞、颗粒细胞以及胚胎成纤维细胞和成体成纤维细胞的核移植重 组胚的发育情况，认为胚胎成纤维细胞最适于做猪体细胞核移植的供体细胞p 】。 s a i k h u n 等 分别使用胚胎成纤维细胞和成体成纤维细胞进行了水牛异种核移植的研究，证明胚胎成纤维 细胞作为核供体比成年成纤维细胞作为核供体所得异种重组胚的发育率要高1 4 j 。此外，因为 胚胎成纤维细胞较易获得，体外培养时，可以在较长时间内保持正常的染色体倍性而不发生 转化，留给人们较多的时间进行转基因操作和后继的阳性细胞筛选。 3 1 人胎儿成纤维细胞生长曲线的测定 人胎儿成纤维细胞生长旺盛，增殖能力强。从其生长曲线可以看出，接种第一天细胞刚 刚贴壁，处于恢复期，细胞数量有所下降。从第三天开始细胞恢复旺盛的增殖分裂，进入对 数生长期，第四、五天进入增殖高峰期，六天后进入平台期，细胞逐渐长满，之后由于接触 抑制开始走向衰亡。 内蒙古大学硕士学位论文 3 2 培养细胞的冷冻以及复苏 早在4 0 年代人们就己证明人类精子对- 7 0 c 乃至一1 9 6 超低温具有一定抵抗力，随后又 发现一定浓度的甘油对低温保存动物细胞具有良好的保护作用，于细胞悬液中加入甘油可明 显提高细胞在一7 0 。c 存活率。1 。6 0 年代另一种化学试剂一二甲基亚砜( d m s 0 ) 又能用作细胞的 低温保护剂“3 ，随后又发现了乙二醇、丙二醇等低温保护剂，使细胞低温保存使用的冷冻保 护剂选择范围更广泛。这些保护剂均属于低分子中性物质，溶液中易与水结合，发生水化作 用，使溶液粘性增加，从而弱化水的结晶过程达到保护目的。在这些冷冻保护剂中，d m s 0 、 乙二醇、丙二醇流动性好，操作方便，而甘油十分粘稠，操作较麻烦，其中又以d m s 0 的冷冻 效果最佳。从冷冻方法来看，有程序化冷冻和手工冷冻，程序化冷冻由于降温缓慢而有规律， 冷冻效果明显高于手工冷冻，但程序化冷冻需要购置程序冷冻仪，价格昂贵，操作较复杂， 而手工冷冻则经济又方便。 本试验采用了以d m s 0 为冷冻保护剂手工冷冻的方法冷冻人胎儿成纤维细胞，并得到了较 好的结果，证明此方法对人胎儿成纤维细胞的冷冻保存是切实可行的。 3 3 人胎儿成纤维细胞的核型分析 体细胞的倍性是否正常是直接影响克隆结果的重要因素之一。体外培养的影响因素，如 培养温度、培养气体环境、培养液中血清浓度、所用基础培养基、换液间隔、传代频率、接 种密度等都可能影响细胞的生长、增殖以及细胞染色体倍性等。染色体异倍性增加将直接导 致克隆效率下降或者不能用做核移植供体细胞【“。本实验培养的人胎儿成纤维细胞传到第1 0 代，染色体数目j 下常的比例在7 5 ，二倍体细胞仍占优势，可作为核移植的核供体。 3 4 细胞周期的分析 供体细胞与受体卵母细胞的细胞周期阶段协调是核移植成功的关键因素之一。尽管血清 饥饿诱导细胞进入g 。期不是获得克隆动物所必需的，但目前一般认为，这种处理对供体细胞 核重编程有益【7 1 。诱导体外培养细胞进人g d g l 期的方法有多种，常用的有：接触抑制法： 利用细胞贴壁生长接触抑制的特性将其调节在g d g - 期。这种方法只需将细胞体外培养至 1 0 0 汇合成单层，即可使细胞自发的停留在生长静止期；低温处理法：将细胞置于4 c 处 理2 - 1 0 h ，由于细胞的d n a 合成在低温条件下受到抑制或停止，从而使细胞群中的绝大多数 王晓玲人一牛异种核移植构建重构胚的实验研究 细胞阻滞于g 1 期；营养饥饿法：包括血清饥饿法、异亮氨酸饥饿法和精氨酸饥饿法。通过 将细胞培养于低浓度血清培养液，或缺乏异亮氨酸或精氨酸的培养液中一段时间，可以使细 胞阻滞于g o g 1 期：胸腺嘧啶核苷阻断法：胸腺嘧啶核苷是一种d n a 合成抑制剂，通过中 断d n a 合成将细胞调节在g 1 期。k u e s 等发现血清饥饿2 d 后再继续进行饥饿，g o g 1 期细胞 比例不会再有显著增加，反而会造成许多细胞走向凋亡，或染色体倍数异常的细胞增加【8 j 。 本实验采用血清饥饿的方法诱导体外培养细胞进入g o g 1 期，并使用流式细胞仪进行进 一步分析，比较了第八代和第二十代人胎儿成纤维细胞经血清饥饿培养法和常规培养法进入 g o g 。期的效率。实验结果表明：第二十代细胞经饥饿培养后，g d g l 期细胞的百分比显著高 于其他三组，g o g l 期细胞高达8 9 0 8 。由此推测高代次的细胞可能对血清饥饿法更加敏感， 但导致该结果的原因还需要进一步深入研究。 总之，本实验用常规酶消化法建立了人胎儿成纤维细胞系，并进行了液氮冻存，经体外 培养传代至第1 0 代未见细胞老化现象。因此，人胎儿成纤维细胞可以用作体细胞核移植的供 体细胞。 4 结论 4 1 人胎儿成纤维细胞体外培养生长旺盛，生长增殖的滞留期为1 2 天，对数生长期为3 - 6 天， 平台期为7 8 天。 4 2 以d m s 0 为冷冻保护剂，手工冷冻的方法对人胎儿成纤维细胞的冷冻保存是切实可行的。 4 3 人胎儿成纤维细胞体外培养传至第1 0 代，染色体为正常二倍体的细胞比例仍占优势，未 见细胞内颗粒增多、折光性差等细胞老化现象。 4 4 血清饥饿培养法和常规培养法处理第八代和第二十代人胎儿成纤维细胞后，均可使其同 步于g o g l 期，但第二十代细胞经饥饿培养后，g o g l 期细胞的百分比显著高于其他三组。 参考文献 内蒙古大学硕士学位论文 【1 】w i l m u ti ，s c h m i e k ea e ，m c w h i rj ，e t c v i a b l eo f f s p 血g d e r i v e df r o mf e t a la n da d u l t m a m m a l l a nc e l l s n a t u r e 1 9 9 7 3 8 5 ：8 1 0 8 1 3 【2 】李斌，郑从义，唐兵低温生物学长沙，湖南科学技术出版社1 9 9 8 3 5 4 0 【3 1 3 l e eg s ，h y u ns h , k i mh s ，e t c i m p r o v e m e n to fap o r c i n es o m a t i cc e l ln u c l e a rt r a n s f e r t e c h n i q u eb yo p t i m i z i n gd o n o rc e l la n dr e c i p i e n to o c y t ep r e p a r a t i o n s t h e r i o g e n o l o g y , 2 0 0 3 ， 5 9 ( 9 ) ：1 9 4 9 - 1 9 5 7 【4 】s a i k h u nj ，p a v a s u t h i p a i s i tk j a r u a n s u w a nm ，e t a x e n o n u c l e a rt r a n s p l a n t a t i o no fb u f f a l o ( b u b a l u sb u b a l i s ) f e t a la n da d u l ts o m a t i cc e l ln u c l e ii n t ob o v i n ef s o si n d i c u s ) o o c y t ec y t o p l a s m a n dt h e i rs u b s e q u e n td e v e l o p m e n t t h e r i o g e n o l o g y , 2 0 0 2 ，5 7 ( 7 ) ：1 8 2 9 - 1 8 3 7 5 】p a u lf k , p a t t e r s o nm k t i s s u ec u l t u r e ：m e t h o d sa n da p p l i c a t i o n 。a c a d e m i cp r e s s ，1 9 7 3 ，n e w y o r k 【6 】o b a c kb ，w e l l sd d o n o rc e l l sf o rn u c l e a rc l o n i n g ：m a n ya t ec a l l e d ，b u t f e wa r ec h o s e n c l o n i n gs t e mc e l l s ，2 0 0 2 ，4 ( 2 ) ：1 4 7 1 6 8 【7 】c a m p b e l