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河南农业大学硕士学位论文乙醇发酵与分离耦合生产燃料乙醇技术研究 摘要 参考天冠集团真空抽酒生产线，自制一个乙醇发酵与真空分离小型反应器。在此基础上， 研究了适用于反应器的培养基条件，抽酒工艺参数，负压对酵母生理生化的影响；针对生产 线抽酒过程中酸度会升高的问题，对杂菌进行了好氧、厌氧平板观察和变性梯度凝胶电泳 ( d g g e ) 分析。 主要结论如下： ( 1 ) 适用于设备参数和工艺参数的发酵培养基条件：水：玉米：木薯= 4 ：l ：1 ，种子 液浓度为1 9 干酵母1 0 0 水，接种量1 0 。这样的培养基条件可以保证酒度较高的前提下物 料不会阻塞设备管道，且发酵结束时残总糖较低。 ( 2 ) 最佳抽酒工艺条件：1 0 。左右的酒度开始抽，抽酒压力为5 k p a 个大气压，抽酒温 度4 0 ，抽酒过程中补料对发酵有促进作用；温度、乙醇、压力对发酵影响的试验结果证 明了这一工艺条件的正确性。 ( 3 ) 通过平板和显微观察，发现负压对酵母活性、形态有影响：负压对发酵性能影响 的试验中，抽酒减少了酒精抑制，增加了耗糖速度，抽样乙醇产量、产率、得率分别是 7 4 7 2 9 l 、1 0 6 7 9 ( l h ) 、0 3 7 2 9 g ，对照乙醇产量、产率、得率分别是7 4 4 9 l 、1 0 6 9 ( l h ) 、 0 3 7 7 9 g , 抽压过程中甘油以及和能量代谢相关的副产物增加，发现有一部分糖消耗掉转化 为菌体的维持能，用e x c e l 中的规划求解工具计算出的代谢流分布结果与此一致；根据发酵 结果，对菌体生长，糖消耗，c 0 2 生成，乙醇生成进行了曲线拟合。 ( 4 ) 好氧，厌氧平板观察都发现有杂菌菌落；结合取样时生产化验数据，d g g e 分析 得出酸度高可能和b 、c 、e 条带所代表的菌有关。 关键词：耦合酵母真空乙醇发酵性能 塑塑奎些奎兰堡主兰垡堡兰 圣壁垄壁兰坌曼塑全竺主整整圣壁垫查塑塞 t e c h n o l o g yr e s e a r c ho ff u e le t h a n o l p r o d u c t i o nb yc o u p u n gt e c h n o l o g yo fe t i 洲o l f e r m e n t a t i o na n ds e p a ra t i o n s u p e r v i s o r ：s e n i o re n g i n e e r d uf e n g g u a n g a s s o c i a t e - p r o s o n ga n d o n g m a s t e rc a n d i d a t e ：l i uj i e a b s t r a c tr e f e r e n c et ot h ev a c u u m p u m p i n gl i n ei nt i a n g u a ne n t e r p r i s e g r o u p ，w em a k e das m a l ls i m i l a rr e a c t o r ，o nw h i c hw ed i ds o m ee x p e r i m e n t so n m e d i u mc o n d i t i o ns u i t e dt ot h er e a c t o r , p r o c e s sp a r a m e t e r sd u r i n gp u m p i n ga n d p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a le f f e c t so fy e a s t si nn e g a t i v ep r e s s u r e a c c o r d i n gt ot h e r i s eo fa c i d i t y ，w ed i ds o m ea e r o b i c 、a n a e r o b i cp l a t e ，a n dd g g ea n a l y s i s t h em a i nc o n c l u s i o n so ft h i st h e s i si n c l u d e dt h ef o l l o w i n gf o u rp a r t s ： f i r s t l y ，t h ef o l l o w i n gw a so ft h ec o n d i t i o n so ft h ef e r m e n t a t i o nm e d i u mf i tf o r e q u i p m e n ta n dp r o c e s sp a r a m e t e r s ：t h ep r o p o r t i o no fw a t e r 、c o r na n dc a s s a v ai s4 ：1 ：1 ； t h ec o n c e n t r a t i o no fs e e dl i q u i di sl gd r yy e a s t 1 0 0 m lw a t e r ；t h ei n o c u l a t i o na m o u n t i s1 0 t h i sc o n d i t i o n sc a nm a k es u r em a t e r i a l sd o n tb l o c kp i p e s ，a l c o h o ld e g r e ei s h i g ha n dr e s i d u a ls u g a ri sl o w s e c o n d l y ，t h ef o l l o w i n gw a so ft h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fp u m p i n ga l c o h o l ：5 k p a o fa t m o s p h e r i cp r e s s u r e ，4 0 co fp u m p i n gt e m p e r a t u r e ，1 0a l c o h o ld e g r e eo fb e g i n p u m p i n gp e r i o d t h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n tr e s u l to ft e m p e r a t u r e 、a t m o s p h e r i c p r e s s u r ea n da l c o h o lp r o v e dt h ep r o c e s sc o n d i t i o n sr i g h t t h i r d l y ，b yp l a t e la n dm i c r o s c o p i co b s e r v a t i o n ，t h ee f f e c to fn e g a t i v ep r e s s u r et o y e a s t a c t i v i t ya n ds h a p ew a sf o u n d ；p u m p i n ga l c o h o ld e c r e a s e dt h ei n h i b i t i o no f a l c o h o l ，i n c r e a s e dt h es p e e do fc o n s u m i n gs u g a r ，t h ep r o d u c t i o nr a t e 、y i e l dr a t ea n d g a i nr a t eo fp u m p e ds a m p l ew e r e7 4 7 2 9 l 、1 0 6 7 9 ( l h ) a n d0 3 7 2 9 g ，w h i l et h e p r o d u c t i o nr a t e 、y i e l dr a t ea n dg a i nr a t eo fc o n t r o lw e r e7 4 4 9 l 、1 0 6 9 ( l h ) a n d 0 3 7 7 9 g ：t h ey i e l do fg l y c e r o la n db y p r o d u c t sr e l a t e dt oe n e r g ym e t a b o l i s mr i s e d d u r i n gp u m p i n g ，s o m es u g a rt r a n s f o r m e di n t os o m a t i cm a i n t e n a n c ee n e r g y ，w h i c hw a s p r o v e db y m e t a b o l i c f l u x ；o nt h er e s u l t so ff e r m e n t a t i o n e x p e r i m e n t ，y e a s t f e r m e n t a t i o nk i n e t i cm o d e lw a se a s t a b l i s h e d f o u r t h l y ，m i x e db a c t e r i u mc o l o n yw e r ef o u n do np l a t e s ，t h er e a s o nw h ya c i d i t y w a sh i g hm a yb er e l a t e dt ot h ec o l o n yb 、t h ec o l o n yca n dt h ec o l o n ye k e y w o r d s ：c o u p l i n g ；y e a s t ；v a c u u m ；a l c o h o l ；f e r m e n t a t i o np e r f o r m a n c e 4 1 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论乙醇发酵与分离耦合生产燃料乙醇技术学位 硕士 文题目研究级别 学生 刘杰 学科导师杜风光 姓名 专业 微生物学 姓名 宋安东 学位论文 如需保密，解密时间年月日 是否保密 研究生签名恻芷躲彬导师签名彬 日期：汐7 年6 月- - d 日日期：靳月历日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离 开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单 位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农 业大学所有，否则，承担相应的法律责任。 研究生警刘赴：导师签奄：彬 学院领导签名： 日期：汐宇年6 月肜日日期：硝年移月咱 日期：年月日 致谢 论文完成之际，首先要感谢我的导师杜风光总工，宋安东副教授。本文工作 是在两位导师的悉心指导下完成的，从论文实验的设计、实验方案的实施到论文 的撰写、修改，无不倾注着导师的心血。杜老师精于管理，忠于实践的品质给 我印象深刻，使我终生受益。宋老师丰富的学识，敏锐的思维，以及一丝不苟的 勤勤恳恳的，精益求精的学术态度，让我深受感染、催我奋进。论文完成之际， 衷心祝愿两位恩师：身体健康、工作顺利、阖家欢乐、一生平安! 在实验过程中，贾新成老师、王风芹老师、陈红歌老师、刘亮伟老师、吴坤 老师、张世敏老师、邱立友老师、申进文老师、谢慧老师就实验中出现的问题提 出过不少建议，使得试验能顺利按时完成，另外河南天冠集团试验中心的陈伟红 主任、孙沛勇主任、马伟东主任、闰德冉工程师、曲爱民工程师、潘伟、周丽霞、 王永丽、曹丰慧、关红梅、杜超在试验和生活中给予了很多帮助，在此一并感谢。 感谢本实验室同级研究生刘玉博、楚乐然、薛仁军、王磊、师兄任天宝、陈 伟、裴广庆，师弟张雷鸣、万续良、任省涛、耿涛、原欢，师妹张玲玲、张沙沙、 田原、周丽娟、侯淑芬，是你们营造了良好、积极向上、轻松活跃的1 0 1 6 ，使 我度过了一段愉快又难忘的岁月! 还有三年来和我同窗学习的黄宁、张勇伟、何江华、吴宗伟、刘元金、席淑 雅等，一路走来，和你们相遇是我终生享用不尽的财富。 本试验的顺利完成也离不开院领导、研究生处诸位领导的关心和支持，在此 一并表示感谢! 最后，要特别感谢我的父母，您们默默的支持是我永远的精神后盾。祝愿您 们幸福安康! 刘杰 2 0 0 9 年5 月于郑州 河南农业大学硕士学位论文 乙醇发酵与分离耦合生产燃料乙醇技术研究 第一章文献综述 1 世界能源现状 世界能源结构先后经历了以薪柴为主以煤炭为主和以油为主的时代，正在向以天然气为 主转变，同时，水核能、风能、太阳能也正得到更广泛的利用。现在，世界能源消费格局是 以石油、天然气、煤炭为主，水力、核能、风能、太阳能为辅。 这样的格局面临着严重的问题：石油为不可再生的资源，由于大量开采，消耗过快，已 面临枯竭，人们不得不努力开发新的可再生的能源来代替或补充石油资源的枯竭。 燃料乙醇是替代石油的有效途径之一。燃料乙醇，是指含水量及其它指标符合现行的国 家标准并用作燃料的乙醇，将燃料乙醇与汽油按一定比例调和，形成车用乙醇汽油。以发酵 法生产燃料乙醇，具有和矿物质燃料相似的燃烧性能，其生产原料为生物质，是一种可再生 能源。现在，中石油、中石化已实现年混配1 0 2 0 万吨乙醇汽油能力，乙醇汽油的消费量占 中国汽油消费量的2 0 ，中国已成为仅次于美国、巴西的全球第三大燃料乙醇消费国。 2 生产燃料乙醇的意义 我国处于高速发展中，业已成为石油消费和进口大国，石油市场资源供应出现紧缺，价 格全面上涨，在应对“三农”问题、环境保护、高油价和能源安全等方面，发展燃料乙醇 据有现实和长久的双重价值。 ( 1 ) 保障国家能源安全。中国能源安全问题并不仅仅是能源供给总量与需求总量的矛 盾，还存在清洁能源需求上升而供给严重不足所引发的结构性矛盾，这是中国能源安全问题 的主要矛盾。高度重视国家能源安全，必须搞好能源供应多元化。 ( 2 ) 是紧跟世界能源发展趋势，及时转变能源发展战略的内在要求。世界能源发展已 步入一个新的变革时期，据有关资料预测，这次变革大体将经历两个阶段：第一阶段，天然 气、煤层气等气体能源，液化煤、气化煤等传统矿物能源洁净化技术和核裂变技术将共同构 成世界能源消费的主体；然后，才可能逐步过渡到以核聚变及可再生能源为主的第二阶段。 中国要抓住机遇，迎接挑战，紧跟世界能源发展趋势，及时转变能源发展战略，以确保能 源的可持续发展【1 1 。 ( 3 ) 在转化陈粮、缓解能源危机、减少环境污染、弥补蛋白饲料资源的不足，推动农 业产业化和农业生态良性循环方面具有重大的战略意义【2 】。 3 乙醇生产过程中的影响因素 3 1 温度的影响 酵母正常的生存和繁殖的温度是2 9 旬0 ，但是发育的最适宜温度并不总是和表现最高 发酵活性的温度吻合，不同的原料或操作阶段有时候要求的温度也会有所不同。例如，糖蜜 发酵酵母繁殖温度为2 8 - 2 9 ，在淀粉质原料酒精发酵时，温度应控制在3 0 - 3 2 c 之间，在 很高或很低的温度下，酵母的生命活动都会削弱，一般酵母发育的最高温度是3 8 c ，最低 2 河南农业大学硕士学位论文 乙醇发酵与分离耦合生产燃料乙醇技术研究 的温度是5 ，在5 0 时酵母就会死亡。在较高温度下，野生酵母和细菌的繁殖速度要比 酵母高的多，如在3 2 时，野生酵母的繁殖系数是酵母的1 2 倍，而在3 8 时是5 7 倍， 因而，在高温下细菌的迅速繁殖会导致发酵液酸度增加，使出酒率降低。 3 2 p h 的影响 微生物生长的p h 值范围很广，大多数p h 值在5 到9 之间。p h 对微生物的生长繁殖和 产物合成的影响有以下几个方面：一是影响酶的活性，当p i - i 值抑制菌体中某些酶的活性时， 会阻碍菌体的新陈代谢。二是影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影 响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄。三是影响培养基中某些组分和中间代谢产物 的离解，从而影响微生物对这些物质的利用。四是p h 值不同，往往引起菌体代谢过程的不 同，使代谢产物的质量和比例发生改变。 p h 在2 8 之间时，酵母都能保持其生命活动。但酵母生长的最适p h 值则为4 8 5 。当 p h 值降到4 2 以下时，酵母仍能继续繁殖，但此时，乳酸菌已经停止生长了。酵母的这种 耐酸的性能被用来压制和消除污染基质中细菌的生长，即向该培养液中加酸，将p h 值调到 3 8 4 ，并保持一段时间，在此期间酵母生长占绝对优势，细菌污染就可消除【3 】。 3 3 底物的影响 微生物要在底物上进行生长并产生代谢产物，必将受到底物本身的物理因素( 颗粒大小、 形状、空隙率、黏度、颗粒之间的扩散率等) 和化学因素( 聚合度、疏水性、结晶度及电化 学性质等) 的影响。底物颗粒的大小直接影响到单位体积反应面积，也会影响到颗粒间菌体 的生长、氧的供给率和c 0 2 的移出率，底物浓度的大小影响到发酵液的渗透压，过高的渗 透压会造成酵母菌代谢紊乱和活力下降，在高渗条件下，酵母会减少其自身体积，相反，在 低渗条件下，它会相应的增加其自身体积。 3 4 产物的影响 发酵法制乙醇是一种典型的产物抑制反应。当酵母细胞在厌氧环境中产生的乙醇达到一 定浓度时，将会影响酵母的生长。传统的乙醇发酵就是因为不能及时地把产物乙醇从发酵液 中分离出来，从而产生强烈的产物抑制效应，大大的降低了生产能力，提高了生产成本。 t o n y d a m o r e ，c h a n d r a 等人研究发现发酵早期( 3 h ) 乙醇在细胞内积累，不断增加的培 养基渗透压使胞内乙醇向胞外泄露。随着发酵培养基中的乙醇浓度增加，乙醇可以插入膜的 疏水区，降低疏水性相互作用力( 这种作用力对于维持膜完整性是非常重要的) 。乙醇在疏水 区的存在还会降低范德华相互作用力，增加膜的运动性和疏水区的极性，使膜减弱了对极性 分子自由变换的疏水性障碍作用。所有这些乙醇效应都会降低细胞膜的完整性，导致膜渗透 性功能下降，引起细胞内物质泄漏。 细胞内的乙醇积累和它在繁殖和发酵方面的潜在作用一直是人们辩论的焦点已引起关 注。n a g o d a w i t h a n a 和s t e i n k r a u s 首先报道外部增加的乙醇没有酵母自身产生的乙醇毒性大【4 】， 原因是有毒附加物的生成【5 】，营养物的缺失 6 - 7 1 ，内部乙醇的积累【8 1 。这些发现目前被许多试 3 河南农业大学硕士学位论文 乙醇发酵与分离耦合生产燃料乙醇技术研究 验室证明。而另一些研究声称胞内乙醇小于至少等于胞外乙醇的毒性 9 i 。近来d o m b e k 和 i n g r a i n 发明了一项新技术来确定胞内乙醇浓度，通过排出山梨醇c 1 4 的方法来确定胞内乙 醇的浓度【埘。通过这种方法证实胞内乙醇小于至少等于胞外乙醇的毒性，它不影响酵母的 发酵。从而证明了早期在高渗透压下是由于营养物质的缺失造成了对细胞的危害。 k e i t hh ，s t e i n k r a u s 等人发现在5x1 0 1 0e t h a n o lm o l e c u l e s c e u 的胞内乙醇浓度是正常水 平，它不对细胞的繁殖能力和乙醇脱氢酶的活性构成影响，而高的胞内乙醇浓度，如2 x 1 0 n e t h a n o lm o l e c u l e s c e l l 将导致酶活力丧失和繁殖能力的下降【1 1 】，因此有必要在发酵过程中移 除乙醇，使胞内乙醇和胞外乙醇趋于一致，减小对细胞的影响。 4 新耦合发酵工艺的研究 为了消除酒精对酵母的抑制，国内外众多研究者提出了许多发酵和分离同时进行的酒精 生产工艺。 4 1 发酵与萃取耦合工艺 它是在发酵过程中利用合适的萃取剂将发酵液中的乙醇分离出来的过程。据报道，萃取 发酵的乙醇产率可达1 1 2 9 ( l h ) n 副，发酵液中葡萄糖浓度可达4 0 0 9 l n 引。范代娣等以十 二烷醇为萃取剂，对固定化酵母乙醇萃取发酵进行了研究萃取发酵中较适宜的基质浓度应 在2 1 0 2 4 0 9 l 之间，搅拌转速使萃取剂达到良好分散为宜，考虑到萃取剂回收等原因，萃 取剂用量不宜太大u 钉。 4 2 发酵与膜分离耦合工艺 分离膜是一种特殊的。具有选择性透过功能的薄层物质，利用现代化工膜分离技术对酒 精水溶液进行分离，以期达到节约能源，降低生产比能耗，提高设备利用率，这是近年来在 膜分离技术上的主要研究课题之一【1 5 1 。m o r i f l 6 1 等人利用p t f e 2 s i l i c o n e 平板膜构成的渗透汽 化膜生物反应器进行直接用未经蒸煮的淀粉为原料的乙醇间歇补料发酵，与传统发酵相比， 淀粉利用率大大提高，乙醇产率增加2 2 5 倍，但其选用菌种的乙醇生产能力较酿酒酵母低很 多，乙醇体积产率只有o 3 6 9 h d l 。m e l z o a c h 等将管式超滤膜与发酵罐耦合起来，实现 了发酵过程的连续化，发酵所得的乙醇在膜上得到分离，细胞被1 0 0 截留，稀释率为0 3 - - - - 0 3 h - 1 ，底物质量浓度为5 0 3 0 0 9 l ，所得的乙醇最大产率为1 5 9 ( l h ) 【1 7 1 。 4 3 发酵与吸附耦合工艺 吸附工艺是用合适的吸附剂，选择性地从乙醇发酵液中吸附乙醇，然后用适当的方法行 解吸，从而可获得高纯度的乙醇，这种方法可大大降低乙醇生产的能耗n 引。范立梅用大网格 树脂从发酵液中吸附分离乙醇的研究表明：以x a d 2 4 大网格树脂作为吸附剂，在含1 0 左右乙 醇的发酵液中，其对乙醇的静态吸附量达1 0 8 3 m g g ，在适当的流速及反通的条件下进行动 态吸附，并通入8 0 c 的热空气进行解吸，可以获得较好的分离效果n 9 1 。 p k w a l s h 用活性炭吸附c 0 2 从发酵液中带出来的乙醇和水，再解吸到载气中用植物纤 维吸附水蒸气，最后可得到含乙醇9 5 的冷凝液。 4 河南农业大学硕士学位论文乙醇发酵与分离耦合生产燃料乙醇技术研究 4 4 发酵与气提耦合工艺 岑沛霖等心就c o s 循环气提乙醇并用活性炭吸附产物的方法进行了研究，证明了c 0 2 气提 乙醇在工业中应用的可行性。c h a n g 等幢2 曾用氮气对发酵液进行气提，以降低产物抑制，并 得出气提能延长发酵时间、提高乙醇平均生产速率的结论。t a y l o r 等心副研究了与细胞循环回 用相结合的c o z 和氮气混合气气提乙醇过程，并得到了较高的乙醇生产速率。但是，气提过 程所需的大流量气体在传质过程中一定会对酵母产生种种影响，导致不同的气体类型产生不 同的发酵效果，因此气提过程中选用何种气体对于整个发酵过程至关重要心副。张君等位5 1 分 别利用空气、二氧化碳、氮气和高纯氮作为载气进行乙醇气提发酵，探讨了不同气提载气对 细胞生理及产物合成的影响，得到以下结论： ( 1 ) 空气作为载气气提对乙醇生产速率的提高效果不明显，且会降低乙醇转化，但有利 于甘油的产生。 ( 2 ) c 0 z 作为载气不利于菌体生长，虽然能够提高乙醇的生产速率，但促进和抑制作用并 存，当c 0 2 的溶解浓度较高时会对甘油的总产量有抑制作用。 ( 3 ) 氮气作为载气未发现对细胞有抑制作用，并且对酵母利用糖发酵的能力有明显的促 进作用，表现为乙醇和甘油的生产速率及葡萄糖的消耗速率都很快。 ( 4 ) 高纯氮的试验证明酵母在经历长期严格厌氧发酵之后，活性会大大下降，死亡率上 升。 4 5 真空发酵工艺 真空发酵是采用抽真空的方法，分离出发酵液中的乙醇，使发酵液中乙醇的浓度保持在 较低的水平，从而消除乙醇对酵母的抑制作用。 a r a m a li n g h a m 采用一个工作体积为3 l 的发酵罐，并通过分凝器、总凝器和收集器、真 空泵相连组成的发酵系统进行试验，在3 0 c ，0 0 0 4 m p a 条件下，定期喷入氧气，采用细胞循 环提高反应器内细胞的浓度，不断排出发酵液中积累的挥发性组分以保持酵母细胞的活力， 结果表明：糖液浓度比常规发酵高3 倍，发酵时间仅为常规发酵的i 3 ，设备利用率得到有效 提高，废水的排放有效减少。缺点是能耗较大，设备真空操作负荷大，操作费用高啦们。 t k g h o s e 采用了外循环真空发酵系统，即发酵采用常压间歇力式，另加一套闪蒸器以 移去酒精。当发酵罐内酒精浓度达到2 2 2 3 9 l 时，开启闪蒸器，闪蒸器的工作压力为 0 o i i m p a ，发酵液则在发酵罐与闪蒸器间循环，酒精在闪蒸器内被快速蒸出，达到了解除酒 精抑制的目的阱1 。 张立峰晗引在c 0 2 气提耦合真空闪蒸进行发酵乙醇的在位分离研究中将气提发酵和真空闪 蒸发酵耦合起来，并利用游离细胞循环技术，提出了一个新的发酵乙醇的在位分离方法。新 方法综合了气提与真空闪蒸的优点，能够将发酵罐中的乙醇浓度保持在较低的范围内，在一 定程度上能消除产物抑制效应，同时也能够提高粗乙醇产品的浓度，降低后序分离工段的能 耗，极大地降低了发酵乙醇的生产成本。通过对不同发酵方式的发酵效率的对比，发现耦合 5 河南农业大学硕士学位论文乙醇发酵与分离耦合生产燃料乙醇技术研究 发酵比其它的发酵方式有一定的优势，由于在真空闪蒸和冷凝方面存在一些问题，这种优势 不是太明显。最后他们确定了耦合连续发酵的适宜操作条件：发酵罐、闪蒸罐温度3 5 ，通 气量2 2 2 3 3 l u 1 r a i n - 1 ，稀释率( 葡萄糖浓度为2 0 0 9 l ) 0 0 4 5 h 刘德华啪1 等以早籼米为原料采用连续细胞循环- 真空发酵耦合工艺，通过连续细胞循 环提高发酵液中的菌体浓度，通过抽真空消除产物( 乙醇) 的抑制作用，从而实现高强度乙 醇发酵和真空发酵相结合。 连续细胞循环的操作过程为：在5l 发酵罐中加入2 l 葡萄糖浓度为l o o g l 的糖化液发酵 培养基，灭菌后接人种子液，开始发酵，每隔3 - - 一4 h 取一次样，测发酵液中葡萄糖浓度，当 发酵液中葡萄糖浓度降至约1 0 1 5 9 几时，开启流加泵，按预定流量向发酵罐中加入灭菌后 的培养基，同时打开出料泵，按相同流量将发酵液打入澄清器，等澄清器中液位达到一定高 度后，加大出料泵流量，同时开启循环泵，将澄清器底部浓缩后的菌液抽回发酵罐。连续细 胞循环真空发酵过程步骤的开始部分同常压连续细胞循环发酵过程，不同的是在糖化液 开始流加前l - 2 h 开启制冷系统，当低温浴槽温度降至一1 0 后，开启真空泵，几分钟后发酵 罐中压力降至约3 5 m m h g ，体系开始沸腾，测发酵液中葡萄糖和乙醇浓度分别降至约2 0 9 l 和 4 0 9 l 之后，开始流加糖化液发酵培养基，流加过程中控制原则为流加泵流量+ 循环泵流量 = 出料泵流量+ 挥发量。 试验结果表明，通过抽真空使发酵液的乙醇浓度控制在3 0 4 0 9 l ，消除了乙醇对酵母 细胞的抑制作用。试验中乙醇生产速率最高可达2 3 0 3 9 ( h l ) ，比普通批式发酵过程乙醇 生产速率1 7 - - 2 3 9 ( h l ) 提高了l o 1 3 倍。 5 乙醇发酵与分离耦合工艺中压力对微生物生理特性影响 压力是一个重要的环境参数。高压可以引起细胞形状、细胞膜和细胞壁的结构和功能发 生变化。在2 0 0 x l p a 的压力下，细胞壁遭到破坏，细胞的亚显微结构也发生变化，线粒体的峭 受到不同程度的损伤，核膜孔张开且被破坏，遗传物质凝集成块，胞浆r n a 漏出，胞浆内部 分区域没有核糖体，而且出现了密度斑m 1 。 负压对菌体影响的研究较少，主要集中在负压状态下融氧对菌体的生长影响和发酵性能 方面。菌体在生长阶段需要消耗大量的氧气来进行产能代谢，负压状态下氧气的供应不能满 足菌体生长的需要，必须向发酵液里注入一定量的氧气。a r a m a l i n g h a m 对真空和常压发 酵进行了比较，发现真空状态并没有给酵母细胞的发酵活力带来不良影响。两种发酵方式 最大比生长速率相同，但真空发酵酵母的对数期比常压发酵延长2 h ，同时反应器内最终细胞 浓度接近常压发酵的1 5 倍啦盯。g r c y s e w s k i 改进了h r a m a l i n g h a m 的方法，使用合成培 养基，3 5 ，0 0 0 7 m p a ，设立一个细胞沉降器，实现酵母细胞的循环以获得高浓度的细胞， 结果发现单位酵母细胞产酒精活力由0 5 8 9 酒精g 细胞h 增) j n n o 8 9 酒精g 细胞h 口。 6 发酵过程中生酸现象 乙醇发酵过程中如果酸度过高，意味着杂菌污染。常见的杂菌有细菌和野生酵母菌两大 6 河南农业大学硕士学位论文乙醇发酵与分离耦合生产燃料乙醇技术研究 类。乳酸菌，革兰氏阳性，大多数不运动，无芽孢，通常捧列成链，需要有碳水化合物才能 生长良好，发酵糖类产生乳酸，大部分乳酸菌生长的适温为2 0 - - 3 0 ，耐温型乳酸菌为4 9 5 1 ，死亡温度为7 0 7 5 ；醋酸菌，大都为短杆状，革兰氏阴性，不形成芽孢，严格好 氧菌，细胞单生、成对或成链，以周生鞭毛运动或不运动，0 6 - 0 8 1 0 3 0 微米，生长 适温为2 0 - - 3 5 。能氧化乙醇等醇类为乙酸等相应酸类，发生酸败。发酵醪中醋酸浓度达 0 0 1 时，酵母的生命活动受到影响，浓度达0 2 时则全部被抑制；酪酸菌为厌氧菌，通 常为革兰氏阳性，一般以周生鞭毛运动，形成孵圆到球形孢子，使杆状菌体膨大，适温为 3 0 3 7 c ，p h 低于4 9 时该菌不繁殖，平面培养不形成菌落，酪酸菌对酵母的抑制作用很 明显，很少含量( 0 0 0 0 5 ) 的酪酸就会抑制酵母的增殖；野生酵母主要有假丝酵母和球拟酵 母属及非芽殖酵母1 3 2 1 。 造成发酵染菌生酸的原因很多，但总结归纳起来，其主要原因有：无菌空气带菌、设备 渗漏、灭菌不彻底、操作失误和技术管理不善。从染菌时间来看，发酵早期染菌，可能原因 有；种子带菌，培养基和设备灭菌不彻底，接种操作不当，无菌空气带菌；发酵后期染菌， 可能原因有：中间补料污染，设备渗漏，操作问题。从污染的杂菌种类来看，污染耐热的芽 孢杆菌，可能是培养基或设备灭菌不彻底；污染球菌、无芽孢杆菌等不耐热杂菌可能是种子 带菌，设备渗漏：污染霉菌，一般是无菌室灭菌不彻底或操作问题。从染菌的幅度来看，如 果各个发酵罐或多个发酵罐染菌，丽且所污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题，如果 各别罐连续染菌，一般是设备问题。 孙付保【3 3 1 等利用高效液相色谱技术，对通风发酵过程中的啤酒酵母细胞的胞外、胞内6 种有机酸含量的动态变化进行了定性定量跟踪检测，研究结果表明，通风培养的酿酒酵母代 谢产酸时，细胞胞外、胞内有机酸的动态变化存在差异性，胞外有机酸含量远大于胞内含量， 酵母细胞对有机酸代谢存在着精确保守性和经济效能性，在发酵后期阶段( 8 4 h ) ，大部分有 机酸含量逐步降低，发酵终点时，胞外、胞内乳酸、苹果酸含量较高。 生酸微生物存在三种生酸代谢类型：丁酸型发酵、丙酸型发酵、乙醇型发酵。丁酸型发 酵的主要末端产物是丁酸、乙酸、h 2 ， c 0 2 和少量丙酸。丙酸型发酵的主要末端产物为丙 酸、乙酸和少量丁酸，气体产量很少。乙醇型发酵以大量乙醇为特征性末端发酵产物，并产 生大量h 2 【弘1 。 任南琪【3 5 】等以碳水化台物为底物，对影响产酸发酵类型的生态因子( p h 、氧化还原电 位) 及群落演替规律进行了研究。发现在启动阶段，通过调节p h 值使反应器内p h 控制在 5 左右，达到稳态时呈现丁酸型发酵，微生物在稳定状态下形成丁酸型顶极群落，优势菌群 主要为进行丁酸型代谢的梭状芽孢杆菌属，如丁酸梭状芽孢杆菌。通过调节氧化还原电位， 使之提高到- 1 8 0 m v 左右后，反应器内发酵类型发生转型，由丁酸型发酵转为丙酸型发酵。 此时，微生物也发生演替，由丁酸型顶极群落转变为丙酸型项极群落f 主要优势菌群为丙酸 杆菌属) 。当调节p h 值至4 2 ，最终丙酸型发酵转化为乙醇型发酵，相应地顶极群落也演替 7 河南农业大学硕士学位论文乙醇发酵与分离耦合生产燃料乙醇技术研究 为乙醇型顶极群落。大量试验结果已证实 a 6 1 ，在p i - 1 5 条件下，既可发生丁酸型发酵，又可 发生丙酸型发酵。此条件下，系统处于微生物生长和代谢的非稳定状态，各个种群微生物对 环境中氧化还原电位干扰较敏感。丁酸型发酵的优势菌种多为专性厌氧菌，氧化还原电位较 低的条件下，进行丁酸型发酵的顶极群落与环境相适应，而丙酸型发酵的细菌往往为兼性厌 氧菌，适于在较高的氧化还原电位条件下生存。p h 的降低，丙酸型顶极群落中的菌群如丙 酸杆菌等不适应此环境，而失去优势地位，生态演替的结果是适应低p n 值的乙醇型发酵菌 群成为优势菌群，形成顶极群落。 杂菌的污染会对发酵产生很多负面影响，目前用于预防和防治杂菌污染的方法主要有： 加强生产管理。洁净的生产环境是防止杂菌污染的重要保证，在生产酒精过程中应加强生产 管理，不仅定期在生产周围环境中进行灭菌，即加强设备、管道等方面的灭菌，还应加强操 作人员的卫生管理工作，提高技术人员素质。 发酵条件的控制。降低发酵醪液的p n 值是防治细菌污染的有效措施之一，细菌生长的 适宜p h 值范围为6 0 - 7 0 ，而酵母菌的适宜p h 范围是4 0 - 5 0 。发酵过程中适当地通入无 菌空气，不仅对绝对厌氧菌的生长繁殖起到抑制作用，同时还能促进酵母细胞大量繁殖，从 而提高酒精的生产能力。 抗菌素及化学药剂的应用。该种方法是目前研究较多且较为有成效的杀菌法，主要的抑 菌剂有亚硫酸、偏重亚硫酸钾、次氯酸、次氯酸神、青霉素、氯霉素、环乙烯胺头孢霉索、 柱晶自霉素、卡那霉素、氨苄青霉素、红霉素等，其剂量的选择应以杀死杂菌而对酵母伤害 较小为标准。 抗污染的酵母菌株的选育。在日本宝酿造和酿试公司，利用酵母的嗜杀性，通过细胞融 合法成功的开发了适合酒精生产的新型酵母，该酵母除了具有高产酒精能力外，还能抑制发 酵醪液中的野生酵母，达到净化发酵体系的目的p 刀，另外，在某些药品存在下选育特定性 酵母菌株，对于防治杂菌的污染也是完全可行的。 7 本文研究内容的提出及意义 全世界9 5 的生物乙醇为发酵法所生产，发酵法生产乙醇时，存在着产物抑制的现象， 限制了发酵原料液中含糖量的提高和发酵醪中乙醇浓度的提高，从而增加了原料糖化和无水 乙醇制取过程的能耗，采用乙醇发酵与产物分离耦合是解决这两大问题的主要工程途径。 天冠乙醇发酵与产物分离耦合生产设备设计生产能力是6 万吨燃料乙醇年，产值约3 亿人民币。但是在生产过程中，真空发酵工艺参数不完善，没有达到提高酒度和速度的目的。 发酵醪液酸度会大幅升高，可能有杂菌污染。理论上，负压状态是否对酵母生物性状有影响， 还未见报道。 为此，本文拟开展以下几个方面的研究。希望在工艺方面提供一些参数，在负压对酵母 性状影响方面给出一些解释。 8 河南农业大学硕士学位论文 z ：醇发酵与分离耦合生产燃料乙醇技术研究 ( 1 ) 发酵与分离耦合反应器设计及发酵条件确定。 ( 2 ) 负压抽酒工艺参数研究。 ( 3 ) 负压对酵母的生物学特性影响。 ( 4 ) 发酵与分离耦合工艺中杂菌类群多样性分析。 9 河南农业大学硕士学位论文 乙醇发酵与分离耦合生产燃料乙醇技术研究 第二章发酵与分离耦合反应器设计及发酵条件研究 根据工厂实际情况，在原生产线上做抽酒工艺的研究是不现实的，所以设计与生产线相 似的小型耦合反应器是本试验的前提和关键。根据耦合反应器，再确定发酵醪液的粘度、浓 度和发酵条件。粘度太高，醪液传送会中断，就实现不了发酵与分离的耦合，浓度太低，酒 度太小，发酵与分离乙醇的优点不易显现，因此在确保粘度合适的前提下，提高发酵醪的浓 度很有必要。 1 材料与方法 1 1 试验材料 木薯粉，玉米淀粉，小麦淀粉。 1 2 发酵菌种 安琪活性干酵母 1 3 试验仪器及试剂 旋转粘度计，液化酶。糖化酶，斐林试剂甲、乙液，0 5 的次甲基蓝指示剂。 1 4 试验方法 1 4 1 发酵试验方法 将原料和水按以下比例调浆： ( a ) 纯玉米， 水料比2 ：l ； ( b ) 纯木薯，水料比2 ：1 ： ( c ) 木薯和面粉各一半，水料比2 ：1 ： ( d ) 玉米和木薯各一半，水料比2 1 ：o 9 ； ( e ) 玉米和木薯各一半，水料比2 ：l ： ( f ) 纯面粉。水料比2 ：1 ； ( g ) 玉米和木薯各一半，水料比2 1 ：o 9 ，液化酶1 4 u g 干料。 在1 0 0 c 的水浴锅中液化1 h ，液化酶添加量为7 u g 干料。液化后分装到三角瓶中，在灭 菌锅中杀菌3 0 m i n ，冷却到3 0 左右，按1 0 的接种量接入活化后浓度为0 5 9 l o o m l 水的安琪 酵母和糖化酶( 1 7 0 u g 干料) 。在3 2 c 条件下发酵2 4 h 后，提高温度到3 4 发酵至终点。 1 4 2 总糖测定方法 对照测定：吸取斐林试剂甲、乙液各5 m l 于2 5 0 m l - - - 角瓶中，加水2 0 m l ，混匀后加入比滴 定终点所消耗的糖液少0 5 一l m l 的0 2 5 的糖液，置于石棉网的电炉上加热之沸腾，沸腾后加 入卜2 滴o 5 的次甲基蓝指示剂，迅速摇匀，保持沸腾2 m i n ，再滴定，直至试液蓝色消失呈 现红色时为终点( 糖液需在l m i n 内滴完) ，记下消耗的总0 2 5 的葡萄糖数a 。 待测样品测定：吸取斐林试剂甲、乙液各5 m l 于2 5 0m l 三角瓶中，加水20 m1 ，混匀后 加入l m l 待测样品，滴入比滴定终点少0 5 - 1 m l 的0 2 5 糖液，置于石棉网的电炉上加热之沸 腾，沸腾后加入1 2 滴o 5 的次甲基蓝指示剂，迅速摇匀，保持沸腾2 m i n ，在以0 2 5 糖 液滴定，直至试液蓝色消失呈现红色时为终点( 糖液需在l m i n 访 滴完) 记下消耗的0 2 5 糖液 b 。 计算：待测样品总糖浓度( g l o o m l ) = ( a - b ) 4 稀释倍数 1 0 河南农业大学硕士学位论文 乙醇发酵与分离耦合生产燃料乙醇技术研究 1 4 3 酒精浓度的测定 取l o o m l 成熟的发酵醒液到蒸馏烧瓶中，加1 2 0 m l 的水，混匀后蒸馏。取流出液l o o m l ， 用酒精比重计测定馏出液中的酒精浓度，用温度计测量其温度，根据酒度和温度校正表校正 酒度【3 9 1 。 1 4 4 粘度测定方法删 ( 1 ) 、按照以下比例，配制不同比例的发酵醪料 ( a ) 玉米和木薯各半， ( b ) 水：料= 1 3 ：7 ，( c ) 水：料= 2 ：1 ， ( d ) 水：料= 2 3 ：1 ，( e ) 水：料= 1 8 ：7 ， ( f ) 水：料= 3 - l ， ( g ) 纯水 液化酶添加量l o u 克干物质，1 0 0 水解1 h 。 ( 2 ) 、在测量前，首先估计被测液体的粘度范围，然后根据下面的量程表选择合适的 转子号和转速。 表2 1 粘度表 f i 9 2 - 1k i n e m a t i cv i s c o s i t ys c a l e 竺：竺：兰!兰z兰璺兰竺 5 01 0 0 05 0 0 01 0 0 0 02 0 0 0 0 2 02 5 0 0 1 2 5 0 02 5 0 0 05 0 0 0 0 1 05 0 0 02 5 0 0 0 5 0 0 0 01 0 0 0 0 0 51 0 0 0 05 0 0 0 01 0 0 0 0 02 0 0 0 0 0 ( 3 ) 、按转子型号所要求的样品之体积，向粘度计的盛样筒中添加试样( 可根据试样 的密度换算成质量) ，避免样品溢出或用量不足。 ( 4 ) 、加热试样到一定温度。 ( 5 ) 、取出转子和盛样筒，分别安装到粘度计上：首先用专用钳子把盛样筒放置到加 热器内孔中，然后将选定的转子、连接钩及过渡螺杆按次序连好，将转子放入盛样筒，其上 部的过渡螺杆旋到保护套下的连接螺杆上 ( 6 ) 、旋转升降旋钮，使仪器缓慢下降，转予完全浸入被测液体中，直到转子液面标 志与试验杯盖相平为止，同时稍微移动加热器，使转子处于盛样筒正中，保证转子不会擦壁。 ( 7 ) 、再次仔细调整好仪器的水平。 ( 8 ) 、温度达到设定值3 5 c 并稳定后，进行粘度测量的操作。 1 。4 5 不同活化浓度的种子液对发酵的影响 按水：玉米淀粉：木薯粉_ 4 ：1 - l 的比例调浆，灭菌后按1 0 的接种量分别接入活化浓 e # * * 女8 p m h z * $ r 度为05 9 1 0 0 f a l 水和l g 1 0 0 m l 水的安琪酵母。在3 2 蓉件f 发酵2 4 h 后提高温度到3 4 发 酵至终点。 2 耦合反应器设计 21 乙醇发酵与分离耦合反应器示意图 t oa t m o s p b er c 目2 - 1 z 醇醇与分离耦台& * i 意图 h 9 2 - 1 n es t r i i c t g f e5cheofc o u p l i n g o 22 乙醇发酵与分离耦合反应器实物图 围2 2z 醇发醇与分离耦台