（植物学专业论文）滇重楼遗传多样性的issr分析.pdf

摘要 上， 多态位点百 分率 ( p p b ) 高达8 3 .2 7 % , n e i s 基因多 样性指数 ( 场) 为。 .1 8 6 , s h a n n o n s 多样性指数 (h o ) 为 0 .3 0 2 ;在居群水平上， 各居群多态位百分率由 5 4 . 1 8 % 到6 0 .5 6 %不等， 平均为5 7 .2 4 % , n e i s 基因多 样性指数 ( h e )为0 .1 5 3 , s h a n n o n s 多样性 指数 ( h o ) 为0 .2 4 1 。 较短的引种时间， 比 较广泛的引种来源和 人工选育等原因可能是导致其遗传多样性略高于 自 然居群的遗传多样性的主要 原因。 聚类分析的结果显示，栽培居群 d l先与3 个 自然居群聚为一支，这也从 一定程度上反映出了短暂的引种栽培可能尚未使栽培居群与 自然居群之间产生 明显的遗传分化。各栽培居群的遗传多样性水平存在一定程度差异 (h e 在 0 . 1 4 0 -0 . 1 6 7 之间 ) ，w d居群的遗传多 样性水平低于自 然居群 l p和 s m (h e = 0 . 1 5 6 )的 遗传多 样性水平， 只与h l 居群 ( h e = 0 .1 4 0 )的 相当。 综上所述，滇重楼生境遭受破坏和其自身的生物学特性是其目前遗传多样 性维持在较低水平的主要原因。 关键词:滇重楼，i s s r ,遗传多样性，自然居群，栽培居群，片段化 abs t ract abs t rac t i n p res e n t s t u d y , w e u s e i s s r m a r k e r s t o i n v e s t i g a t e t h e l e v e l a n d d i s t r i b u t i o n o f g e n e t ic d iv e rs it y o f p . p o ly p h y lla v a r. y u n n a n e n s is . o u r a im s a r e to p r o v id e e l e me n t a ry i n f o r m a t i o n f o r u n d e r s t a n d i n g t h e g e n e t i c d i v e r s i ty o f p . p o l y p h y l l a v a r . y u n n a n e n s is , a n d f o r p r o p o s in g p r a c tic a l u tiliz a t io n f o r t h is im p o r ta n t m e d ic in a l p l a n t . f o u rt e e n p r im e r s w e re s c r e e n e d fr o m 1 1 3 i s s r p ri m e r s , w h ic h w e r e u s e d to in v e s t ig a t e t h e g e n e t ic d iv e r si ty o f 6 p o p u la t io n s o f p . p o ly p h y lla v a r . y u n n a n e n s is . a to ta l o f 2 5 1 b a n d s w e re r e s u lte d , o f w h ic h 2 2 7 w e re p o ly m o r p h ic . a t t h e s p e c ie s l e v e l, th e g e n e tic d i v e r s it y w e re p p b = 9 0 .4 4 % , h e = 0 .2 0 1 , h o = 0 .3 2 5 ; a t t h e p o p u la t io n le v e l, t h e g e n e tic d iv e r s ity w e re p p b = 5 3 .3 1 %, h e = 0 .1 5 2 , h o = 0 .2 3 8 , w h ic h s h o w a h ig h le v e l o f g e n e t ic d iv e r s ity o f p . p o ly p h y l la v a r. y u n n a n e n s is . f o r th e n a t u r a l p o p u la t io n s o f p . p o ly p h y l la v a r . y u n n a n e n s is , a t th e p o p u l a t io n le v e l, th e g e n e t ic d iv e r s ity w a s l o w(场 = 0 .1 5 1 , h o = 0 .2 3 5 ) , a n d t h e p e r c e n t a g e o f p o ly m o rp h ic b a n d s ( p p b ) p e r p o p u la t io n r a n g e d fr o m 4 6 .6 1 % to 5 9 .7 6 % w it h a n a v e r a g e o f 5 3 .3 8 %; a t th e s p e c i e s le v e l, th e g e n e tic d iv e r s ity w a s r e la tiv e ly h ig h (p p b = 7 6 .8 9 % , h e = 0 .1 8 7 , h o = 0 .2 9 8 ) . t h e s p e c i a l b r e e d in g s y s t e m , m o r p h o l o g ic a l a n d p h y s io lo g ic a l a ft e r - rip e n in g , t re m e n d o u s ly p o p u la tio n fr a g m e n ta tio n in th e w il d c a u s e d b y e x c e s s iv e l y e x c a v a te d a n d it s h a b ita t f r a g m e n ta t io n m a y b e th e m a in re a s o n s f o r t h is re su lts . t h e g e n e ti c d iv e r s it y o f a m o n g th e n a tu r a l p o p u la tio n s w a s rela t i v e l y h i g h e r t h a n t h a t wi t h i n t h e p o p u l a t i o n s w h i c h c o r r e l a t e d t o t h e m o r p h o lo g ic a l d i v e r s ity o f d i ff e r e n t p . p o ly p h y ll a v a r . y u n n a n e n s is p o p u la ti o n s . t h e c o e ff ic ie n t o f g e n e ti c d iff e re n t ia ti o n (g s t ) a m o n g th e n a t u r a l p o p u l a t io n s d e te c t e d b y p o p g e n e w a s 0 .1 9 5 2 , o u t o f a c c o r d w ith th e re s u lt 勿a m o v a r e v e a l e d ( f s t = 0 .3 1 2 ) , s u g g e s t e d th a t 1 9 .5 2 % o f th e to t a l v a r ia tio n w a s p a rt it io n e d a m o n g p o p u la t io n s , g e n e ti c v a r ia tio n m a i n ly e x i s te d w it h in p o p u la tio n . t h e b re e d in g s y s t e m , m a t in g s y s te m a n d s e e d tw ic e - d o r m a n c y m a y b e l im i t t h e g e n e fl o w , a n d t h e n l e a d t o th e g e n e tic d iff e r e n t ia t io n a m o n g p o p u l a t io n s . t h e g e n e t ic d iv e r s i ty o f c u lt iv a t e d p o p u l a t io n s w as re la tiv e ly h ig h e r th a n th a t o f abs tr a c t th e n a t u ra l p o p u l a t io n s . a t th e s p e c ie s le v e l, p p b = 8 3 .2 7 % , h e = 0 .1 8 6 , h o = 0 .3 0 2 ; a t th e p o p u la tio n le v e l , p p b = 5 7 .2 4 % , h e = 0 .1 5 3 , h o = 0 .2 4 1 . it m a y b e e x p la in e d b y th e f a c t o f re c e n t in t ro d u c ti o n , c o m p a ra ti v e ly w id e a r e a s o f o r ig in a n d a rt if ic ia l s e le c ti o n o f t h e c u lt iv a t io n fr o m d iff e r e n t s o u rc e s o f o r i g in . a u p g m a d e n d r o g r a m w as re c o n s t r u c t e d b a s e d o n t h e n e i s g e n e ti c d i st a n c e . in t o ta l, tw o m a j o r c l u s te r s w e re id e n tifi e d . p o p u la t io n d l a n d th e t h re e n a tu r a l p o p u la t io n s f o r m e d a c la d e , c u lt iv a te d p o p u la tio n s l j a n d wd fo r m e d a n o th e r o n e . it w a s a ls o a r e fl e c t io n t h a t g e n e tic d i ff e r e n t ia t io n b e t w e e n th e n a t u r a l p o p u l a tio n s a n d th e c u lti v a te d p o p u la tio n s w as n o t o b v i o u s . i t w as d i ff e re n t t h a t t h e g e n e t i c d i v e r s i ty o f e a c h c u l t i v a t e d p o p u la t io n (h e = 0 . 1 4 0 -0 .1 6 7 ) . w d s o u r c e h a s t h e lo w e s t g e n e tic d iv e r s ity , e v e n lo w e r t h a n th a t o f th e n a t u r a l p o p u la ti o n s l p a n d s m (h e = 0 .1 5 6 ), o n ly e q u a l t o h l p o p u la t io n .c o n s e q u e n t ly , it is in d is p e n s a b le to in t ro d u c e m o re w ild in d i v id u a l s ， su c h as p o p u la ti o n s s m a n d l p , to re ta in as m u c h g e n e t ic d iv e r s ity as p o s s ib l e in g e n e ra l, th e p h y s io l o g ic a l c h a r a c te r s o f th e s e e d s a n d tr e m e n d o u s ly h a b ita t fr a g me n t a t i o n m a y b e t h e ma i n r e a s o n s t h a t l e a d t o t h e l o w g e n e t i c d i v e r s i t y o f t h e n a t u r a l p o p u la t io n s o f p . p o ly p h y lla v a r . y u n n a n e n s is . k e y w o r d s : p a r is p o 勺 p h y lla v a r . y u n n a n e n s is , i s s r , g e n e t ic d iv e rs i ty , n a t u r a l p o p u la t io n s , c u lt iv a t e d p o p u la tio n s , fr a g m e n t a ti o n 学位论文独创性声明 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其 他 人己 经发 表 或 撰写 过 的 研 究 成 果， 也 不 包 含 为 获 得 一 鱼鱼扎或 其 他 教 育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同 志对本研究所做的 任何 贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学 位 论 文 作 者 签 名 (手 写 ) 似许 签 字 日 期 : - , 年 6 才日 学位论文版权使用授权书 本学位论 文作者完全了解南昌大李有关保留、 使用学位论文的 规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅 和借阅。 本人 授权南昌大李可以 将学位论文的全部或部分内容 编入 有关数据 库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的 学位论文在解密后适用本授权书) 学 位 论 文 作 者 签 名 (手 “ ) 今 钱 、 签 字 日 期 : i? 年 d a zr 日 导 师 签 名 。二: 和命 衣 签 字 日 期 : ，夕 年子 月 14 日 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 通 讯地址 : 电话: 邮编: 第一章 绪论 第一章 绪论 生物多样性是地球上生命经过几十亿年发展进化的结果，是自 然界赋予人 类的巨大财富，这笔自 然财富对维持人类的生存与发展有着无可替代的重要意 义。然而，由 于生境的破坏，人类对生物资源掠夺式的过度利用，加上环境污 染和外来种入侵的影响等，致使地球上的生物多样性不断减少，大量物种趋于 灭绝，人类生存的基础正在逐渐瓦解，越来越多的生态学家和环境科学家正在 注目 及开 展种多 样 性研究 1 1 1 . 这项研究己 经不仅局限在生 物多 样性分 布格局上的 描述， 而且己 广泛结合到应用生态学、环境科学以及其它政治和经济问题。但 尽管对保护生物多样性的呼声日益增高，人们对生物多样性的内在决定因素及 如何控制管理多样性却远未被完全理解和掌握。 植物是人类生存的基础。但人口增加、经济发展所带来的环境压力将使全 球三分之二的植物物种濒临灭绝。虽然国际上已 有组织 ( 如，大自 然保 护协会， 英国国 际动植物保 护协 会等 ) ， 采取行动保护植物资源以 防 止其 进一步丧失， 但是 濒危植物的数量还在上升。在植物多样性的研究中，分子标记技术的应用克服 了传统研究方法的一些难题。例如，野外调查难度大，实验条件不易控制，林 木生长周期长等特点。分子标一记由于能有效地确定物种的起源和系统的关系， 尤其是在确定表型上难以区分的类群之间的关系，更显示了其优越性。分子标 记技术的飞速发展和逐步完善，对于解决生物多样性保护的难题提供了更有力 的证据。 1遗传多样性 生物多样性是生物及其与环境形成的生态复合体以及与此相关的各种生态 过程的总和。它包括数以百万计的动物、植物、微生物和它们所拥有的基因以 及它们与环境形成的复杂的生态系统。因此，生物多样性是一个内涵十分广泛 的重要概念，它包括多个层次或水平。其中，研究较多，意义重大的主要有遗 传( 基因 ) 多 样性、 物种多 样性、 生态系统多 样性和景 观多 样性四个层次12 1 遗传多样性是指地球上所有生物携带的遗传信息的总和，是生物多样性的 重要组成部分。它是种内 基因的变化，包括种内显著不同的居群间和同一居群 第一章 绪论 内的遗传变异3 1 ， 亦称为基因多样性。 种内的多样性是 物种以上各水平多样性的 重要来源。遗传变异、生活史特点、居群动态及其遗传结构等决定或影响着一 个物种与其他物种及其环境相互作用的方式。而且，种内的多样性是一个物种 对人为干扰进行成功反应的决定因素。种内的遗传变异程度也决定其他进化的 趋势14 1 所有的遗传多样性都发生在分子水平，并且都与核酸的理论化性质紧密相 关，新的变异是突变的结果。自然界中存在的变异源于突变的积累，这些突变 都经受过自 然选择，而一些中性突变则通过随机过程整合到基因组中。上述过 程就形成了 丰富的遗传多样性l 5 1 遗传多样性的测度是比较复杂的， 主要包括三个方面: 染色体多态性、 蛋白 质多态性和 d n a 多态性。染色体多态性主要从染色体数目、组型及其减数分 裂时的行为等方面进行研究;蛋白质多态性一般通过两种途径分析，一是氨基 酸序列分析，一是同工酶或等位酶电泳分析，后者应用较为广泛。d n a多态 性主要通过d a n 测序和分子标记技术进行分析。此外， 还可以应用依据表型性 状进行统计分析的数量遗传学方法对某一物种的遗传多样性进行研究，这种方 法也能很好地反映遗传变异程度，而且实践意义大，特别对于理解物种的适应 机制更为直接14 1 2分子标记技术简述 分子标记 技术是分子生物学发展的产物， 指反映生物个体或群体间在基因 组上某种差异特征的 d n a片断，与同工酶标记相比，分子标记 具有以下优越 性: ( 1 ) 直接以 d n a的形式表现，在植物体的各个组织、 各发育时期均可检 测到，不受季节、 环境限制，不存在表达与否的问 题; ( 2 ) 数量极多， 遍及整 个基因组; ( 3 ) 多态性高，自 然存在着许多等位变异， 不需专门创造特殊的遗 传材料; ( 4 ) 表现为 “ 中性” ，即不影响目 标性状的表达，与不良 性状无必须连 锁;( 5 ) 有许多 分 子标记表现为共显性 ( c o d o m i n a n c e ) ， 能够鉴别出 纯合基因 型 与杂合基因型， 提供完整的遗传信息16 1 2 0 世纪8 0 年代中期以来， 具有快速而且对 d n a需要量少的大量的分子标 记技术相继出 现。如，随机扩增多态性 d n a ( r a p d )、扩增片段长度多态性 ( a f l p ) 、 简单序列重复 或微卫星 ( s s r ) 、 简单重复 序列间 扩增 ( i s s r ) 和单 核 第一章 绪论 昔酸多态性 ( s n p ) 等。下面将就这些分子标记的基本概念和特点做一简要介 绍。 2 . 1随机扩增多态性 d n a ( r a n d o m a m p l if ie d p o ly m o r p h ic d n a , r a p d ) r a p d是 wi l l i a m s 和 we l s h两个研究小组在1 9 9 0 年几乎同时创建的一种 运用随 机引 物 扩增基因 组寻找多态性d n a片 段的 分子标记技术 1 o r a p d技 术建 立 在 p c r ( p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ) 技术 基础 之上， 它是利用一系列不同 的寡聚核昔酸为引物， 对所研究的基因组d n a 进行 p c r扩增，扩增产物通过 聚丙烯酞胺或琼脂糖凝胶电泳分离，经 e b染色或放射自显影来检测扩增产物 d n a片段的多态性。 这些扩增产物d n a 片段的多态性反映了 基因组相应区域的 d n a 多 态性。 r a p d 技 术的特点是:( 1 ) 模板d n a 需要量少 ( 1 5 - 2 5 n g ) ， 纯度要 求不高:( 2 ) 标记数量多; ( 3 ) 事先无需知道d n a 序列信息; ( 4 ) 没有种属的 特异性，一套引 物可适用于不同基因组分析;( 5 ) 分析方便、快速， 无需克隆 制备、同位素标记、 s o u t h e r n 转移等复杂的操作。 但是由于r a p d 标记是显性的， 因而无法判断生物个体基因型是否纯合，而且扩增产物易受反应条件的影响， 实 验结果的 重复 性差， 这些缺点限制了 其应用. 2 .2简单序列重复或 微卫星 ( s im p le s e q u e n c e r e p e a t s , s s r ) 1 9 9 0 年， w e b e r 报 道人类d n a中 存在短的串 联 重复序列8 1 。 所谓微卫星是 由2 - 6 b p 的 重复 单位串 联而成， 一个微卫星长 度一般 小 于1 0 0 b p 。 不同品 种或个 体核心序列的重复次数不同， 但重复序列两侧的d n a序列是保守的， 利用与核 心序列互补的引物， 通过p c r扩增和电泳可分析不同基因型个体在每个s s r位 点上的多态性。s s r技术的优点是检测的多态性频率高、重复性好、共显性、 在基因组中随机分布、 操作简单。但是由于s s r需要测序和设计引物，因而需 要大量的人力、物力和时间。 第一章 绪论 2 . 3扩增片段长度多态性 ( a m p lif ie d f r a g m e n t le n g t h p o ly m o r p h is m , a f l p ) a f l p是1 9 9 3 年由 荷兰 k e y g e n e 公司 z a b e a u和 v o s在 p c r和 r f l p 的基础上发展起来的一种检测 d n a多态性的方法19 1 , a f l p是 通过限制性内 切 酶片段的不同长度检测 d n a多态性的一种 d n a分子标记技术。其基本原理 是:先利用限制性内切酶水解基因组 d n a 产生不同大小的 d n a片段，再进 行选择性扩增， 使用双链人工接头 ( a rt i f i c i a l a d a p t e r ) 与基因组 d n a的酶切片 段相连为扩增反应的摸板 d n a ，用含有选择性碱基的引物 ( p r i m e r ) 对模板 d n a基因选择性扩增， 再通过变性聚丙烯酞胺凝胶电泳对获得的 d n a扩增片 段进行分离检测， 根据扩增片段长度的不同检出多态性。 其中引物的设计是 p c r 成功扩增的关键，其一般由与人工接头互补的核心碱基序列、限制性内切酶识 别序列和3 端的 选择碱基组成 ( 一般不超过3 个) 。 接头与接头相邻的酶切片段的 几个碱基序列为引物的结合位点。 a f l p一般采用两个限制性内切酶， 一个酶的 切点较多，另一个酶切点较少，可以使酶切片段大小匀匀。同时双酶切可以对 扩增片段基因灵活调节，通过少数引物可产生许多不同的引物组合，从而产生 大量的 不同的 a f l p 条带。 a f l p 技术的 特点是:( i ) 所需d n a 量少 仅需 0 . 5 p g ) 也可以 作用于线粒体d n a ; ( 2 ) 多态性检测能力高; ( 3 ) 简单高效， 一次选择 扩增就能获得几十甚至上百个位点;( 4 ) 分辨率高， a f l p 扩增片 段短， 片段多 态性检出率高; ( 5 ) 可靠性好。 a f l p 由于是特定引 物扩增，退火温度高，因而 假阳性低，重复 性好; ( 6 ) 是共显形标记。但也有一些缺点，如对模板反应不 灵敏、条带可能错配、成本较高且技术要求苛刻等。 2 . 4简单重复序列lad 扩增 ( i n t e r - s i m p le s e q u e n c e r e p e a t , i s s r ) i s s r技术是由z i e t lc i e w i c z 等于1 9 9 4 年建立的 ” 0 1 。 它是以 p c r技术为 基 础，利用真核生物基因组广泛存在的简单重复序列 ( s s r ) 来设计引物，而无需 预先克隆和测序。 用于 i s s r - p c r扩增的引物通常为1 6 - 1 8 个碱基序列。i s s r 又依引物在 5 或 3 端加锚定碱基与否而分为锚定简单重复序列间扩增 ( a n c h o r e d i n t e r - s i m p l e s e q u e n c e r e p e a t ) ， 亦称为 a s s r和非锚定简单重复序列间 扩 增( n o n a n c h o r e d i n t e r - s i m p l e s e q u e n c e r e p e a t )， 亦 称m p - p c r 第一章 绪论 ( m i c r o s a t e l l it e - p ri m e d p c r ) o a s s r 是由1 - 4 个 碱基组成的串 联重复 和 几个非 重 复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组 d n a中 s s r的 5 或 3 末端结 合， 导致位于反向排列、 间隔不太大的重复序列间的基因组片段进行 p c r扩增。 非锚定的i s s r则直接以1 个微卫星引物进行 p c r扩增。 扩增产物经聚丙烯酞 胺凝胶或较高浓度的琼脂糖凝胶电泳分离获得扩增指纹图，从而可以揭示样本 间的遗传多样性。 i s s r通常为显性标记呈孟德尔式遗传，且有很好的多态性和 稳定性，而且无需预先知道d n a序列，可以在不同物种间通用。 2 . 5单核普酸多态性 ( s i n g le n u c le o t i d e p o ly m o r p h is m s , s n p ) s n p是由 美国m i t麻省 理 工 学院 ) 的e .l a n d e r 于1 9 %年 提出 的 d o . 它 是 对某特定区 域的核昔酸序列进行测定，将其与相关基因组中对应区域的核昔酸序 列比 较， 检测出单个 核 昔酸的 差异， 这个 有差异的d n a区域， 称为s n p 标记 。 它 包 括单 个碱基的转换( t r a n s it i o n ) 如， t c和 a - g， 以 及颠换 ( t r a n s v e r s i o n ) 如， t a . t - g . c - a和 c - g ，而且其中最少有一种等位基因在群体中的频率不小于 1 %。 因为这种变异可以是转换也可以是颠换， 理论上讲， s n p既可能具有2 等 位多态性，也可能具有3 或4等位多态性。但3 或4 等位多态性的情况较少见， 通常所说的 s n p都是2 等位多态性。 鉴定s n p 的直接方法是通过设计特异p c r 引 物扩增某个特定区 域的d n a片段，经测序和遗传特征的比 较， 来确定该d n a 片 段是否可作为s n p 标记。 但大规模的s n p 鉴定则要通过芯片技术实现. 芯片技 术是将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交， 通过检测每 个探针分子的杂交信号强度而获取样品分子的数量和序列信息。s n p具有以下 特点:( 1 ) 它是二等位标记，使得其可以 应用d n a微阵列、 d n a芯片等高 技 术发现和检测生物基因组的差异;( 2 ) s n p是基因组中分布最广泛而且稳定的 点突变。 3分子标记在植物学中的应用 3 . 1遗传多样性检测 物种的遗传多样性是长期进化的产物，也是其生存和发展的前提。物种遗 传样性和遗传结构的研究，是探讨其适应性、生存力的基础，也是分析濒危物 第一章 绪论 种致濒机理的基础，从而帮助制定科学有效的保护策略和措施。 武耀廷 11 2 1 用 r a p d分子标记对 3 6个陆地棉栽培品种的遗传多态性进行了研究，发现这 3 6 个品种间的遗传多态程度偏低， 说明陆地棉的 遗传基础比 较狭窄。 王淑霞等 13 1 用a f l p方法 对灰背栋 ( q u e r c u s s e n e s c e n s ) 8 个居群进行了 遗传多 样性、 居 群 遗传结构研究，发现灰背栋居群的遗传变异水平有随着海拔升高而遗传多样性 下降的 趋势。 钱韦等1 4 1 用 i s s r标记研究了中国 疵粒野生 稻 ( o r y z a g r a n u l a ta ) 的遗传多样性，结果表明其遗传多样性在物种水平上较低，在居群水平上更 低， 其遗传变异主要存在于海南和云南两地之间，其间产生了相当程度的遗传分化。 杨淑达等 i 5 应用 i s s r标记 对中国 西南地区特有植物滇牡丹 ( p a e o n i a d e l a v a y i ) 的遗传多样性进行了研究，结果表明滇牡丹遗传多样性水平较高，居群间遗传 分化较大。结合以前的研究结果，对滇牡丹的现状进行评估的结果显示，滇牡 丹并不濒危。 l i 和 g e 1 6 1 用 i s s r标记 对我国西北地区固沙植物沙鞭 ( p s a m m o c h l o a v i l l o s a ) 研究后表明， 沙鞭的遗传多样性在物种水平有较高的 变异 水 平， 但在居群水平较低，多 态位点百分 率在 6 . 1 % - 2 6 . 8 % 之间。 李海生 等 【 1 7 1 采用i s s r 标记 对采自 海南和深圳的2 个无瓣海桑 ( s o n n e r a t i a a p e t a l a ) 居群进 行 了遗传变异分析，结果表明，无瓣海桑居群间发生了一定的遗传分化，但绝大 多数遗传变异发生在居群内的个体间。 3 . 2亲缘关系鉴定和栽培植物起源研究 基因型不同的品种，或具一定亲缘关系的物种，基因组内核昔酸序列往往 存在差异。当使用同一随机引物对不同基因组体外扩增时，基因组上与引物互 补的 d n a片段 ( 模板) 的数目 、 位点是不同的，因而其扩增产物 ( d n a片 段) 的大小、数目 也不同，亦即扩增产物表现出多态性，进一步通过聚类分析等遗 传分析手段，可以对物种间的亲缘关系等进行研究。特别是近年来，分子标记 技术在研究野生植物与栽培植物的相互关系，以及栽培植物遗传多样性的起源 与演 化等问 题上 得到了 广泛应用。 张金渝等 i s 应 用 r a p d技术检测了 多叶 重 楼 ( p a r i s p o ly h y l l a ) 2 个变种4 个居群的遗传多 样性， 选择的1 6 个随机引物在5 个 居群中共检测到 2 4 6个多态位点，此结果从分子水平上支持了过去将滇重楼和 七叶一枝花划分为多叶重楼种下2 个变种的形态分类观点。冯斗等 1 9 1 用r a p d 方法研究斑茅 s a c c h a r u m a r u n d i n a c e u m r e t z的分类，认为其不宜列在甘蔗属 第一章 绪论 s a c c h a r u m l . 而应划入蔗茅属e r ia n t h u s m i c h x 或另立新属。陈毓亨等2 0 1对姜 黄 属c u r c u m a 温郁金c . w e n y u j i n 和川郁金c . s i c h u a n e n s i s 的r a p d研究表明 两者 难以 从d n a水 平划分为两个 种， 建 议合并， 学 名为c . w e n y u j i n a h u a n g和 s u n 2 1 采用i s s r分 子标 记 研究了 番 薯 属( ip o m o e a ) 植 物的 遗 传多 样性 和 亲 缘 关 系，结果表明与常见栽培植物番薯 ( ip o m o e a b a t a t a s ) 最为接近的物种是 i . t r ij i d a ， 而 1 . r a m o s i s s i m a和 i . u m b r a t ic o l a与其亲缘关系最远。h o n n a z a 等 2 2 1 利用r a p d标记 研究了来源不同的阿月浑子 ( p i s t a c i a v e r 司1 5 个栽培品种的 遗 传多样性，通过聚类分析，并结合历史与地理记录，结果证实了阿月浑子起源 于其当前的自然分布区并通过引种栽培而分布到中东的地中海区域的假说。 a r i a s 等 2 3 】利用r a p d标记 研究了向日 葵( h e l ia n th u s a n n u u s ) 的 栽 培种 与 其 野 生种之间的相互关系，发现r a p d的遗传一致度非常高 ( i = 0 .9 7 6 到i = 0 .9 9 7 ) , 从而推测向日葵的现代栽培品种是由老的品种与向日葵的野生地理宗通过种间 杂交形成的。 3 . 3种质资源研究和品种鉴定 分子标记可以为种质资源的研究提供丰富的多态性证据。通过检测远缘杂 种或体细胞杂种中特异性分子标记的有无，可以鉴定杂种的真实性。也可以 通 过建立品种 ( 组合) 的指纹档案， 用来鉴定品种 ( 组合) 纯度，为种子质量 提供 可 靠 资 料 ， 或 用 来 保 护品 种( 组 合 ) 专 利 等。 f a n g 等 12 4 1 用i s s r指 纹 图 谱 鉴 定 了 柑桔属 ( c i t r u s ) 的不同品种， 通过2 2 个引物产生的 i s s r标记可用于区分 6 8 个柑桔品 种. t i n k e r 2 5 1 用 r a p d方法， 分析了 2 7 个杂交大麦品系， 2 0 个 双单 体 材料，用7 个引物 p c r扩增，发现9 个 r a p d多态片段，可区分为2 7 个大麦品 系。 a n n e 等2 6 】 对加拿 大魁北克 特 有的 2 个月季品 种进行了a f l p . i s s r和 r a p d分析，结果表明，这2 个月季品种与另一分布广泛的月季品种实属同 种。 车 代弟等 r 7 1 利用r a p d技术 对2 0 个现今栽培的 名优仙客来( c y c l a m e n p e r s i c u m ) 品种进行品种鉴定，聚类分析将各品 种材料分为 4 个类群。李丽等 2 9 1 采用 a f l p技术， 用混合的模板 d n a从数对引物中筛选出6 对带型分布均匀、 多态性丰富且分辨能力强的引物，区分了对市场上经营的两份大白菜杂交种样 品5 8 6 和5 8 7 . 第一章 绪论 3 .4构建遗传连锁图谱和辅助育种 近十多年来，分子标记辅助育种得到了很大的发展。通过分子标记分析可 以 筛选出与目 标基因( 性状) 连锁的 d n a片段， 作为辅助育种的分子标记。 分 子标记的应用为种质资源研究及辅助育种学开辟了崭新的研究和应用领域，它 使植物育种学家能直接从分子水平了解种间的差异，可使人们在育种筛选过程 中节省时间及大量的人力、物力。种质资源是遗传研究的原材料， 用传统的田 间表型性状进行鉴定，从种质资源中发现有益基因甚少，同工酶标记数量有限， 由于有许多有价值的有益基因和不利基因连锁，用一般种质资源的鉴定方法很 难发现，而分子标记可以用来绘制蔬菜品种、品系的指纹图谱。通过与目 标基 因 连锁的分子标记来辅助育种在小麦 ( t r i t i c u m a e s t i v u m ) 、 椰子 ( c o c o s n u c if e r a ) 、 鹰 嘴 豆( c i c e r a r ie t in u m ) 等己 有 初步 研究 报 道。 韩 延闯 等 12 9 】采 用 r a p d技术对1 4 个莲品种进行遗传多态性分析， 用5 个 o p e r o n引物和8 0 个s b s 的 r a p d引物进行筛选， 从中选出来自 s b s的 r a p d - c 1 3和 r a p d - d 1 5扩 增出的8 条多态性条带，绘制了1 4 个品种的 d n a指纹图谱， 在该图谱中每个品 种 均有各自 特异的d n a指纹。胡学军等(3 0 1 以 两 个不同 生态型 甘蓝( b r a s s i c a o l e r a c e a v a r . c a p i t a t a ) 品种杂交得到的 f 2代为作图 群体， 用 r a p d标记 构建 了一张含有1 3 5 个标记位点，9 个连锁群，覆盖长度为1 0 2 3 . 7 c m的甘蓝分子连锁 图 。 张 海 英 等 13 1 !利 用 黄 瓜( c u c u m is s a t iv u s l .) 欧 洲 温室 生 态 型 栽 培 种 高 代自 交 系 欧洲八号， 和华北露地生态型品种 秋棚， 杂交获得的1 4 0 份重组自交系，采用 a f l p . s s r . r a p d分子标记进行遗传分析，构建了 包含9 个连锁组群，由 2 3 4 个标记组成的连锁图谱。 第二章 滇重楼的研究现状 脱分化， 为多 细胞起源， 不经过愈伤 组织阶 段，为 直接发 生6 7 。张 金 渝等6 8 1研 究发现，采用切割繁殖地下茎可提高年平均增重， 缩短收获种子的周期。袁理 春等3 4 】通过对其种子进行二次低温与二次高温交替处理， 缩短了萌发时间，提 高了 最后的出 苗 率， 发 现生长调节剂 对其根状茎的 发生 有促进作用。 z h o u 等【6 9 1 研究发现，对种子进行低温交替处理之前，将种子除去种皮，用赤霉素浸泡， 可提高种子萌发率。 但至今为止，对滇重楼的组织培养方面尚未取得令人满意 的结果7 0 1 滇重楼地下茎按质地分为粉质和胶质两种，王世林等17 1 1 7 2 1通过对滇重楼两 种类型地下茎进行观察和比较，发现受细菌或真菌感染和寄生后， 它们的大小 和重量有较大区别。从胶质化的地下茎中分离和鉴定出两种细菌一蜡状芽抱杆 菌 ( b a c i l l u s c e r e u s ) 和产碱假单胞菌 ( p s e u d o m o n a s a l c a l ig e n e s ) ， 及三种真菌即 黑团 抱霉 ( p e r i c o n i a s p .) 、白 色厚 顶抱霉 ( p a c h n o c y b e a l b i d a ) 和重 楼索霉 ( h o r m o m y c e s p a r i d ip h i l u s ) 。通过液体培养并测定其胞外多搪含量， 结果表明重 楼索霉可分泌大量胞外多糖，这可能是导致滇重楼地下茎胶质化和多糖含量增 加的原因。 z h o u 等7 3 】 从滇重楼根状茎韧皮部、 木质部和种子中分离出了 数十株 内生真菌，并检测到部分内生真菌的发酵培养物中含有晰体化合物。此外，滇 重楼所含的微生物菌体及其代谢产物作为免疫调节因子的作用也己 受到重视， 对其进一步的 研究， 将为 寻找和发 现新的药物活 性成分 提供重要依据 7 2 1 2存在问题 滇重楼除少数地方进行了试验性栽培外，大多为野生。滇重楼作为许多中 药的重要原料，随着市场对其需求量的迅速增长，人们在野外肆意地掠夺性采 挖，加之生态环境的人为破坏，严重影响了其在原产地的生长和繁衍。 不同产地生长的滇重楼，由于海拔、气温、土壤等复杂多变，其遗传多样 性和化学成分等会发生变化，从而导致以其为原料的产品质量有一定差异，可 能成为制约该原料内在质量的关键环节之一。滇重楼主要是以根茎入药，但根 茎生长周期很长。在气温较高，湿度较大的地区，滇重楼地下茎多为胶质;而 气候温和，湿度不大地区粉质重楼较多。传统认为粉质型的药用效果为佳。因 而， 胶质型的 被 遗弃或出 现积压现 象， 造成资源的浪费 1 7 11 .实际 上， 据研究发 现， 胶质重楼总皂昔含量高于粉质重楼【 7 4 7 5 1 7 6 。 此外， 滇重楼地上部分却生长 第二章 滇重楼的研究现状 较快，长期以来，对其地上部分的研究和利用较少，应进一步加强对其药用成 分的研究。 综上所述，由 于各种自 然和人为的因素影响，加之对重楼属植物相关的物 种遗传背景研究的缺乏，这些都给滇重楼的繁殖以及产业化发展带来了较大的 影响。 3本研究的目的和意义 重楼属植物不同种有的外部形态特征较相似，形态有重叠或交叉而药用品 质不一，容易混淆;某些种种内形态变异又较大，表现出较大的多样性，这些 多样性是其物种