（轻工技术与工程专业论文）不同碳源及培养方法对栅藻生产油脂的影响.pdf

学位论文数据集 删孵 中图分类号【q 8 1 5 】学科分类号 1 8 0 7 1 5 0 论文编号 1 0 0 1 0 2 0 1 1 1 1 4 4 密级内部事项 学位授予单位代码 1 0 0 1 0 学位授予单位名称北京化工大学 作者姓名赵桂丽学号 2 0 0 8 0 0 1 1 4 4 获学位专业名称轻工技术与工程获学位专业代码 0 8 2 2 0 3 课题来源国家自然科学基金研究方向生物能源 论文题目不同碳源及培养方法对栅藻生产油脂的影响 微生物油脂，四尾栅藻，光合自养，葡萄糖异养， 关键词 兼养代谢，混合培养 论文答辩日期 2 0 1 1 0 5 2 3奎论文类型 基础研究 学位论文评阅及答辩委员会情况 姓名 职称 工作单位学科专长 指导教师张栩 副教授 北京化工大学生物化工 评阅人1 冯嵬教授 北京化工大学生物工程 评阅人2从威 研究员中科院过程所 生化工程 评阅人3 评阅人4 评阅人5 答辩委员会主席冯嵬教授北京化工大学 生物工程 答辩委员1 王芳 教授北京化工大学生物工程 答辩委员2张丽叶教授北京化工大学生物材料 答辩委员3 张鹏 副教授北京化工大学微生物学 答辩委员4田平芳副教授北京化工大学分子生物学 答辩委员5 注：一论文类型：1 - 基础研究2 应用研究3 开发研究4 其它 二中图分类号在中国图书资料分类法查询 三学科分类号在中华人民共和国国家标准( g b t1 3 7 4 5 9 ) 学科分类与代码中 查询。 四论文编号由单位代码和年份及学号的后四位组成。 不同碳源及培养方法对栅藻生产油脂的影响 摘要 本文研究了不同碳源以及培养方法对栅藻生产油脂的影响。栅藻利用 无机碳源进行光合白养，利用n a h c 0 3 的能力较弱，对浓度为5 的c 0 2 的固定能力最强，而2 的c 0 2 最有利于栅藻的生长和油脂积累，因此通 入2 c 0 2 的空气混合气体可以得到较高的油脂产量。栅藻利用葡萄糖可 以进行异养代谢，5 l 的葡萄糖最有利于栅藻的生长和油脂积累，生物 量和油脂总量远高于o l 葡萄糖培养的情况。栅藻同时利用c 0 2 和葡萄 糖可以进行兼养代谢，油脂含量达到最高值3 2 9 ，油脂产量也达到最高 值o 8 8 l 。 栅藻的光合自养、葡萄糖异养以及兼性代谢三种培养方式相比较，栅 藻在光合自养时生长缓慢，油脂含量也较低，而异养可以得到最高的生物 量，兼性代谢的油脂含量和油脂产量最高，因此兼养代谢最有利于栅藻细 胞的油脂积累。 用含3 l 葡萄糖的淀粉废水培养栅藻，得到较高的生物量和微生物 油脂，同时c o d 降解率可达5 8 4 。利用加糖的淀粉废水培养栅藻生产 微生物油脂，不仅降解废水的c o d ，也可降低生产成本。 用栅藻和粘红酵母混合培养的方法生产油脂可以提高生物量和油脂 产量，生物量分别为栅藻、酵母单独培养生物量的5 9 7 倍和1 6 7 倍，油 脂产量分别是栅藻、粘红酵母单独培养油脂产量的3 6 倍和1 5 l 倍。混合 培养的最优通气率为1 4 w m ，两种微生物的最佳接种量分别为酵母1 0 ， i 北京化工大学硕士学位论文 栅藻2 0 。通过正交实验对混合培养的培养基进行优化，得到油脂积累的 培养基最优碳氮源为( l ) ：葡萄糖4 0 9 ，糖蜜2 5 l ，脲2 5 9 ，酵母粉2 o g ， 大豆蛋白胨6 o g ，硝酸钠2 o g ，硫酸铵4 o g 。采用5 l 搅拌罐及优化培养 基混合培养栅藻和粘红酵母，生物量和油脂产量分别比培养基优化前气升 式罐发酵提高了7 7 6 和1 3 5 。进一步优化混合培养基的碳氮源并简化 培养基，最终油脂产量在碳氮比为2 0 ：l 达到最高值。 关键词：微生物油脂，四尾栅藻，光合自养，葡萄糖异养，兼养代谢，混 合培养 i i 摘要 e f f e c t so fd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e sa n d c u l ，t i v a t i o nm e t h o d so nl i p i dp r o d u c t i o no f s c e n e d e s m u s q u a d r i c a u d a a b s t r a c t i nt h i sp 印e r ，t h ee f r e c t so fd i f r e r e n tc a r b o ns o u r c e sa n dc u l t i v a t i o n m e t h o d so n1 i p i dp r o d u c t i o no f 绷鲥鲫聊螂g 甜口d 订伽“如w e r es t u d i e d s g “以西彳伽“d ac o u l dg r o wa u t o t r o p h i c a l l yu s i n gi n o 玛a n i cc a r b o ns o u r c e s ，s u c h a sc 0 2a n dn a h c 0 3 & g “以挑c 以甜a ku t i l i z e dn a h c 0 3w e a k l 弘b u tt h ea l g a e f i x e dc 印a c i t yo f5 c 0 2w a st h es t r o n g e s ta n dc 0 2c o n c e n t r a t i o no f2 w a s m o s tc o n d u c i v et oa l g a eg r o w t ha n dl i p i da c c u m u l a t i o n t h e r e f o r e ，t h eh i g h l i p i dp r o d u c t i v i t yc o u l db eo b t a i n e dw i t h2 c 0 2a e r a t i o n g “口d 力伽“如 c o n d l l c t e dh e t e r o t r o p h i cm e t a b o l i s mu s i n gg l u c o s e ，a n d5 lg l u c o s ew a s m o s tf i a v o r a b l et o a l g a eb i o m a s sa n dl i p i dp r o d u c t i v i t yw h i c hw e r em u c h h i g h e rt h a nt h a to fo g lg l u c o s e & g “口c 加c 口“( 缸a l s oc o u l du t i l i z ec 0 2a n d g l u c o s ea tt h es 锄et i m et oc o n d u c tf a c u l t a t i v em e t a b o l i s m ，w i t ht h eh i g h e s t l i p i dc o n t e n to f 3 2 9 a n dt h eh i g h e s tl i p i d 姐e l do fo 8 8 l t h r e ec u l t i v a t i o n m e t h o d s ，p h o t o s y n t h e t i ca u t o t r o p h i c c u l t u r e ， h e t e r o t r o p h i cc u l t u r ea n df a c u l t a t i v em e t a b 0 1 i s m ，w e r ec o m p a r e di nt h i ss m d y i np h o t o s y n t h e t i ca u t o t r o p h i cc u l t u r e ，a l g a eg r e wv e 巧s l o w l ya n dl i p i dc o n t e n t w a sm u c hl o w h o w e v e r t h eh i g h e s tb i o m a s so fa l g a ew a so b t a i n e di n i i i 北京化工大学硕士学位论文 h e t e r o t r o p h i cc u l t u r e ，a n dl i p i dc o n t e n ta n dt o t a ll i p i dr e a c h e dh i g h e s ti n f a c u l t a t i v ec u l t u r e t h e r e f o r e ，f a c u l t a t i v ec u l m r em e t h o dw a sm o s tb e n e f i c i a l f o rl i p i dp r o d u c t i o no f 孓g “以( 咖玉? 口“c 勉 & g “口d 打“d ac o u l dg r o wi ns t a r c hw a s t e w a t e rc o n t a i n i n g3g lg l u c o s e ， a n d h i g h b i o m a s sa n dm i c r o b i a lo i lw e r eo b t a i n e d a d d i t i o n a l l y t h e d e g r a d a t i o nr a t eo fw a s t e w a t e rc o dr e a c h e d58 4 t h e r e f o r e ，c o da n d p r o ( 1 u c t i o nc o s tc o u l db er e d u c e db yc u l t u r i n g 孓g “以挑c 以“( 坛t op r o ( 1 u c e m i c r o b i a lo i li ns t a r c hw a s t e w a t e rc o n t a i n i n gs u g a r 1 o t a lb i o m a s sa n dl i p i dp r o d u c t i o nc o u l db ei n c r e a s e db ym i x c u l t i v a t i n g o fsg “口d 订“如a n d 尺乃d d 0 幻删励咖所z 括t h et o t a lb i o m a s so fm i x - c u l m r e w a s5 9 7t i m e sa n d1 6 7t i m e so ft h a to fsg “口办泐掰如s i n 9 1 ec u l t l l r ea n d 尺 g 觑砌括m o n o c u l t u r e ，r e s p e c t i v e l y a n dl i p i dp r o d u c t i v i t yo fm i x - c u l t u r ew a s 3 6t i m e sa n d1 5lt i m e so ft h a to fsg “口办记以甜d h s i n g l ec u l m r ea n d 尺 g 觑砌括m o n o c u l t u r e ，r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fm i x - c u l t i v a t i o n w e r ea e r a t i o nr a t eo f1 4 w ma n di n o c u l a t i o nq u a n t i 够o f1o y e a s ta n d2 0 a l g a m i x c u l m r em e d i u mw a so p t i m i z e dt h r o u g ho r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，a n d t h eo p t i m a lc a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e sw e r ea sf o l l o w s ( l ) ：g l u c o s e4 0 9 ， u r e a2 5 9 ，y e a s te x t r a c t s2 o g ，s o y b e a np 印t o n e6 o g ，n a n 0 32 o g ，( n h 4 ) 2 s 0 4 4 o g a r e ro p t i m i z a t i o n ，t o t a lb i o m a s sr e a c h e d2 2 2 8 9 lw i t hm eh i g h e s tl i p i d 如e l do f4 5 5 li n5 ls t i l l r e df e m e n t o r a n dm eb i o m a s sa n dl i p i d 姐e l d i n c r e a s e db y7 7 6 a n d13 5 t h a nt h a to fb e f o r eo p t i m i z a t i o n t h ec a r b o n a n dn i t r o g e ns o u r c eo fm i x c u l t u r em e d i u mw a s 如r t h e rs i m p l i f i e da n dt h e l v l ( e y w o r d s ：m i c r o b i a l o i l ， 绷谢卵m “sg “以挑伽“如， p h o t o s y i l t h e t i c a u t o t r o p h i cc u l t u r e ，h e t e r o t r o p h i cc u l t u r e ，f a c u l t a t i v e m e t a b o l i s m ， m i x c u t i v a t i o n v 1 1 生物柴油概述一l 1 1 1 生物柴油优点l 1 1 2 生物柴油的原料l 1 2 微生物油脂概述一2 1 2 1 微生物油脂的研究概况2 1 2 2 微生物油脂合成途径代谢调控3 1 3 产油微藻的研究进展3 1 3 1 培养微藻合成油脂的优点3 1 3 2 产油微藻的种类4 1 3 3 影响微藻生长和油脂合成的因素4 1 3 4 产油微藻的培养方式6 1 3 5 栅藻简介7 1 4 本课题的选题依据及工作内容7 1 4 1 选题依据及创新之处7 1 4 2 工作内容7 第二章实验材料与方法9 2 1 菌种9 2 2 培养基9 2 2 1 栅藻培养基9 2 2 2 粘红酵母培养基9 2 2 3 栅藻和粘红酵母混合培养的培养基1 0 2 3 培养方法1o 2 3 1 栅藻的培养方法1 0 2 3 2 粘红酵母的培养方法1 2 2 3 3 栅藻和粘红酵母混合培养的方法1 2 2 4 分析方法1 3 2 4 1 生物量的测定13 2 4 2 叶绿素的测定1 5 2 4 3 残糖浓度的测定1 5 北京化工大学硕士学位论文 2 4 4 油脂的提取及测定。1 5 2 4 5c o d 的测定1 5 2 4 6 油脂成分分析方法1 6 2 4 7 尾气中c 0 2 含量的测定1 6 2 5 试剂及仪器1 7 2 5 1 实验试剂1 7 2 5 2 实验仪器1 7 第三章快速测定油脂含量的方法：1 9 3 1 引言。1 9 3 2 荧光显微镜定性检测尼罗红染色1 9 3 3 荧光分光光度计测定细胞油脂含量2 0 3 3 1 实验原理2 0 3 3 2 实验条件2 0 3 3 3 实验步骤；一2 l 3 3 4 标准曲线的绘制- 一2 1 3 4 流式细胞仪高通量快速筛选高产菌株的方法2 2 3 5 小结2 3 第四章镁离子及无机碳氮源对栅藻自养生长及产油的影响2 5 4 1 引言一2 5 4 2 栅藻自养的生长曲线2 5 4 3 镁离子浓度对栅藻生长和产油的影响2 6 4 4 硫酸铵对栅藻生长和产油的影响2 9 4 5n a h c 0 3 浓度对栅藻生长和产油的影响3 1 4 6c 0 2 对栅藻生长和产油的影响3 3 4 7 小结3 6 第五章栅藻和粘红酵母的混合培养3 7 5 1 引言3 7 5 2 栅藻和粘红酵母混合培养初试3 7 5 2 1 混合培养的接种比例及通气率对生物量的影响3 7 5 2 2 混合培养对油脂产量的影响3 8 目录 5 2 3 混合培养的微生物生长趋势3 9 5 3 混合培养的油脂成分分析4 0 5 4 混合培养机理的初步研究4 0 5 5 混合培养基的优化。4 2 5 65 l 搅拌罐发酵培养：4 4 5 7 碳氮比对混合培养生物量和产油的影响4 6 5 8 小结4 8 第六章栅藻的葡萄糖培养、兼养及淀粉废水培养5 1 6 1 引一言一5 1 6 2 葡萄糖浓度对栅藻生长和产油的影响5 1 6 3 葡萄糖与c 0 2 共同作用对栅藻生长和产油的影响5 3 6 4 淀粉废水培养栅藻的初试5 5 6 5 小结5 7 第七章结论5 9 第八章问题与建议6 1 参考文献6 3 附录1 实验试剂列表6 7 附录2 实验仪器列表6 8 致谢6 9 研究成果及发表的学术论文7 1 作者和导师简介7 3 i i l 北京化工大学硕士学位论文 i v 第一章文献综述 第一章文献综述 随着全球经济的发展，人们对能源的需求量大幅增加，煤、石油、天然气等化石 燃料同益减少，导致了比较严峻的能源危机，同时燃烧化石能源给环境带来严重的污 染，使得越来越多的研究人员寻找可以替代化石燃料的清洁可再生能源。近年来，研 究热点已经聚集在开发清洁的生物质能源上，从而制备可以替代化石燃料的能源。生 物柴油就是一种比较理想的生物质能源，现在已经成为全球一个研究热点。 1 1 生物柴油概述 生物柴油是长链脂肪酸与甲醇或乙醇通过化学合成或脂肪酶生物催化或甘油三 酯通过转酯化形成的长链脂肪酸甲酯或乙酯。 1 1 1 生物柴油优点 作为化石燃料的替代品，与普通柴油和同为生物质能源的燃料乙醇相比，生物柴 油具有更多的优势【2 】： ( 1 ) 生物柴油比化石柴油具有更高的燃烧性能，因为不含石蜡，闪点较高，因此 运输、储藏及使用都较安全； ( 2 ) 生物柴油的氮和硫元素含量较少，比燃烧化石柴油释放的氮硫污染气体少， 更有利于环保； ( 3 ) 生物柴油由可再生的生物质资源转换得到，是可再生能源； ( 4 ) 生物柴油燃烧后的热值远高于燃料乙醇的燃烧热值，并且乙醇易吸水也使得 热值下降【3 】； ( 5 ) 有较好的润滑性能，减小发动机内的摩擦； ( 6 ) 可以低温启动发动机，没有添加剂时冷滤点可以达到零下2 0 ； ( 7 ) 适用于现在的柴油机，不影响运转性能。 由于生物柴油的多种优点，世界各国均开展生物柴油产业的研究工作。 1 1 2 生物柴油的原料 目前，生产生物柴油的原料主要是动物油脂、植物油脂和微生物油脂三种，世界 各国根据各自不同的情况选择不同的原料，例如美国和欧盟等国家主要选取菜籽油、 大豆油等为制备生物柴油的原料，巴西也主要用蓖麻籽油等植物油脂生产生物柴油， 而日本制备生物柴油的原料主要是地沟油和动物油脂，还有部分东南亚国家采用棕榈 北京化工大学硕士学位论文 油生产生物柴油【3 】。 对于中国而言，由于人口众多使得人均耕地面积少，食用植物油的消耗量也较大， 还需进口大豆油和菜籽油等油脂以满足国内食用需求，同时，大量种植黄连木、麻风 树等非粮油料作物需占据大面积耕地，影响了粮食作物的种植，因此，采用植物油脂 作为制备生物柴油的原料不符合我国的国情。 微生物油脂也是生产生物柴油的原料之一，也被称为单细胞油脂，是油脂微生物 在一定培养条件下，利用有机碳源或者无机碳源，在体内合成的大量油脂，多为长链 不饱脂肪酸或脂肪酸形成的酯，以甘油三酯为主( t a g ) 【4 】。与动植物油脂相比，微 生物油脂作为制备生物柴油的原料具备许多优点【5 】： ( 1 ) 微生物生长繁殖速度快，生长周期短； ( 2 ) 微生物生长所需的原料来源广泛，甚至可以利用有机废弃物或工业废水作为 其生长的原料，价格低廉，大大降低生产成本； ( 3 ) 微生物的生长不受季节和气候的限制，可以全年进行生产； ( 4 ) 与种植油脂作物相比，采用培养微生物的方法生产油脂占地面积大大减小； ( 5 ) 与种植油脂作物相比，采用培养微生物的方法生产油脂劳动强度减小，因此 节省劳动力； ( 6 ) 用此方法生产油脂还可以借助先进的生物技术，从而更多地生产人们所需要 的特定脂肪酸。 因此，我国开展了大量生产微生物油脂来制备生物柴油的研究工作。 1 2 微生物油脂概述 1 2 1 微生物油脂的研究概况 微生物油脂的研究已有很长的历史，可以追溯到1 9 世纪7 0 年代中期【6 ，7 】。在第一 次世界大战发生之前，德国科学家也已经开始了利用油脂微生物生产油脂的研究，但 被战争中断，后来美国也做过相关研究【8 】。合成油脂的微生物主要有酵母、真菌【9 1 、 藻类【l o 】和细菌。在2 0 世纪4 0 年代，发现了合成油脂能力较强的斯达氏油脂酵母、粘 红酵母等酵母属以及曲霉、毛霉等霉菌，到9 0 年代，相继发现了丝状真菌、细菌以 及藻类等微生物也可以合成大量油脂，进一步扩大了油脂微生物的种类【1 1 1 。我国生产 微生物油脂的研究在9 0 年代以后也取得一定成果，例如在1 9 9 3 年，文献报道被孢霉 菌经筛选得到一株高产的菌株，油脂含量达到3 2 8 ；南开大学生物系将深黄被孢霉 诱变后，得到油脂含量高达4 4 7 的菌株。另有报道，施安辉【1 2 】等人改变培养粘红酵 母合成油脂的发酵条件，得到了小型工艺的最佳生产条件，从而使得油脂含量占到细 胞干重的6 7 2 ，其中棕榈酸占总油脂的3 3 3 1 。李永红【1 3 】等人优化培养基以及发酵 2 第一章文献综述 条件，得到油脂含量为7 6 1 的圆红冬孢酵母菌。缪晓玲【1 4 1 等人利用葡萄糖作为碳源 对小球藻进行异养转化，最终获得异养能力较强的小球藻细胞，并且最终油脂含量可 高达藻体干重的5 5 。国外报道，有的产油微藻的油脂含量很高，尤其通过基因改造 的工程微藻，其油脂含量可以占到细胞干重的8 0 【1 5 ，1 6 1 。 1 2 2 微生物油脂合成途径代谢调控 图1 1 表示产油酵母和霉菌等微生物积累甘油三酯的代谢途径中一些重要的调控 步骤。微生物在碳源充足、氮源缺乏的条件下，微生物停止生长繁殖，开始甘油三酯 的积累。微生物胞内的腺苷一磷酸脱氨酶催化腺苷一磷酸生成肌苷一磷酸和氨，当氮 源耗竭时，腺苷一磷酸脱氨酶的活性将会增加，使得肌苷一磷酸和氨大量积累【1 7 j 。一 般产油酵母的线粒体内的异柠檬酸脱氢酶依赖于腺苷一磷酸，异柠檬酸脱氢酶的活性 随着腺苷一磷酸含量的降低而减弱甚至消失【l 引，因此，异柠檬酸不再被异柠檬酸脱氢 酶催化生成2 一酮戊二酸，使得三羧酸循环减弱，代谢途径发生改变。柠檬酸也因此大 量积累，在柠檬酸裂解酶的催化下裂解成乙酰辅酶a 和草酰乙酸，而乙酰辅酶a 是 合成脂肪酸的前体物质，最终代谢途径转移到脂肪酸合成途径中。 图1 1 产油酵母甘油三酯合成的代谢调控途径【1 9 】 f 蟾1 - lo u t l i l l eo f l em e t a _ b o l i cr e g u l a t i o no f1 i p i da c 伽m u l a t i o ni no l e a g i n o u sy e 鹤t s 1 3 产油微藻的研究进展 1 3 1 培养微藻合成油脂的优点 随着油脂微生物研究的逐渐深入，现已经发现许多合成油脂的微生物种类，相对 3 北京化工大学硕士学位论文 于产油酵母、细菌以及霉菌而言，培养微藻生产油脂具有几个优势： ( 1 ) 微藻可以进行高效的光合作用，固定空气中的c 0 2 并释放氧气，为节能减排 做出贡献，可以一定程度上促进减轻目前较为严重的温室效应，这也是研究微藻的原 因之一。 ( 2 ) 微藻的油脂含量较高，异养培养时，微藻也可以迅速生长并积累油脂，同时， 更容易对微藻细胞进行基因改造提高油脂含量，工程微藻的油脂含量可以高达8 0 。 ( 3 ) 由微藻油脂制备得到的生物柴油性能与柴油相似，并且冷滤点更低于柴油， 另外，微藻油可以制得经济价值更高的的航空燃料，这是其他微生物油脂没有的特点。 1 3 2 产油微藻的种类 产油微藻的种类较多，常见的包括绿藻、硅藻和金藻等藻属，报道的油脂含量较 高的有小球藻、微绿球藻、栅藻以及三角褐指藻等。w 西x i o n g 【2 0 】用5 l 光照发酵罐先 在光源照射下培养小球藻，然后放置黑暗处用含葡萄糖培养基再培养，启动了光合发 酵模型，在发酵过程中反复补加葡萄糖，油脂含量最高可以达到5 8 4 。文献报道用 不同浓度的c 0 2 培养微绿球藻，在浓度为2 的c 0 2 条件下，微藻油脂含量为最高， 可以占到细胞干重的3 0 【2 l 】。l ix i n 【2 2 】等人在不同温度下培养栅藻合成微生物油脂， 其最高油脂含量为3 5 。 1 3 3 影响微藻生长和油脂合成的因素 微藻与其他微生物相同，需要适宜的营养元素以及培养条件才能进行正常的生长 代谢。营养元素一般包括培养基的碳源、氮源、镁离子与f e 3 + 等无机盐，影响微藻生 长代谢的培养条件包括温度、p h 值、光照强度、光暗比等。 ( 1 ) 碳源 碳源是最重要的营养元素，为微藻生长提供所需的碳骨架和能量。对于产油微藻 而言，碳源分为无机碳源和有机碳源，微藻利用无机碳源在光照下进行光合自养，也 可以利用有机碳源进行异养代谢。微藻可以利用的无机碳源一般包括h c 0 3 。和c 0 2 ， 两者可以通过电离平衡相互转化，微藻在核酮糖二磷酸羧化酶的催化下固定c 0 2 ，进 入卡尔文循环，在光照下将无机碳源合成糖类。目前，利用微藻高效固定c 0 2 并对藻 种进行生理调控已取得一定成果，并且在经济上可行的【2 3 彩】。 微藻可利用的有机碳源一般包括葡萄糖、甘氨酸、醋酸钠以及甘油等，在有机碳 源存在下，微藻进行异养代谢，生长速度较快，油脂含量也较高。刘然【2 6 l 采用几种不 同的有机碳源培养粉核油球藻合成油脂，发现葡萄糖浓度为4 0 l 时油脂含量可达 5 6 9 ，藻细胞利用甘氨酸的能力也较强，在甘氨酸浓度为1 l 时油脂含量占总干重 4 第一章文献综述 的3 1 3 。 ( 2 ) 氮源 氮源也是生长所必需的元素，并且氮源的浓度对于油脂合成有较大影响。在微藻 生长繁殖期，充足的碳源和氮源有利于其生长，但是在油脂合成期，氮缺乏则有利于 油脂的积累 2 7 1 。也就是说，培养基的碳氮比对微藻合成油脂有显著的影响【2 8 1 ，因此， 可以采用两步法培养微藻生产油脂，在微藻生长期采用较低的碳氮比用于细胞积累， 在油脂合成期则采用较高的碳氮比积累更多油脂。 ( 3 ) 镁离子 镁离子是合成叶绿素的重要成分，并且与许多酶的酶活有关，因此对微藻的生命 活动有较大影响，同时，镁离子对脂肪酸合成途径中的关键酶乙酰辅酶a 羧化酶的活 性有影响，其活性随着镁离子浓度在一定范围内增加而升高，因此促进油脂合成，文 献报道，当镁离子浓度在1 8 m m 0 1 l 时，与不加镁离子的对照试验相比，微藻油脂含 量增加了1 3 2 【2 9 】。 ( 4 ) 铁离子 铁离子也与油脂合成相关酶相结合，从而影响微藻的油脂积累，刘志嫒【3 0 1 等人试 验结果表明，海水小球藻在f e 3 + 浓度为1 2 l o 。5 m o l l 时的生物量远高于f e 3 + 缺乏的生 物量，另外，培养基中高浓度的f e 3 + 对提高海水小球藻的含油量也起到一定作用，使 得油脂含量占到细胞干重的5 6 6 【3 。 ( 5 ) 温度 温度是影响酶的活性的重要因素之一，因此对微藻生长代谢和油脂合成的关键酶 的活性有较大影响，不同种类的微藻的油脂含量以及油脂成分随温度的变化而存在较 大差异【3 2 】。在适宜温度下，微藻保持较高的生长速度及油脂含量，微藻生长的适宜温 度一般在2 2 2 8 之间。 ( 6 ) p h 值 微藻生长代谢及油脂合成的关键酶酶活也受p h 值的影响，过高或高低的p h 值 均会导致酶失活，则会影响油脂积累甚至抑制藻类的生长。同时p h 值也会影响c 0 2 和h c 0 3 。之间的平衡，从而影响微藻对无机碳的固定。一般来讲，小球藻和栅藻等绿 藻的适宜p h 在5 肚9 o 之间，而螺旋藻等蓝藻适宜的p h 值稍高，在7 0 1 0 o 之间。 ( 7 ) 光照强度 光照是微藻进行光合作用重的要条件之一，微藻完全处于黑暗状态，光合作用的 光反应阶段受到抑制，微藻最基本生命活动无法进行，如果光照强度达到光补偿点， 微藻才能正常生长，随着光照强度升高，微藻生物量和油脂含量也随之升高，但光照 强度超过一定范围，微藻的生长和产油能力则会下降。栅藻适宜光照强度范围为 2 0 0 0 一5 0 0 0 l x 。 ( 8 ) 光暗比 5 北京化工大学硕士学位论文 光暗比是指2 4 h 小时内提供的光照时间与黑暗时间的比值，对于微藻培养而言， 不同的光暗比对于固定c 0 2 有较大影响，因此对微藻的生长代谢的影响也存在差异， e d u 莉o 【 j 等人分别采用o ：2 4 ，2 ：2 2 ，4 ：2 0 ，6 ：1 8 ，8 ：1 6 ，1 0 ：1 4 ，1 2 ：1 2 ，1 4 ：1 0 ，1 6 ：8 ， 1 8 ：6 ，2 0 ：4 ，2 2 ：2 ，2 4 ：o 的光暗比培养微藻，发现一直光照的藻生物量最高，随着光照 时间降低，生物量依次降低，但是当光暗比为1 2 ：1 2 时，其生物量高于光暗比为1 6 ：8 、 1 4 ：1 0 的生物量，这是由于此时的c 0 2 固定速率大于其它两组。 1 3 4 产油微藻的培养方式 前面提到，微藻利用无机碳源进行光合自养，也可以利用有机碳源进行异养代谢， 而在无机碳源和有机碳源共同存在的条件下，微藻则可以同时进行自养代谢和异养代 谢，即兼养代谢或混合营养方式。 ( 1 ) 光合自养 相比于其它培养方式，光合自养最大的优点就是能够高效地固定c 0 2 ，文献报道， 栅藻可以在1 0 的c 0 2 浓度下工f 常生长，生物量和油脂每天的平均生成速率分别为 2 17 5 0 和2 0 6 5m l ，c 0 2 固定效率可以达到2 4 【3 4 】。 ( 2 ) 异养培养 并非所有的藻种均可以利用有机碳源异养生长，根据g l a d u e 提出的三种假说， 微藻之所以不能异养的原因在于：部分微藻的细胞膜通透性较差，阻碍了有机物的运 输，或者有机物的运输缺乏载体或能量【3 5 3 6 】；有的微藻缺乏利用有机物的酶3 5 3 7 】；一 些微藻异养代谢释放的能量不足以支持自身的生命活动所需的能量。 部分不能异养的藻种可以通过异养驯化和转化技术进行异养代谢，一般异养的微 藻能够得到较高的生物量和油脂含量，油脂含量可以达到4 6 8 或更耐3 8 1 。但是微藻 异养存在的问题是容易染菌，放大很难实现。 ( 3 ) 兼养代谢 兼养代谢即兼性异养或兼性自养，也可称为混合营养方式。相对于其它两种培养 方式，微藻兼养代谢的优点在于：微藻利用有机碳源可能因为光合自养受限，例如光 照或碳源不足，则兼养代谢可以帮助微藻在此环境下正常生长，甚至获得更高的细胞 浓度；异养培养方式因为没有光照射，胞内缺乏某些在光诱导下才能合成的产物，而 兼养代谢则可以合成；兼养培养方式需要比较微弱的光照强度即可，因此节省能量， 较容易实现放大。 对于产油微藻而言，兼养代谢虽不能显著提高胞内总脂肪酸的含量，但是微藻的 细胞浓度可以得到显著提高，从而提高了油脂产量【3 9 删。 6 积累油脂的能力较强，细胞油脂含量可以占干重的3 3 附4 2 1 。栅藻细胞显微镜照 片如图l 一2 所示。 图1 2 栅藻细胞显微镜照片 f i g 1 - 2m i c r o g r a p h so fs c e i l e d e s m u 8c e l l s 1 4 本课题的选题依据及工作内容 1 4 1 选题依据及创新之处 目前关于栅藻合成油脂的研究较少，由于栅藻固定c 0 2 的能力较强，并且可以利 用葡萄糖进行异养代谢，为可以异养的少数藻种之一，同时可以适应废水的环境，生 长迅速，油脂含量也较高，故本课题选取四尾栅藻作为研究对象。本课题主要研究通 过不同的培养方式培养栅藻生产微生物油脂，考察栅藻在无机碳和有机碳条件下的生 长和产油情况，并对栅藻和粘红酵母混合培养的现象及机理进行初步探索。另外，由 于目前采用的测量油脂含量的方法存在许多问题，尝试建立快速测定油脂含量的荧光 分光光度计法。 1 4 2 工作内容 本论文的工作内容主要分为四个部分： ( 1 ) 建立快速测定油脂含量的荧光分光光度计法。 7 北京化工大学硕士学位论文 ( 2 ) 考察在栅藻光合自养过程中，几种营养元素对栅藻生长及产油的影响，主要包括 镁离子、氮源及无机碳源。 ( 3 ) 尝试采用栅藻与粘红酵母混合培养的方法生产微生物油脂，考察混合培养对微生 物生长及产油的影响，并初步探索产生该影响的原因。 ( 4 ) 考察有机碳源葡萄糖对栅藻生长和油脂合成的影响，并研究在葡萄糖和c 0 2 共存 条件下栅藻发生兼养代谢的现象，同时考察栅藻对淀粉废水及其c o d 的降解情况。 2 1 菌种 所用四尾栅藻( p 咒p 如m 淞g 绷挑“如) 由武汉水生生物所提供，粘红酵母 俾j l l d 如幻朋肠g 缸砌括) r h g 由北京化工大学，北京市生物加工过程重点实验室保藏， 系中国食品发酵所购买的粘红酵母菌株经过多次诱变得到。 2 2 培养基 2 2 1 栅藻培养基 四尾栅藻培养采用b g l l 培养基，将各种营养组分配成五种储存液于4 冰箱保 存，使用时按照一定比例将储存液混合。五种储存液的配方以及每升工作液配比见表 2 1 。 表2 1b g l l 储备液组分和每升培养基的配比 t a b l e2 一lc o i n p o s i t i o no fb gl ls t o c ks 0 1 u t i o na l l dt l 圮m t i oo fs t o c ks o l u t i o n p e rl i t e rm e d i u m s t o c k ls t o c l 【2s t o d 凸s t o c k 4s t o c k 5 2 m l5 0 m l2 m l1 m ll m l 按比例配制好后，补加去离子水到l l ，调p h 值为6 5 7 5 。 2 2 2 粘红酵母培养基 粘红酵母的培养基配方见表2 2 及2 3 。 9 北京化工大学硕士学位论文 表2 - 2 保种培养基成分 t | a b i e2 - 2c o m p o s i t i o no fy e a s tc o n s e r v a t i o nm e d i u m 试剂含量( 1 0 0m l 去离子水) 葡萄糖 酵母粉 脲 琼脂 2 0g o 4g 0 2g 2g p h 值用0 1m o l lk o h 调节至4 5 表2 - 3 摇瓶培养基成分 1 b k2 - 3c o m p o s i t i o no fy e a s tm e d i u mi 1 1n a s kc u l t u r e 试剂含量( 1 0 0m l 去离子水) 葡萄糖 ( n h 4 ) 2 s 0 4 k h 2 p 0 4 n a 2 s 0 4 m g s 0 4 。7 h 2 0 酵母粉 4g 0 2g 0 7g o 2g o 1 5g o 1 5g p h 值用0 1m o l lk o h 调节至5 5 2 2 3 栅藻和粘红酵母混合培养的培养基 混合培养的培养基是栅藻和酵母各自培养基简单加合，其配方是：配方如下( 1 l ) ： 葡萄糖4 0 9 ；酵母粉1 5 9 ；( n h 4 ) 2 s 0 42 o g ；k h 2 p 0 47 o g ；n a 2 s 0 42 0 9 ；m g s 0 4 7 h 2 0 1 5 9 ；b g - 1 1 培养基的s t o c k l2 m l ；s t o c k 25 0 m l ；s t o c k 32 m l ；s t o c k 41 m l ；s t o c k 5 1 m l 。初始p h 调节到6 o 。 2 3 培养方法 2 3 1 栅藻的培养方法 ( 1 ) 栅藻的纯化 在b g l l 液体培养基中加入1 5 2 o 的琼脂粉，经1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 m i n ， l o 第二章实验材料与方法 冷却后在超净台倒入灭菌后的培养皿中，制成平板。在超净台将待分离的藻液通过涂 布或者划线的方法接种于平板上，然后放置于光照培养箱内，2 7 、2 5 0 0 l x 下培养至 出现单藻落，挑取单藻落进行纯培养。 ( 2 ) 摇床培养 在无菌条件下，将适量纯培养的藻液接入盛有1 0 0 m l 培养液的2 5 0 m l 摇瓶中， 初始接种浓度一般为1 0