（分析化学专业论文）谷胱甘肽和硒的反应机理研究.pdf

摘要 许多研究报道了亚硒酸盐与含巯基的化合物反应f 如谷胱甘肽) 是催化氧化反 应。在此，我们通过动态的e s i m s ，对在水溶液中简单混合反应的谷胱甘肽和亚 硒酸钠作用产物及中间产物进行了表征，且利用动态的u v - v i s 分光光度法和 1 h n m r 进行分析测定。实验结果表明，谷胱甘肽和亚硒酸钠反应是动态的氧化还 原反应，在反应第一步，g s h 直接氧化还原反应形成g s s g 和不稳定的g s s e s g 中间体，而后不稳定的g s s e s g 中间体进一步与剩余的g s h 氧化还原反应生成 g s s g 和零价硒当g s s g 的数量显著增加或溶液的酸性增加时，g s h 的氧化还原 电位e ( 矿( g s s g 2 g s 功= 2 5 0 m v ( n h e ) 显著转化为正电位，使g s s g 具有高氧化 性，并与零价硒发生氧化还原反应。这些可以通过另外的i n z4 1 8 的不稳定中间阴 离子 g s s s e 的化学组成证明。这些反应机理可通过动态e s i m s ，1 h n m r 和 u v v i s 分光光度法测定。 此外，我们还探讨了利用天然高分子壳聚糖为软模板水相制各纳米硒的方法。 研究了诸多反应因素，如反应时间、反应物浓度、超声等实验条件对产物粒度大小、 形貌的影响。结果表明，当n ( c s 哪：n ( n a 2 s e 0 3 ) = 8 ：1 、壳聚糖质量分数为0 4 、2 5 。c 下反应3h 后，可获得均匀稳定的球形纳米硒颗粒，平均粒径约5 0i l i a ，且 在定条件下得到了棒状纳米硒。本文通过紫外分光光度法、x 射线衍射、透射 电镜、扫描电镜等对产物进行了结构分析和形貌观察。 关键词：亚硒酸钠；谷胱甘肽( g s h 、g s s g ) ；硒；e s i m s ；纳米硒 a b s t r a c t s e l e n i t eh a sb e e nf o u n dt ob ea na c t i v ec a t a l y s tf o rt h eo x i d a t i o no fs u l f h y d r y l c o m p o u n d ，s u c h a sg s h c o n s i d e r i n gt h eb i o l o g i c a li m p o r t a n c eo fg s ho x i d a t i o na n d t h ei m p l i c a t i o no fs u i f i a y d r y lc o m p o u n d si ns e l e n i u mp o i s o n i n ga n do t h e rb i o l o g i c a l a c t i v i t i e s ，m o r ei n f o r m a t i o no ns e l e n i t eo x i d a t i o no fg s hi ne n z y m e f r e ec o n d i t i o n si s d e s i r a b l e h e r e i n ，w ed e s c r i b e sg l u t a t h i o n ea n ds o d i u ms e l e n i t es i m p l ym i x e di n a q u e o u ss o l u t i o n s ，t h ei n t e r a c t i o np r o d u c t sa n dt r a n s i e n ti n t e r m e d i a t ew e r ei d e n t i f i e d a n dc h a r a c t e r i z e db yu s i n gd y n a m i ce s it a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y t h em i x t u r e s o l u t i o n sw e r ea l s oc h a r a c t e r i z e db yu s i n gd y n a m i cu v - v i ss p e c t r o m e t r ya n d1 h n m r s p e c t r o m e t r y t h ee x p e r i m e n tr e s u l t si n d i c a t e dt h a td y n a m i cr e d o xr e a c t i o n st a k ep l a c e b e t w e e ng s ha n ds e l e n i t e i nt h ef i r s ts t e p ，g s hi s d i r e c t l yo x i d a t e dt of o r m d i g l u t a t h i o n ea n du n s t a b l e s e l e n o d i g l u t a t h o n e ( g s - s e - s g ) i n t e r m e d i a t e t h e nt h e u n s t a b l e s e l e n o d i g l u t a t h i o n ei n t e r m e d i a t e f u r t h e rr e a c t e dw i t hl e l tg s ht of o r m d i g l u t a t h i o n ea n de l e m e n t a ls e l e n i u ms e o a st h ea m o u n to fg s s gs i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e do r a c i d i t y o ft h es o l u t i o ni n c r e a s e d ，t h er e d o x p o t e n t i a l o f g s h ( e 。( g s s g 2 g s h ) = 一2 5 0 m v ( m m ) ) s i g n i f i c a n t l ys h i f t e dt ot h ep o s i t i v ed i r 6 c t i o n ， w h i c hm a k e st h eg s s gh a v em o r eo x i d a n tp r o p e r t i e sa n dl e a d st ot h er e d o xr e a c t i o n s b e t w e e ng s s ga n ds e ， w h i c hc a nb ed e m o n s t r a t e db ya n o t h e ru n s t a b l ei n t e r m e d i a t e a n i o n s ( m z4 1 8 【g s s s e 】_ ) t h er e a c t i o nm e c h a n i s mb e t w e e ng s ha n ds o d i u ms e l e n i t e i s p r o p o s e dt h r o u g h t h ed y n a m i ce s i m s ，1 h - n m ra n du v - v i s s p e c t r o m e t r i c m e a s u r e m e n t s f u r t h e r m o r e ，w ea l s os y n t h e s i z es e l e n i u mn a n o p a r t i c l e si na q u e o u ss o l u t i o nb y u s i n gc h i t o s a n ( c t s ) a sas o f tt e m p l a t e i nt h i sp a r te x p e r i m e n t ，w es t u d ym a n yf a c t o r s w h i c hc a na f f e c tt h es i z ea n df o r mo ft h ep r o d u c t t h ef a c t o r si n c l u d er e a c t i o nt i m e ， c o n c e n t r a t i o no fr e a c t a n t sa n du l t r a s o n i ci r r a d i a t i o n a f t e r3 hr e a c t i o no ft h em i x t u r e i i o f 0 4 0 0 o ( m a s so fr a c t i o n ) c t s ，n ( g s h ) ：n ( n a 2 s e 0 3 ) = 8 ：1 ，t h eu n i f o r ms t a b l es e l e n i u m n a n o s p h e r e sw e r eo b t a i n e dt h ea v e r a g ep a r t i c l es i z e o fs e l e n i u mi sa b o u t5 0 n m s e l e n i u mn a n o r o d sw e r eo b t a i n e di ns o m ec o n d i t i o n t h ep r o d u c t sw e r ec h a r a c t e r i z e d b y u v ，x r d ，t e ma n ds e m k e yw o r d s ：s o d i u ms e l e n i t e ；g l u t a t h i o n e ( g s h 、g s s o ) ；s e l e n i u m ；e s im a s s s p e c t r o m e t r y ；n a n o s e i i i 1 1 硒化合物的研究 第一章绪论 硒作为重要的生物微量元素之一【1 】而被研究，是近二十年才开始的，目前已经 引起全世界的广泛注意。在生命活动过程中，生物微量元素硒( b i o t r a e ee l e m e n t s e l e n i u m ) 是已知的1 4 种必需的微量元素【2 之一。机体内硒水平下降将直接影响 骨骼、心肌及肝脏、眼睛、前列腺、甲状腺等多种重要的生命组织器官。近年来， 它以旺盛的活力向生命科学各个领域渗透i 发展迅速。有关硒的生物与化学形态 分析的探索已成为一个十分引人注目的研究热点。 人类对硒的生物医学作用的认识经历了一段漫长而曲折的过程。硒曾经被认 为是有毒的元素【3 】，相当长一段时间内人们一直相信硒是致癌物质，苏联学者也做 过硒致癌的研究报告。1 9 5 7 年，s c h w a r z e | 4 】首次证明硒是动物体内必需的微量元 素之后，才使人们对硒的认识有所改变。目前，国际上应用硒防治威胁人类的重 大疾病方面( 如肿瘤、心血管病等) 已做了大量研究工作，许多工作仍在进行中。 7 0 年代，我国学者用硒( 主要是亚硒酸钠) 在贫硒地区防治克山病取得了重大突 破【5 1 。8 0 年代，我国用硒防治大骨节病及肿瘤等方面取得了重大进展【6 】，9 0 年代 c l a r k 等【7 j 贝口报道膳食中以富硒酵母的形式补充硒的摄入，可使癌症的发病率、死 亡率下降5 0 左右。 在实际生物体内，通常硒仅在一个有限的浓度值范围内发挥作用，并且仅从 调查统计得到硒与某种疾病的发病率有相关性，并不足以说明它的缺少或过多就 是产生这种疾病( 或毒性) 的原因。可见各种硒化物的不同的生理、生物活性， 及其迁移转化规律，不仅取决于硒的总浓度水平，而且同硒的不同生物化学形态 以及不同生物化学形态下硒化物的浓度水平直接相关。因此，为了阐明硒与疾病 和健康的因果关系，必须将硒的生物化学研究同硒的生物分析化学研究工作充分 结合起来。当前随着分析化学领域同生命科学领域的不断深入交叉融合，建立各 种新的分析技术与新的分析方法研究硒的生物化学形态，进一步探讨硒在生命过 程中的行为，显然是一个十分重要的研究课题。 1 ，1 1 硒的存在形式 1 1 1 1 无机形态的硒化物”1 硒位于第六主族，为准金属元素。地壳中硒的丰度仅为o 0 5 0 0 9g g - 1 ，由于 自然因素和人为因素的影响而在自然界中散布。无机形态的s e ( i i ) 硒化物，有 h s e h 2 s e 以及金属硒化物等，其中h 2 s e 有毒且不稳定。硒的金属化合物在土壤 中可能是不溶态的：以单质硒s e ( 0 ) 存在的单质s e 非常稳定，但很难溶解，在溶 液中可能以胶态存在：以s o ( r v ) 存在的亚硒酸及其盐，如h s e 0 3 。，s e 0 3 2 ，以s e ( v 1 ) 存在的硒酸盐，如s e 0 4 2 。等，很稳定，耐碱，耐氧化。 1 1 1 2 有机形态的硒。1 硒直接与碳成键，生物体中存在的有机硒化合物主要有：硒代半胱氨酸、硒 甲基硒代半胱氨酸、硒蛋氨酸、硒甲基硒代蛋氨酸、硒脲、硒代胱氨酸、二甲基 硒、二甲基二硒、三甲基硒等。硒代氨基酸是人日常膳食中获取硒的主要来源， 其中硒代蛋氨酸来自于植物体；硒代半胱氨酸来自于动物体。哺乳动物体内大部 分的硒以硒代半胱氨酸的形式在相应功能蛋白中发挥生物活性作用。 1 1 1 3 纳米硒( n a n o - s e ) 纳米硒1 1 0 】是采用纳米技术，将零价硒制成纳米颗粒。零价硒有灰色、黑色和 红色三种形态。灰和黑色零价硒为粉末状态，不溶于水，无活性和毒性。亚硒酸 钠与还原剂反应形成红色零价硒，为浑浊状态，不稳定，最终形成灰或黑色零价 硒。一些对无机硒耐受性强的微生物，能够将+ 6 和+ 4 硒转化为红色零价硒，出现 红硒化现象，这种红色零价硒是胶体状态。 纳米硒与一般零价硒相比，发生了物化和生物性质的突变：从黑色变为红色； 从不溶于水变为透明胶体溶液；从不能进行化学反应变为能高效直接清除自由基 1 1 1 ；从无生物吸收利用变为高生物吸收；从无毒性变为有毒性，但是它的毒性比 2 无机硒和天然有机硒明显低f 1 2 d 引，如急性毒性是无机硒的1 7 ，短期毒性显著低于 无机硒，长期毒性全面低于天然有机硒和无机硒。纳米硒挑战了零价硒无活性的 教条，这种长期被摒弃的零价硒，达到纳米尺寸后，有高活性，是目前已发现的 毒性最低的硒，展示了科学上打破常规、创新的魅力，也体现出纳米技术的神奇。 1 1 2 硒与癌症 硒在癌症的化学预防和治疗方面有明确的作用。然而，目前的研究资料显示 硒在超营养水平和大剂量时才有明显效果，而这些剂量接近硒毒性范围内。这种 困境迫使我们研究低毒高效的硒。长期持有的教条是：零价硒无生物利用价值， 但其制备成纳米颗粒后，却显示出高活性与低毒性，这就意味着纳米硒在癌症的 预防和治疗方面有光明前景。 流行病学调查中发现，低硒地区癌症发生率高于富硒地区癌症发生率。如果 硒的摄入量多，癌症发生的机率就小，这从宏观上建立了硒与癌症的关系。实验 发现，约1 5 0 0 个美国人每日补充2 0 0 微克硒，平均补硒4 5 年，这些人的血硒比没补 硒的对照人群提高了2 至3 倍，且肺癌、前列腺癌和结肠癌的发生率比没补硒的对 照人群下降5 0 7 0 7 1 。目前已进行1 0 0 多项动物试验，用化学致癌物诱发动物产生 各种癌症，如肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、肠癌。在诱发之前、之后或诱发同时， 在动物的饲料中或饮水中添加硒，为正常量的5 1 0 倍，即所谓“超营养”水平硒， 经3 至1 2 个月，对比癌症发生率，癌变程度等。有2 3 的研究结果显示硒能防癌， 降低癌症发生率和癌变程度。硒防癌包含两个方面，一方面它能阻止正常细胞变 为癌细胞，另一方面它能杀伤癌细胞或抑制癌细胞生长。在细胞培养中，加入硒 既有杀伤又有抑制癌细胞作用，取决于加硒量，几个微摩尔浓度时它抑制癌细胞 生长，十几个微摩尔浓度时它使癌细胞通过凋亡途径死亡，更高量时它使癌细胞 通过坏死途径死亡。每日补硒2 0 0 微克，人的血硒可达到2 3 微摩尔浓度，多时可 达n 5 微摩尔浓度，这个水平对有些癌细胞产生明显的抑制生长和促进凋亡死亡作 用。癌症治疗中使用硒辅助治疗十分普遍。放化疗导致病人的白细胞下降、腹泻、 呕吐、睡眠差、食欲不振、淋巴水肿等严重副作用，服用硒能明显改善这些症状。 在癌症的放化疗中，用还是不用抗氧化物辅助治疗是有争议的，因为抗氧化物可 能既保护了正常细胞也保护了癌细胞。硒是个例外，如顺铂化疗会产生肾毒性、 听力下降，服用硒可抑制这些副作用，硒不仅不降低顺铂杀癌细胞疗效，反而会 增加它的疗效。目前只有硒减少放化疗副作用和增强放化疗疗效的报道，无硒抑 制放化疗作用的反面报道。研究发现，在给动物注射化疗药同时补充硒，可以明 显降低癌细胞的耐药性i 悼1 5 】。更有趣的发现是，愈是对化疗药不敏感的癌细胞， 反而对硒变得十分敏感，容易被硒杀伤。由此看来，硒一方面降低了化疗药的耐 药性，使癌细胞始终对化疗保持敏感，易于治疗，另一方面硒还可以弥补化疗药 的不足，使对化疗药不敏感的癌细胞通过硒杀伤。控制癌细胞转移是癌症治疗的 难题，硒对癌细胞转移有抑制作用：把黑色素瘤细胞注射到小鼠血液中，不治疗 很快就转移到肺部，分别用亚硒酸钠、硒蛋氨酸、富硒大豆和合成的有机硒补充 给小鼠，肺转移下降5 0 9 0 f “】。2 0 0 4 年美国用超大剂量硒与依力替康联用，取得 惊人效果。依力替康是最新的治疗肠癌化疗药物，它对敏感性肠癌和头颈部癌治 愈率为2 0 3 0 ，对不敏感性肠癌和头颈部癌治愈率为0 1 0 。当与超大剂量硒联用 后，敏感性肠癌和头颈部癌治愈率达至1 1 0 0 ，敏感性肠癌和头颈部癌治愈率达到 4 0 8 0 【1 7 】。 综上所述，可见硒在预防癌症、控制癌症转移、降低化疗药耐药、减少放化 疗痛苦、杀伤化疗药不敏感癌细胞和提高化疗的治愈率方面均有明显效应。超大 剂量硒使化疗药的治愈率显著提高的最新发现将推动硒合并化疗治疗癌症的研究 与应用。然而，硒的特点是生物活性和毒性之间范围极端狭窄，但是预防癌症需 要超营养水平硒。因此，各国科学家研究了很多硒化合物，试图寻找活性高毒性 低的硒形式，以释放硒在防治癌症方面的能量。 1 2 谷胱甘肽及其研究进展 1 2 1 谷胱甘肽的介绍 还原型谷胱甘肽的英文名为：i 厂g l u t a t h i o n e g l u t a t h i o l ( 删o s h ) 。g s h 是一 种具有重要生理功能的活性三肽，它由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而 成，化学名为l - 谷氨酸一l - 半胱氨酸一甘氨酸。早在1 8 8 8 年，就己由j d e r e y p a i l a d e 首先从酵母中分离出来，1 9 2 1 年h o p k i n s 得到晶体【1 8 j 。1 9 2 9 年h o p k i n s 、k e n d a l l 等提出g s h 是三肽结构，并于1 9 3 5 年由h a r i n g t o i l 和m e a d 阐明其化学结构并加 以合成【1 9 1 。g s h 的相对分子量为3 0 7 3 3 ，熔点1 8 9 1 9 3 f 分解) ，其晶体为无色 透明细长柱状，溶于水、烯醇、液氨和二甲基甲酰胺，而不溶于醇、醚和丙酮。 g s h 固体较为稳定，而水溶液在空气中易被氧化。g s h 广泛存在于自然界生物体 内，而以酵母、谷物种子胚芽、人体和动物心脏、肝脏、肾、红细胞和眼睛晶状 体中含量较高【刎。正常人体内还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的比例为1 0 0 ：1 ， 火体的肝脏和肾脏是g s h 主要的合成、代谢和排泄器官1 2 1 】。 一。j h n 0 o e h 2 h s 0 h n 0 h 2 c 、s s g g s s g n 、c 0 0 h h 图1 1g s h 和g s s g 的化学结构 1 2 2 谷胱甘肽的生理功能及临床应用。 谷胱甘肽分子中含有一个特异的丫一肽键，由谷氨酸的j r 一羧基与半胱氨酸的a - 氨基缩合而成，且半胱氨酸侧链基团上连有一个活泼巯基【2 2 1 ，是谷胱甘肽许多重 要生理功能的结构基础。谷胱甘肽在许多重要的生物学现象中起着直接或间接的 作用，如蛋白质和d n a 的合成、物质的运输、酶的活性、新陈代谢及细胞的保护 等。它是许多酶反应的辅基，可作为抗氧化剂保护生物分子蛋白的巯基，清除体 内过多的自由基，参与体内三羧酸循环及糖代谢，具有解毒、延缓衰老、预防糖 尿病和癌症以及消除疲劳等作用【2 3 j 。 谷胱甘肽在细胞内抗氧化系统中扮演着重要的角色。生理情况下，细胞内的 g s h 的合成与消耗处于一种动态平衡。细胞内消耗g s h 的途径主要有：g s h 在谷胱甘肽过氧化物酶( g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ，g s h p x ) 的作用下可以与过氧化氢 ( h 2 0 2 ) 或脂质过氧化物反应，生成二硫化谷胱甘肽( g s s g ) ；除了g s h p x 能催化上 述反应外，新发现的过氧化还原酶( p e r o x i r e d o x i n s ) ，以其蛋白分子半胱氨酸残基上 的s 2 - 作为催化中心的活性部位，催化g s h 与h 2 0 2 反应，生成g s s g 。g s h 可 以与亲电子复合物在非酶或谷胱甘肽巯基转移酶( g l u t a t h i o n es - - t r a n s f e r a s e s ，g s n 的作用下产生交联复合物。此外，g s h 还可清除细胞内以碳原子为中心的自由基， 最后生成g s s g 和超氧阴离子( 0 2 ) 。细胞内g s h 的主要来源有：通过t 一谷氨 酰半胱氨酸合成酶“一g l u t a m a t e c y s t e i n es y n t h e t a s e ，g c s ) 和谷胱甘肽合成酶 ( e l u t a t h i o n es y n t h e t a s e ，g s ) 催化的合成反应。细胞内的g s s g 在谷胱甘肽还原酶 的作用下，由还原型辅酶i i 咖p 啪提供h + ，再还原成g s h 。 o s s o 还可以与 蛋白分子中的巯基( s m 反应，生成蛋白一二硫化谷胱甘肽复合物和g s h 。 g s h 与g s s g 二者构成一动态平衡系统，使g s s g 维持在总g s h 量的1 1 0 水平，构成一有效的抗氧化系统。生理状态下，g s h g s s g 维持在高比率， 而在氧化应激时，g s h 氧化成g s s g ，g s h g s s g 比率下降，故二者比值是反映 组织抗氧化能力的重要指标。 表1 1 谷胱甘肽的生理功能和临床应用。 生理功能临床应用 保护蛋白质或酶的巯基免遭氧化 防止红细胞溶血；促进高铁血红蛋白的还原； 性破坏，阻止h 2 0 2 氧化血红蛋白， 抑制白内障以及角膜与视网膜疾病的发展，防 防止其它过氧化物对生物膜的破 止角膜移植后产生浑浊。 坏作用。 保护蛋白质或酶的巯基免遭氧化防止皮肤老化及色素沉积；促进皮肤产生光 性破坏，阻止h 2 0 2 氧化血红蛋白，泽；改善皮肤抗氧化能力；防止肿瘤或动脉硬 防止其它过氧化物对生物膜的破化的产生；减少自由基对d n a 的攻击而导致 坏作用。的损伤和突变。 对放射线照射、放射性药物及抗肿瘤药物所引 抗辐射。起的白血球减少、放射线引起的骨髓组织炎与 口腔粘膜炎均有保护或减轻症状作用。 与外源或内源的活性化合物结合 解除丙烯腈、氟化物、一氧化碳、芥子气、重 或发生反应，从而解除这些物质对 金属、农药、药物和有机溶剂造成的中毒症状。 生物体的毒性。 参与转甲基、转丙氨基反应，维持抑制乙醇侵害肝脏产生脂肪肝；减轻病毒性肝 并促进肝细胞正常功能。 炎与药物性肝损伤症状：减轻低白蛋白血症。 此外有报道称，谷胱甘肽具有抑制艾滋病病毒【洲，改善性功能的功效。如果 谷胱甘肽在体内的含量降低于正常水平，将导致像糖尿病闭、酒精肝中毒【2 6 1 、白 内斟2 7 1 、肿瘤、帕金森综合症1 2 9 】等一系列病症在人体的发生。 谷胱甘肽具有广泛的生理和药理活性，因此具有广泛的临床应用潜力。相信随 着对于其在中枢神经系统中的作用和与肿瘤治疗的关系的进一步明确，g s h 的临 床应用及药物的设计和开发将有更大的进展。 1 3 生物质谱技术 近年来生物质谱技术在肽分析方面的影响也是不可忽略的。质谱技术的基本 原理是样品分子电离汽化后根据不同离子质荷比的差异来分离并确定其分子质 量。其优点是很低的耗样量及高速率易操作等，因此近年来得到了越来越多的关 注，随着各种衍生化方法和酶解方法的不断改进以及质谱技术的不断完善，质谱 将会成为肽和蛋白质序列分析最有威力的工具之一。 生物质谱主要用于解决两个分析问题：精确测量生物大分子的分子量，并提 供分- t - 结构信息；对存在于生命复杂体系中的微量或痕量小分子生物活性物质进 行定性或定量分析。现代质谱发展了各种新软电离技术及联用技术，扩展了质谱 可测质量范围，特别是色谱一质谱联用技术和质谱串联技术。下面主要介绍电喷 雾质谱的软电离技术 3 0 - 3 1 1 。 1 3 1 电喷雾电离( e s i ) 质谱技术和碰撞诱导解离( c o l l i s i o n i n d u c e d d i s s o c i a t i o n c i d ) 。 电喷雾电离( f - s o 是一种“软”电离技术起源1 9 1 7 年，但它用于质谱是8 0 年代 的事。1 9 8 4 年美国耶鲁大学化工系教授约翰芬思( j o h nb f e m ) 研究组等首次发 表了e s i - - m s 实验结果，并于4 年后报道首次成功运用e s i - - m s 分析蛋白质。 e s l - - m s 既可分析大分子也可分析小分子。对于分子量在1 0 0 0 d a 以下的小分子， 会产生【m + h 】+ 或 m h 】离子，选择相应的正离子或负离子形式进行检测，就可得 到分子量。而高达2 0 0 0 0 d a 大分子在e s i - - m s 中生成一系列多电荷离子，通过数 据处理系统能够得到样品的分子量，准确度优于0 0 1 。这些离子( m z ) 以“表观” 质量数出现在谱图，与分子量有密切关系。e s i - - m s 或与h p l c 联用可进行蛋白 质序列和构象分析，酶反应中间体分析，酶抑制剂机理分析、共价或非共价复合 体分析等方面均获得应用。有人预测用e s i 可测得数m d a 分子量的蛋白质。 电喷雾离子源是一种软电离源，通常给出的质谱信号为准分子离子峰，得到 相关的分子量信息，但有关结构的碎片离子却很少，要对化合物结构作进一步的 研究，多级质谱实验是必要的。碰撞诱导解离通常在质谱的质量分析器中操作。 质量分析器的类型有多种，但都是以两种基本方法之一进行c i d 实验1 3 2 - 3 3 l 。一种 是c i d 实验的三个步骤( 分离、分裂、分析) 发生在不同的空间( 如扇形质谱和三段 四级杆质谱) ；一种是在不同的时间( 这种质谱包括四级杆离子阱质谱和离子回旋共 振质谱) ，它可以在同一空间的不同时间完成c i d 的三个步骤。 离子阱具有储存离子和质量分析的功能。基于这个性质上的串联质谱技术是 一种新型的时间尺度上的串联质谱，其特点是离子的产生、质量选择、离子活化、 质量分析以及多级质谱过程都在同一空间( 阱) 中进行，这是与“传统”的串联质谱 的空间上的串联不同的 3 4 3 6 1 。离子阱集离子产生、离子选择、离子活化、质荷比 分析以至多级上述过程统一在同一空间中，阱中母离子与子离子共存，减少传输 损失，因此离子阱质谱比多级四极杆和扇形磁质谱串联仪器能更有效地检测离子， 但缺点是在某些情况下由于阱内有太多的离子造成离子在阱内的相互作用。离子 阱作为串联质谱，具有c i d 和p d ( 激光解离) 功能，它己成功地用于化学电离和气 相离子一分子反应动力学、热力学及其反应机理等气相离子化学以及分析化学研 究领域中。装备有e s i 源的离子井质谱可实现m s “方法对样品进行结构分析。离 子阱的不足则是它无法达成三段四极杆质谱的交替扫描方式，如母离子扫描、中 性离子扫描。 1 4 亚硒酸钠和谷胱甘肽代谢反应研究进展 亚硒酸钠是常用的补硒和治疗用硒剂，但其毒性是一大难题，当其进入体内 的硒是如何转化的呢? g a n t h e r 3 7 1 认为，毒性剂量硒的转化方式与微量硒的正常代 谢途径相同。即主要在肝脏中还原和甲基化。在硒的还原过程中，消耗大量还原 型谷胱甘肽( g s h ) 为主的巯基，同时形成大量的氧化型谷胱甘肽( g s s 6 ) 槲胱甘 肽( g s s e s g 和g s s c g ) 。在硒的还原过程中需消耗n a d p h 和谷胱甘肽还原酶( g r ) 的催化。还原后的h 2 s e 或单甲基硒的甲基化反应，是各种形式硒一无机硒和硒蛋 氨酸的重要终末代谢途径之一。甲基化反应是在s 一腺苷蛋氨酸侣a m ) 的参与下， 由s 一甲基转移酶完成。从二甲基硒m s e ) 生成三甲基硒阳离子( t m s e + 1 似乎是很 自然的，但尚无直接的证据。有机硒和无机硒的代谢方式有所不同。植物或谷类 食物中以甲基硒形式存在的硒可以通过转硫途径生成硒半胱氨酸( s e c y s ) ，后者又 经转氨释放出c h 3 s e h 。甲基硒可作为甲基的取代物，参入蛋白质分子中，使组织 硒的存留量升高。而s e c y s 不能代替蛋白质中的半胱氨酸，却能被硒半胱氨酸裂 解酶分解为丙氨酸和h 2 s e ，进入无机硒的代谢通路。因此s e c y s 与无机硒更为接 近，表现出体内储存少、排泄较快的代谢特点。 代谢途经： s e 0 3 2 告g s s e s 畦塞罴耋“a g d s ps e h 丽n a d ：p 五h 意+ h + n a h d p 2 s e ；( c h 3 ) 3 s e p a i n t e r 3 8 】等报道n a 2 s e 0 3 与含巯基的生物分子反应( 如半胱氨酸残基、谷胱甘 肽和辅酶a 等) 会产生硒代三硫化物r s s e s r 。这个化合物在硒的代谢中具有重要 意义。它是无机硒化合物进入生物体后首先生成的产物。通过进一步作用硒再进 入硒蛋白中。巯基与h 2 s e 0 3 结合，从化学计量关系上看，比例是4 ：1 ，反应如下： 4 r s h + h 2 s e 0 3 - r s s e s r + r s s r + 3 h 2 0 硒中毒对蛋白质( 酶) 巯基的破坏，可能采取这种方式，也可能存在其它机 理。 t s e na n dt a p p e l 3 9 】指出，n a 2 s e 0 3 和g s h 是如下催化氧化反应： 4 g s h - i - s e 0 3 2 ：_ - - g s s g + g s s e s g + 2 0 h + h 2 0 g s s e s g + 2 0 h 。+ 0 2 + g s s g + s e 0 3 2 + h 2 0 但是目前，对于其催化机理还上不明确是有争议的，有待证实。文献对以 上反应体系进行了进一步研究，提出有、无h 2 0 2 ( 或0 2 ) 参与n a 2 s e 0 3 和g s h 的反应， 其反应都有g s s e s g ( 紫外分析中2 6 0 n m 处有特征吸收峰) 产生，除此外，在紫外 分析的2 0 0 n m - 7 0 0 n m 吸收范围内无别的特征峰出现，而得出无其它硒化合物生成的 结论。也指出，当p h 9 0 时，反应体系都无g s s e s g 生成。反应体系愈 接近p h = 7 4 ，g s s e s g 愈不稳定。p h = 7 4 时g s s e s g 生成的量最多，但同时也 最不稳定。 一 1 5 本实验研究的目的、意义和创新点 本实验主要创新点在于利用生物质谱分子表征和光谱表征手段，对谷胱甘肽 和亚硒酸钠的反应机理中尚存问题进行研究，结果较为全面地解释反应机理。且 通过研究探讨纳米硒的低毒，高活性的分子机理。这对低毒纳米硒的生物利用具 有重要的意义。纳米硒对g s 彤g s s g 比率的非酶调控作用和分子机理的研究，对纳 米硒的生物利用和安全使用外源性硒作为营养元素，对纳米硒在防病、治病和相 关的保健品的开发都有重要的理论意义。 1 0 第二章谷胱甘肽和亚硒酸钠的反应机理研究 2 1谷胱甘肽和亚硒酸钠混合物的e s i - - m s 动态分析 2 1 1 前言 e s i 离子化技术的引入和近2 0 年来质量分析器的发展，使质谱可以解决大量复 杂结构确认的问题。e s i 质谱可以使大分子化合物带上多电荷( 如肽类、蛋白质等) ， 形成谱图中多电荷离子，分析不同的质荷比信号使分子量得以准确确定。本实验 通过质谱，表征谷胱甘肽和亚硒酸钠混合物的反应中间体及作用产物，且用m s m s 串联质谱对产物进行结构表征。为反应机理的探讨提供了重要的信息。 2 1 2实验部分 2 1 2 1 仪器与试剂 l c q - a d v a n t a g e ( 美- - m f i n n i g a n 公司) ；谷胱甘肽，亚硒酸钠( s i g m a 公司) ， 乙酸( a r ) ，二次蒸馏水。 2 1 2 2 实验条件 质谱在l c q a d v a l l t a g e 质谱仪上操作，仪器配备电喷雾离子源、离子阱质量分 析器，数据通过x c a l i b u r 软件处理。 实验参数：喷雾离子源电压为5 k v ：加热毛细管温度4 6 v ：毛细管电压；2 0 0 。c ； 鞘气( n 2 ) 流速；1 5 a m i n ；少量的氦气引入仪器中可提高诱捕效率，并作为多级 质谱实验的碰撞气。在负离子模式下进行e s i m s 分析。 2 1 2 3 样品溶液的制备。 底液溶液制备：水：甲醇= 5 0 ：5 0 。用此溶液作底液配制g s h ：1 x1 0 3 m o l l ； g s s g ：1 1 0 _ 3 m 0 1 几：亚硒酸钠：1 1 0 m o l l 。 jj ， ，1 1 2 1 2 4 实验步骤 1 取制备好的g s h ( 1 m m ) ，g s s g ( 1 m m ) 标准溶液，在e s i 负离子电离模 式下进行质谱分析。 2 各取5 m l g s h ( 1 m m ) 和亚硒酸钠( 1 m m ) 溶液，放入1 0 m l l l 色管中定容， 配制成5 1 0 。4m o l l 的溶液。简单混合后直接注入到质谱中进行e s i m s 测定，分 别在不同时间段0 h ，2 h ，4 h 的时候进行测定。 3 酸性溶液制备：溶液中加入0 5 的乙酸溶液，来调节酸度。其他步骤如 同2 。 2 1 3 结果与讨论 2 1 3 1 标准样品的质谱分析 为了识别谷胱甘肽和亚硒酸钠反应溶液中的反应物、中间产物和最终产物我 们首先对g s h 和g s s g 标准溶液进行e s i - - m s 负离子模式分析。标准样品均用 水：甲醇= 5 0 ：5 0 作为溶剂。 g s h 质谱图中可以看到，产生去质子化离子峰分别为m z3 0 6 和去质子化二聚 体离子峰m z6 1 3 ，三聚体离子峰m z9 2 0 ，四聚体离子峰m z1 2 2 7 。g s s g 的质谱 分析图中看到，去质子化离子峰分别为m z6 1 1 和二聚体离子峰m z1 2 2 3 。( 图1 ) 在图中可以观察到，本实验的质谱条件下离子源内没有产生明显的碎片离子峰。 1 2 63 。0 。 味心 p 掣嚆黜。 j。r 06 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 01 4 0 0 6 1 2 ”_ 产p r 、一 g s s go 、” 【2 g s s g h 】_ 1 2 2 3 2 o6 0 08 0 0 1 0 0 01 2 0 01 4 0 0 m z 型2 1 e s l 负离子电爵模式f 质谱分析圈均用水，甲醇( 5 0 5 0 ) 为溶剂； 浓度分别为( a ) g s h ( 1 m h d 和c o ) g s s g ( i m m ) 2 1 3 2 反应时间对反应产物的影响 通过比较不同反应时间o h 、2 h 、4 h 时的测定结果，进一步确定反应中间产物 的动态变化。从图中可以观察到几个相互作用产物，其中有g s s g 和g s s e s g 的 去质子峰及钠加合阴离子等。去质子化的g s s g 阴离子峰和它的钠加合阴离子被 观察到，分别为m z6 1 1 4 【g s s g h i 一、m z6 3 3 7 【g s s g + n a 2 h 一、m z6 5 5 8 【g s s g + 2 n a 一3 h 。去质子化的g s s e s g 离子峰和它的钠加合阴离子峰分别出现在 m z 6 9 1 4 g s s e s g - h 。， m z 7 1 3 2 g s s e s g + n a 一2 h ， m z7 3 5 7 g s s e s g + 2 n a 一3 h 。通过比较o h 、2 h 、4 h 时测定的结果可以知道，随着反应时间 的增加g s s e s g 和它的钠加合阴离子明显在减少。说明当延长反应时间时，混合 溶液的质谱图中显示g s s e s g 已分解为零价硒。 o 一c廿uc毋c3口田oi苗|e正 o i s oqc_口c，卫口i瓮ie正 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 o 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 o 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 o 【g s g 戥n a 2 h 】。 1 0 02 0 03 0 04 0 05 0 06 0 07 0 08 0 09 0 0 1 0 02 0 03 0 04 0 05 0 06 0 0 7 0 08 0 09 0 0 1 2 0 03 0 04 0 05 0 06 7 0 08 0 09 0 0 m ，2 图2 2e s i 负离子电离模式下质谱分析图，均用水甲醇( 5 0 5 0 ) 为溶剂 体系中浓度分别是o s h ( 5 1 0 4 m ) 、n a 2 s e 0 3 ( 5 1 0 4 h d 。 ( a ) 是溶液混合后直接注入得到的质谱分析的图 ( b ) 是室温下反应2 h 后进行质谱分析的图 ( c ) 是室温下反应4 h 后进行质谱分析的图 2 1 3 3 酸度对反应产物的影响 在酸性条件下做同样的实验时，发现实验现象是完全不同的。在比较不同反 应时间时测定的质谱图中，我们发现m z3 0 6 【g s h h 】一、m z4 1 8 【g s s s e h h 】- 、 m z6 1 1 【g s s g h 】一、m z6 9 1 【g s s e s g h r 等去质子化的离子峰与中性溶液相比有 明显的变化，通过目标离子峰的相对强度比较表( 表2 1 ) ，我们可以进一步了解 酸性条件下反应中间产物及最终产物等。 图中我们可以明显的看到反应初始阶段，m z4 1 8 g s s s e h h 】一迅速增大，并 且伴随着大量m z3 0 6 g s h 一明一。这个现象是值得我们研究的，而且发现和中性溶 液中测定的结果相比，在酸性溶液中g s s e s g 和它的钠加合阴离子则显著增加。 一冰一-oc曙c：正辱母i葛i正 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 o 1 8 0 6 0 4 0 2 0 o 1 8 0 6 0 4 0 2 0 o 1 0 0 2 0 03 0 04 0 0 7 8 9 3 4 7 8 9 1 2 3 0 04 0 05 0 06 0 0 7 0 08 0 09 0 0 m z 图2 3e s i 负离子电离模式下质谱分析图，均用水甲醇( 5 0 5 0 ) 为溶剂 体系中浓度分别是g s h ( 5 1 0 4 m ) 、n a 2 s e 0 3 ( 5 x 1 0 4 m ) 、0 5 乙酸。 ( a ) 是溶液混台后直接注入得到的质谱分析的图 ( b ) 是室温下反应2 h 后进行质谱分析的图 ( c ) 是室温下反应4 h 后进行质谱分析的图。 表2 1 目标离子产生的相对强度( ) 列表，均用水甲醇( 5 0 5 0 ) 为溶剂，体系中浓度分 别是g s h ( 5 1 0 4 h d 、n a 2 s e 0 3 ( 5 1 0 4 m ) 。分别比较有无0 5 乙酸条件下反应o h 、2 t l 、4 h 后测 定结果。 离子 g s h h i 一【g s s s e h - h 一 g s s g h i 一【g s s g + n a - 2 h 一 2 g s 3 g + 2 n a - 3 h 一【g s s e s g h ) 一【g s s e s g + n a - 2