（食品科学与工程专业论文）人血清章鱼胺含量测定方法的研究与天然章鱼胺补充剂的开发.pdf

上海海洋大学硕士学位论文 人血清章鱼胺含量测定方法的研究与天然章鱼胺补充剂的 开发 摘要 章鱼胺是一种重要的生物胺，作为内源性的神经介质与b 3 。肾上腺素能受体激 动剂，章鱼胺在能量的平衡与能量代谢的调节上有重要的作用，但其生物学意义 与生理学作用尚未被充分认识。人体各种器官特别是肝脏中的细胞色素p 4 5 0 酶系 单加氧酶是体内生物合成章鱼胺的限速酶，有关糖尿病、肝病对细胞色素p 4 5 0 酶 系单加氧酶活性的影响已有详尽讨论。章鱼胺在人体内也可以因单胺氧化酶作用 而被降解，而单胺氧化酶活性过强与抑郁症等精神疾患有关。因此，人血清章鱼 胺含量有可能作为一项血液临床生化检验项目，在病理学和药理学的研究中有潜 在的价值。 本论文分为两个部分，第一部分建立了人血清中肾上腺素能受体激动剂章鱼 胺检测方法，为准确快速测定人血清中章鱼胺含量研究提供可靠的分析手段。第 二部分是天然章鱼胺补充剂的开发，主要是水产品可食部章鱼胺含量的研究，以 及通过营养性小鼠的减肥试验研究章鱼胺对小鼠的减肥降脂作用。 本论文目的之一是建立人血清中肾上腺素能受体激动剂章鱼胺检测方法，据 大多文献介绍，章鱼胺的h p l c 分析多为衍生化方法，但衍生化方法实验操作过 程繁琐，且成本高。本试验想建立一种快速不需要衍生处理的h p l c 检测方法，先 将人血清用流动相稀释5 倍，经微孔滤膜( 0 4 5 “m ) 滤过；在色谱条件的选择中， 我们用色谱柱：p h e n o m e n e xl u n ac 1 8 ( 15 0 x 4 6 0 m m ，5 1 t i n ) ，流动相：0 0 2 m o l l 1 柠檬酸一0 0 2 m o l l - 1 磷酸二氢钠( 7 ：3 ) ，p h 调为3 ，流速：0 8 m l m i n 1 ，紫外检 测波长：2 2 0 n m ，进样体积：2 0 止。实验结果表明，此方法章鱼胺在0 0 0 6 5 0 甥m l d 范围内，浓度与峰面积线性关系良好( r = 0 9 9 9 9 ) ，平均加样回收率为1 0 4 4 ， r s d 为1 5 3 。最低检出浓度为6 0 n g m l 一。此h p l c 检测方法不需要衍生处理， 样品用量少，可直接上机测定，具有良好的专一性，精密度和回收实验结果表明， 测定结果稳定，具有微量、简便、快捷、灵敏等特点，能符合测定的要求。 为证明上述方法的可靠性，我们使用t h p l c 柱前衍生方法与其进行比较，通 过使用h p l c 柱前衍生方法测定人血清中章鱼胺的含量。方法是先用高氯酸溶液提 i 上海海洋大学硕士学位论文 取，并用丹酰氯衍生；色谱条件的选择中，我们用o d s 反相柱，柱温4 0 。c ，检测 波长为2 5 4 n m ，用0 1 m o l l 醋酸铵和乙腈做流动相，梯度洗脱，流速为1 0 m l m l 。 章鱼胺标准品用流动相稀释成0 0 0 1 2 0 m g l 的梯度溶液，按照色谱条件检测，以 峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。经回归分析，章鱼胺在0 0 0 1 2 0 m g l 范围内有良好的线性关系，相关系数大于0 9 9 9 。最低检测限为6 0 n g m l 一。 加低、中、高浓度标准品的回收率是9 0 0 1 1 0 o 。本实验方法灵敏、可靠，适合 临床诊断以及药物研发中分析多种生物胺含量的研究。测出健康成年人血清章鱼 胺的含量是成年人为4 8 7 - 4 - 1 7 0 1 t g m l 。与之前不用衍生的方法测出的结果健康成 年人血清章鱼胺含量为4 5 0 - j ：1 1 0 9 9 m l - 几乎吻合。 本论文目的之二是对天然章鱼胺的开发，首先是对水产品可食部章鱼胺含量 的研究，我们测定了各种淡水和海水水产品可食部中1 33 肾上腺素能受体激动剂章 鱼胺的含量，为水产品中章鱼胺的开发利用提供依据。取鱼、甲壳类、头足类可 食部位匀浆后超声处理，用h p l c 测定离心后上清液的章鱼胺含量。结果表明8 种淡水鱼肉章鱼胺含量在3 0 - 1 3 0g g g - 1 之间，其中，背肉普遍比腹肉中含量高。 海水鱼以及淡水甲壳类的章鱼胺含量与淡水鱼大致相似。海水甲壳类中章鱼胺含 量特别高，是淡水、海水鱼和淡水甲壳类的几十倍，甚至千百倍。头足类的章鱼 胺含量也比较高，在海洋藻类中未检测出章鱼胺。海洋贝类等是水产品中章鱼胺 最丰富的来源，是减肥者与糖尿病人的理想食物。 其次我们研究了章鱼胺对营养性肥胖小鼠的减肥作用。首先采用高脂饲料建 立小鼠肥胖模型，以小鼠体重、l e e s 指数、脂肪湿重、脂肪系数、血清总胆固醇 ( t c ) 、甘油三酯( t g ) 及高密度脂蛋白( h d l c ) 等指标的变化，研究章鱼胺 对小鼠的减肥作用。4 周以后，肥胖对照组小鼠较普通对照组小鼠体重、脂肪湿重、 脂肪系数、血清总胆固醇( t c ) 、甘油三酯( t g ) 及高密度脂蛋白( h d l c ) 含 量均显著增加( p o 0 5 ) ，表明营养肥胖模型构建成功。建模成功后，对章鱼胺高、 中、低3 个剂量组分别以6 0 、3 0 、15 m g k g d 剂量的章鱼胺灌胃，阳性药对照组给予 8 m g k g d 的祛脂瘦身胶囊，模型对照组及正常对照组给以等体积溶媒。灌胃4 周后， 本试验发现，章鱼胺各剂量组及阳性对照组中小鼠体重、脂肪湿重、脂肪系数、 血清总胆固醇( t c ) 与模型组存在显著性差异( p 0 0 5 ) ，其中l e e s 指数和甘油 三酯( t g ) 的中、高剂量组与模型组存在显著性差异( p 0 0 5 ) 。结论：章鱼胺 对营养性肥胖小鼠有一定的减肥降脂作用。 关键词：高效液相色谱法，章鱼胺，人血清，减肥功能，营养性肥胖小鼠 上海海洋大学硕士学位论文 。一一一，_ _ 一 a n a l y s i so fo c t o p a m i n ei nh u m a n s e r u mb yh p l ca n d d e v e l o p m e n to fn a t u r a lo e t o p a m i n es u p p l e m e n t a t i o n a b s t r a c t o c t o p a m i n ei sa ni m p o r t a n tb i o g e n i ca m i n e ，a se n d o g e n o u sn e u r o t r a n s m i t t e r sa n d p 3 a d r e n e r g i cr e c e p t o ra g o n i s t ，i tp l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei n t h ee n e r g yb a l a n c ea n d r e g u l a t i o no fe n e r g ym e t a b o l i s m ，b u ti t sb i o l o g i c a ls i g n i f i c a n c ea n dp h y s i o l o g i c a lr o l e h a sn o ty e tb e e nf u l l ya c k n o w l e d g e d c y t o c h r o m ep 4 5 0m o n o o x y g e n a s e i st h e r a t e - l i m i t i n ge n z y m e o fo c t o p a m i n eb i o s y n t h e s i si nv a r i o u so r g a n so ft h eb o d y e s p e c i a l l yi nl i v e r , t h ee f f e c to f t h ed i a b e t e sa n dl i v e ri l l n e s so na c t i v i t yo fc y t o c h r o m e p 4 5 0m o n o o x y g e n a s eh a sb e e nd i s c u s s e d o c t o p a m i n ei nt h eh u m a nb o a yc a nb e d e g r a d e db ym o n o a m i n eo x i d a s e ，a n dt h em o n o a m i n eo x i d a s ea c t i v i t yi s v e r yh i g h w h i c hm a yr e l a t et ot h em e n t a ld i s o r d e r sd e p r e s s i o n t h u s ，t h ec o n t e n to fo c t o p a m i n em h u m a ns e r u mm a yb eu s e da sab l o o dc l i n i c a lb i o c h e m i s t r yp r o j e c t s ，a n di th a sag o o d p o t e n t i a lv a l u ei nt h ep a t h o l o g ya n dp h a r m a c o l o g ys t u d y t h i ss t u d yc o n t a i n st w op a r t s t h ef i r s tp a r ti sa b o u te s t a b l i s h i n gah p l cm e t h o d f o rm ed e t e r m i n a t i o no fo c t o p a m i n ei nh u m a ns e r b i n w ep r o v i d ea r e l i a b l ea n a l y t i c a l m e t h o dw h i c hc a nd e t e r m i n et h eo c t o p a m i n ec o n t e n ta c c u r a t e l ya n dr a p i d l y t 1 1 es e c o n d p a r ti sa b o u tt h ee x p l o i t a t i o no f n a t u r a lo c t o p a m i n e se x t e n d e r , w es t u d yo nt h ee f f e c to f o c t o p a m i n e o nt h ea n t i o b e s i t yi nn u t r i t i v eo b e s i t ym i c e f i r s to fa l l ，t h es t u d ye s t a b l i s h e dah p l cm e t h o df o r t h ed e t e r m i n a t i o no f a d r e n o c e p t o ra g o n i s to c t o p a m i n ei nh u m a ns e r u m a c c o r d i n gt od e s c r i p t i o n so f m o s t d o c u m e n t s ，t h ed e r i v a t i z a t i o nr e a g e n ts o l u t i o nw a su s e dt o d e t e r m i n eo c t o p a m m em b i o l o g i c a ls a m p l e s ，t h o u g h ，t h i sm e t h o dw a sc u m b e r s o m e a n dc o s t l y i nt h i se x p e r i m e n t ， w ew i l lb u i l daf a s th p l cm e t h o dw h i c hd on o tn e e dt od e r i v e d ，t h eh u m a ns e r u m w a s d i l u t e df i v et i m e sw i t ht h em o b i l ep h a s e ，ap h e n o m e n e sl u n ac l sc o l u m nw a su s e d 1 1 1 e m o b i l ep h a s ew a sc o n s i s t e do f0 0 2i x g m l l c i t r i ca c i da n d0 0 2 鹏。m l qs o d i u m d i h y d r o g e np h o s p h a t e ( 7 ：3 ，v v ) ，t h e f l o w r a t ew a s0 8m l m i n 1 ，t h ec o l u m n t e m p e r a t u r ew a s4 0 c ，一a n d - t h ed e t e c t i o nw a v e l e n g t hw a s 2 2 01 1 m r e s u l t s ：t h es t a n d a r d 1 1 1 上海海洋大学硕十学位论文 c a l v eo fo c t o p a m i n ew a sl i n e a rw i t h i nar a n g eo f0 0 0 6 5 0l - t g m l ，a n dt h e c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tw a so 9 9 9 9 t h ea v e r a g er e c o v e r yo fs p i k e ds a m p l ew a s1 0 5 6 ( r s d = o 9 3 ) t h ed e t e c t i o nl i m i tw a s6 0n g m l c o n c l u s i o n ：t h i sm e t h o di s c o n v e n i e n t ，r a p i da n dr e l i a b l e i tc o u l db eu s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fo c t o p a m i n ei n h u m a ns e r u m t op r o v et h er e l i a b i l i t yo ft h ea b o v em e t h o d ，w eu s e dap r e c o l u m nd e r i v a t i z a t i o n h p l cm e t h o df o rc o m p a r i s o n i nt h i ss t u d y ，w ee s t a b l i s h e dam e t h o df o rd e t e r m i n i n g o c t o p a m i n ei ns e r u mb yu s i n gr e v e r s e dp h a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( r p - h p l c ) t h eo c t o p a m i n ew e r ef i r s te x t r a c t e df r o mh u m a ns e r u mb yp e r c h l o r i ca c i d s o l u t i o na n dd e r i v a t i z e db yd a n s y lc h l o r i d e a no d sc o l u m nw a ss e l e c t e da ss e p a r a t i o n c o l u m na t4 0 。c u vd e t e c t o ri su s e dt od e t e r m i n et h eb i o g e n i ca m i n ea t2 5 4n l t l w a v e l e n g t h , t h em o b i l ep h a s es o l u t i o n sw e r ec o n s i s t e do fa ，o 1m o l la m m o n i u m a c e t a t ea n db ，a c e t o n i t r i l e ag r a d i e n te l u t i o nw a sc a r r i e do u tw i t haf l o wr a t ea t1 0 m l m 1 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed e t e c t i o nl i m i tf o ro c t o p a m i n er a n g e dw a s6 0 n g m l a l lt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t sw e r ea b o v eo 9 9 9 t h ea v e r a g ea n a l y t i c a l r e c o v e r yi ns e r u mw a sf r o m9 2 o t o110 o m o r e o v e r , t h es e r u mc o n c e n t r a t i o n so f o c t o p a m i n ei nh e a l t h ya d u l tw e r e4 8 74 - 1 7 0 岭。m l 一，c o m p a r e d t ot h ea b o v e o c t o p a m i n ec o n t e n t4 5 04 - 1 10l x g m l i na d u l ts e r u m ，t h e yw e r ea l m o s ta n a s t o m o s i s t h em e t h o di ss e n s i t i v ea n dr e l i a b l e ，a n ds u i t a b l ef o rs i m u l t a n e o u sa n a l y s i so fm u l t i p l e b i o g e n i ca m i n e si nt h ec l i n i c a ld i a g n o s i sa n dd r u gd i s c o v e r y s e c o n d l y , i nt h ee x p l o i t a t i o n o fn a t u r a l o c t o p a m i n e s e x t e n d e rp a r t , f i r s t l y , i n v e s t i g a t i o no fo c t o p a m i n ec o n t e n ti ne d i b l ep a r to ff i s h e r yp r o d u c ti nt h i ss t u d y , t h e c o n t e n to fo c t o p a m i n e ，ak i n do fp 3 a d r e n e r g i cr e c e p t o ra g o n i s t si ne d i b l ep a r to f v a r i o u s 舭s hw a t e ra n ds e a w a t e ra q u a t i cp r o d u c tw a sd e t e r m i n e d ，t op r o v i d ed a t af o r e x p l o i t a t i o na n du t i l i z a t i o no fo c t o p a m i n ei na q u a t i cp r o d u c t s a f t e rh o m o g e n a t ea n d u l t r a s o u n dt r e a t m e n t ，e d i b l ep a r t so ff i s h , s h e l l f i s ha n dc e p h a l o p o d i u mw e r e c e n t d f u g a l i z a t e d ，t h e no c t o p a m i n ec o n t e n ti ns u p e m a t a n tl i q u i dw a sd e t e c t e dw i t h h p l c t h er e s u l t ss h o w e dt h a ti ne i g h tk i n d so ff r e s hw a t e rf i s ；ht h eo c t o p a m i n e c o n t e n t so fd o r s a lm e a ta r eg e n e r a l l yh i g h e rt h a na b d o m i n a lm e a _ t ，w h i c ha r ei nt h e r a n g eo f3 0 - 13 0 i t g 9 1a n dr o u g h l ys i m i l a rt os e a w a t e rf i s ha n df r e s h w a t e rs h e l l f i s h t h e o c t o p a m i n ec o n t e n t so fs e a w a t e rs h e l l f i s ha r ep a r t i c u l a r l yh i g h ，a l m o s td o z e n se v e n t h o u s a n d st i m e so ft h a ti nf i s ha n df r e s h w a t e rs h e l l f i s h c e p h a l o p o d i u ma l s oh a sah i g h c o n t e n to fo c t o p a m i n ew h i l ei ti sn o td e t e c t e di no c e a na l g a e s e a w a t e rm o l l u s k sa r et h e m o s ta f f l u e n tr e s o u r c eo f o c t o p a m i n e i n a q u a t i cp r o d u c t sa n di d e a lf o o d o f w e i g h t 。w a t c h e r sa n dd i a b e t i c s s e c o n d l y , w es t u d yo i le f f e c to fo c t o p a m i n eo n 也e a n t i 。o b e s i t yi nn u t r i t i v eo b e s i t ym i c e t h ea l i m e n t a r yo b e s i t ym o d e lw a se s t a b l i s h e db v h y p e ra l i m e n t a t i o n t h ew e i g h t ，l e e si n d e x ，t h ew e tw e i g h to ff a t ，f a t t yc o e f f i c i e m ( f c ) ，t o t a ls e r u mc h o l e s t e r i n ( t c ) ，t r i g l y c e r i d e ( t g ) a n dh i g hd e n s i t yl i p o p r o t e i n ( h d l - c ) w e r es e l e c t e dt oo b s e r v et h ea n t i o b e s i t ye f f e c to fo c t o p a r n i n e f o u fw e e k s l a t e r , t h ew e i g h t ，l e e si n d e x ，t h ew e tw e i g h t & f a t ，f a t t y c o e f f i c i e n t ( f c ) ，t h ec o n t e r l to f t o t a ls a u mc h o l e s t e r i n ( t c ) ，t r i g l y c e r i d e ( t g ) a n dh i g h d e n s i t yl i p o p r o t e i n ( h d l c ) i n n u t r i t i v ef e e d i n gi n c r e a s e da p p a r e n t l yc o m p a r e dt o t h en o r m a lf e e d i n g ( p 0 0 5 ) ，i t i n d i c a t e dt h a tt h en u t r i t i v eo b e s i t ym o d e lw a ss e tu ps u c c e s s f u l l y t h ew e i g h t w e t w e i g h to ff a t , f ca n dt h ec o n t e n to ft ci nt h eo c t o p a m i n ef e e d i n go f o b e s i t yn l o d e l w e r er e d u c e da p p a r e n t l yc o m p a r e dt o t h en o r m a lf e e d i n g ( p o 0 5 ) ；t h ec o n t e n to f h d l _ ca n dl e e si n d e xi nt h em e d i u ma n dh i g hd o s a g eo fo c t o p a m i n ef e e d i n go f o b e s i t ym o d e lw e r er e d u c e da p p a r e n t l yc o m p a r e dw i t ht h en o r m a lf e e d i n g ( p 0 0 5 ) ： c o n c l u s i o n ：o c t o p a m i n eh a df u n c t i o n a le f f e c t so nr e d u c i n go b e s i t ya n db l o o dl i p i d so f t h em i c e k e y w o r d s ：h p l c ，o c t o p a m i n e ，h u m a ns e r u m ，r e d u c i n go b e s i t y , n u t r i t i v eo b e s i t y m i c e v 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：加畅多 日期：知f 拜；月r 日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 口 ，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于。 不保密q 蓄翥譬筹篙留耖吾匆日期：w d 年；月f 日耄嚣篓c 孵忆 日期：乒爿p 年5 月f 日。 上海海洋人学硕士学位论文 引言 章鱼胺( o c t o p a m i n e ，o a ) ，又名章鱼涎胺或真硝胺，化学名为：1 ( 4 羟基苯 基) 一2 一氨基乙醇，章鱼胺首先被发现存在于软体动物章鱼的唾液腺中，故称为章 鱼胺，图1 为章鱼胺分子结构： 0 ，hi i h n 疋产一扎h 图1 章鱼胺分子结构 f i g 1m o l e c u l es t r u c t u r eo fo c t o p a m i n e 章鱼胺生理学意义的研究首先开展在脊椎动物和节肢动物体内。在脊椎动物 神经系统中，被认为是“痕量生物胺”或是“虚假的”神经递质。虽然有迹象表 明章鱼胺是调节去甲肾上腺素突触传导的神经递质，但是至今在哺乳动物的中央 神经系统中没有发现特异性的章鱼胺受体。在无脊椎动物如节肢动物体内广泛、 大量地存在章鱼胺瞳1 ，其主要功能为：( 1 ) 神经递质，可控制内分泌或光器官；( 2 ) 神经激素，可诱导脂类和碳水化合物的移动；( 3 ) 神经修饰物质，可影响运动类 型、栖息甚至记亿，还可作用于各种肌肉、脂肪体和感觉器官的末梢口1 。 作为内源性的神经介质与1 33 2 肾上腺素能受体激动剂，章鱼胺在能量的平衡与 能量代谢的调节上有重要的作用h 吲，但其生物学意义与生理学作用尚未被充分认 识。人体各种器官特别是肝脏中的细胞色素p 4 5 0 酶系单加氧酶是体内生物合成章 鱼胺的限速酶，有关糖尿病、肝病对细胞色素p 4 5 0 酶系单加氧酶活性的影响已有 详尽讨论口棚。章鱼胺在人体内也可以因单胺氧化酶作用而被降解，而单胺氧化酶 活性过强与抑郁症等精神疾患有关。因此，人血清章鱼胺含量有可能作为一项血 液临床生化检验项目，在病理学和药理学的研究中有潜在的价值。生物样品中章 鱼胺含量的测定方法已经有很多种，包括放射酶学测定法、毛细管气相色谱一负化 学电离质谱法旧1 、柱前衍生r p h p l c 方法阻们、光纤l e d 诱导荧光毛细管电泳检测 法n 1 1 ，虽然放射酶学测定法在过去经常用来测定生物样本中章鱼胺含量，但是实 验操作过于复杂而且不稳定。而柱前衍生r p h p l c 方法则实验操作也复杂且衍生 1 上海海洋大学硕士学位论文 试剂昂贵。在本研究中，我们想建立一种快速有效的不需衍生物处理的人血清中 章鱼胺h p l c 分析方法。样品用量少，可直接上机测定，要求具有良好的专一性， 精密度和回收率，测定结果稳定，具有微量、简便、快捷、灵敏等特点，能符合 测定的要求，且能准确人血清中章鱼胺的含量，为与章鱼胺相关的病理学和药理 学研究提供了有效手段。 章鱼胺是一种重要的生物胺，近年来研究发现它是一种天然的p 3 肾上腺素能 受体激动剂，在肥胖症的治疗和i 工型糖尿病的防治上有潜在的价值n 2 13 j 。1 3 一肾上 腺素能受体是细胞膜内外与肾上腺素结合的一种受体，而t 3 一肾上腺素能受体激动 剂( 1 3 - a d r e n o c e p t o ra g o n i s t s ) 往往引起人体内各种器官和组织的不同反应，有重要 的生理作用n 4 “5 | 。虽然p 3 一肾上腺素能受体直至t 1 9 8 9 年才被克隆，但已被关注了多 年。人体的b3 一肾上腺素能受体在白色脂肪组织，棕色脂肪组织以及人的骨骼肌 的表达同样有效，并且在能量平衡和体内葡萄糖平衡的调节上起作用，一些研究 指出。一些研究指出，b3 一肾上腺素能受体激动剂在肥胖症的治疗和i i 型糖尿病 的治疗上有潜在的价值。最引人注目的是1 33 一肾上腺素能受体激动剂对胰岛素的 致敏作用，它能促进脂肪氧化从而迅速降低细胞内代谢产物的浓度，如脂肪酰基 c o a 和二酰基甘油口朝，由此调节了胰岛素信息，是临床应用研究的关注点。 传统的中药枳实的提取物，在欧美普遍用作减肥产品原料。其功效成分之一 即为章鱼胺( o 0 1 o 1 ) n 引。在美国，含章鱼胺的减肥产品已在市场销售。随 着人民生活水平的不断提高，现代化膳食结构发生改变和体力活动的日渐减少， 超重和肥胖已经成为一个世界范围内引起普遍关注的问题，肥胖与多种疾病的发 生及死亡密切相关，如糖尿病、心血管疾病、中风、高血压等，并且是导致某些 癌症的危险因素。所以，肥胖症被认为是一个导致早死、致残、影响生命质量和 增加全社会财政负担的重要公共卫生问题n7 1 。就我国而言，成年人中超重人群也 在不断扩大。以2 0 世纪9 0 年代与8 0 年代比，超重者的比例己增加了近一倍，达 到了2 0 - 3 0 ，大城市则己达到了3 5 - 4 0 。目前肥胖病人日益增加，其重要 原因是热能摄入过多和饮食结构不合理。肥胖病人热能、脂肪和碳水化合物摄入 量过高，且三大营养素比例失调n 8 1 。 由于肥胖给人们带来诸多的危害，很多人为了减肥吃各种各样的减肥药，而 市面上出现的各种减肥药都有一定的不良反应n 9 1 。可见，开发一种效果显著且无 副作用的天然减肥、降脂功能性食品具有重要的现实意义。章鱼胺作为重要的生 物胺在生物体内起了神经介质的作用，近年的研究发现它是一种天然的d 3 肾上腺 素能受体激动剂，也是目前唯一商品化的1 3 3 a r a ，在肥胖症的治疗和i i 型糖尿 病的防治上有重要的作用。在市面上大肆宣传的减肥药品或者药用植物很多都添 2 上海海洋大学硕七学位论文 加了章鱼胺，有研究发现，在体外试验中章鱼胺可以通过p3 受体激动剂加强小 鼠脂肪细胞的脂解作用，同时它也能通过胺氧化酶的氧化作用促进人脂肪细胞的 葡萄糖吸收n 朝。为此，本研究以小鼠为试验动物，对章鱼胺的减肥降血脂作用进 行了研究，以期为章鱼胺的开发和利用提供理论依据。 本论文所要解决的主要问题有： l 、章鱼胺在血清中含量低，且人血清中成分复杂，h p l c 检测中章鱼胺峰容 易受到其它峰干扰，是否能通过样品前处理或者色谱条件的改变有效地测出人血 清中章鱼胺。 2 、在淡水和海水中是否能找到章鱼胺含量高的水产品，为章鱼胺的开发利用 提供依据。 3 、章鱼胺对小鼠是否具有减肥降血脂作用。 3 上海海洋大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 食品中生物胺的检测方法 1 1 1 高效液相色谱( h p l c ) 高效液相色谱是化学和药物分析实验室中不可缺少的高效、快速、灵敏的分 析分离手段。与经典的液相色谱比较，它具有分离效能高，分析速度快，检测灵 敏度高和应用范围广的特点。在药物分析和体液药物测定中占有重要地位。h p l e 法也是目前食品中生物胺含量分析测定的主要手段，包括反相高效液相色谱法和 离子色谱法。 1 1 1 1 反相高效液相色谱( r p h p l c ) 反相高效液相色谱法是目前应用最广的高效液相色谱法，几乎可以分离所有 的有机化合物，被多数研究者选择用于对水产品中的生物胺进行分离和定量分析。 许多食品中的生物胺在可见和紫外区域既没有满意的吸收，又没有荧光成分，所 以在采用h p l c 测定时，一般需要对生物胺进行衍生处理。衍生分为柱前衍生和柱 后衍生，国内外检测方法以柱前衍生居多，衍生剂主要是丹酰氯、苯甲酰氯邻苯 二甲醛( o p a ) 等，特点是快速、简便、稳定、能同时处理大批样品；柱后衍生 剂主要是荧光胺，虽然灵敏度比柱前衍生高，但产物不稳定、分解快，所以大多 数研究者都会采用柱前衍生。h uyj 等啪1 采用o p a 柱前衍生、荧光检测的r p h p l c 方法分析测定了3 种不同发酵的银鲤鱼香肠的7 种生物胺含量。a n d e r s o nak 堙妇 通过r p h p l c 方法检测了科威特市场上的3 种典型鱼的非挥发性生物胺，研究采用 了苯甲酰氯衍生剂和二极管阵列检测器，于2 0 m i n 内有效分离了组胺、腐胺、尸胺 和三甲胺等4 种生物胺。m a hjh 等瞳2 1 则报道了一种丹磺酰氯柱前衍生r p n v l c 澳4 定韩国腌制发酵鱼制品中生物胺的方法。 1 1 1 2 离子色谱( i c ) 离子色谱是分析离子的一种液相色谱方法，主要利用离子之间对离子交换树 脂亲和力差异而进行物质分离，可同时测定多种离子，检测限为每升微克至每升 毫克级，具有简便、快速的优点。生物胺是最弱的阳离子，适于离子色谱法测定。 4 上海海洋大学硕士学位论文 由于不需要衍生过程，与r p h p l c 法相比，缩短了分析时间，减少了衍生化带来 的干扰和衍生物不稳定等问题，提高了分析方法的稳定性和重现性。c i n q ui n aa l 等3 采用低疏水性和中等强度的弱离子交换聚合色谱相为分离柱填料，以电导检 测器测定了金枪鱼中4 种主要的生物胺( 组胺、腐胺、尸胺、亚精胺) ，该方法使 得原料处理简化，且整个检测分析过程简单、快速、重现性好，同时指出，电导 检测器无论是在样品处理还是在峰形上均优于脉冲安培检测和全脉冲安培检测 法。d r ai s c ir 等口4 3 利用一种改进的离子交换色谱法测定了包括沙丁鱼等的多种 食品中的5 种生物胺( 尸胺、腐胺、组胺、酪胺和亚精胺) 和2 种生物胺前体氨基 酸( 组氨酸、酪氨酸) ；采用的全脉冲安培检测器大大简化了样品前处理过程， 3 0 m i n 内使5 种生物胺和2 种前体氨基酸的基线分离并使得检测限降低为1 1 2 5 n g - - 2 1 5 0 n g 。 1 1 2 毛细管电泳( c e ) 与传统的电泳技术和现代色谱技术相比，毛细管电泳具有灵敏度高、分离速 度快、仪器简单、成本低、无环境污染等优点。由于多价生物胺( 如腐胺、精胺、 亚精胺等) 比单价生物胺更难于完全衍生化。目前在毛细管电泳分离生物胺的技 术中，仅有毛细管区带电泳技术可直接对生物胺进行分析测定而不需要衍生化过 程，但缺点是中性物质由于表面电荷密度无差异，因此无法分离。1 9 8 4 年首次出 现的胶束电动力学毛细管电泳，扩展了毛细管电泳的应用范围，在分离离子化合 物的同时进行中性物质的分离。l a n g ej 等瞳朝比较了毛细管区带电泳法和高效液 相色谱法对鲑鱼、鲱鱼、鳕鱼等多种食品中生物胺的测定结果，研究发现毛细管 区带电泳可以大大缩短样品前处理和分离时间，且可同时检测组胺和酪胺，但无 法分离尸胺、腐胺等。干宁啪3 等采用苯甲酰氯衍生剂和u v 检测器，建立了一种用 胶束电动力学毛细管电泳技术，可同时检测鱼肉中组胺、腐胺、2 苯乙基胺、尸胺、 色胺、亚精胺及精胺，且各种生物胺含量与其峰面积在定范围内存在着良好的 线性关系，除组胺外检出限均为5 i - t g g 。 1 1 3 薄层色谱( t l c ) 薄层色谱是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法，兼备了柱色 谱和纸色谱的优点。与其他分析方法相比，t l c 法无需昂贵的分析仪器、费用低、 操作简便、快捷，对食品中生物胺的定性与半定量测定，可有效降低监控成本。 s h a k i l arj 等嘲采用t l c 法和h p l c 法测定鱼、鱼肉制品中的生物胺，研究发现， 5 上海海洋大学硕士学位论文 与h p l c 法测定结果相比较，t l c 法线性关系和重现性较差，分别为2 0 n g 3 0 0 1 1 9 和 低于8 ，但测定快速、价格低廉，且适合同时快速检测几种样品中的生物胺。 s h a l a b yar 2 8 1 报道了一种可同时分离测定食品( 包括水产品) 中组胺、尸胺、 腐胺、苯乙胺、酪胺、色胺、精胺、亚精胺等生物胺的半定量薄层色谱法，衍生 剂为丹磺酞氯；该方法可在2 h 内同时测定1 4 个样品，尸胺、腐胺、组胺、亚精胺、 酪胺的检出限为5 n g ；色胺、精胺、苯乙胺的检出限为1 0 n g 。l a p a g um a r a e s j 等嘲1 以丹磺酰氯为衍生剂，用t l c 方法比较了不同溶剂对鳕鱼和鱿鱼体内9 种生物 胺( 腓精胺、腐胺、色胺、尸胺、亚精胺、组胺、精胺、酪胺、b 2 苯乙胺) 的分 离效果，通过氯仿：三乙胺( 6 ：1 ) 和氯仿：二乙醚：三乙胺( 6 ：4 ：1 ) 的二次 展开分离后，于荧光波长3 3 0 n m 处对色谱板进行定量计算，该测定方法具有线性良 好，精确有效且使用的溶剂毒性较低等特点。 1 1 4 电化学生物传感器( e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r ) 生物传感器是利用酶、组织、抗原、抗体等生物活性物质作为传感器的探针 ( 电极) ，与样品中的待测物质发生特异性反应，通过适当的换能器将这些反应 转换成可以输出检测的信号( 如电压、频率等) ，通过分析信号对被测物进行定 性和定量。在生物胺分析方法中，主要研究的是电化学生物传感器。其原理是： 生物胺在单胺氧化酶( m o n a m i n eo x i d a s