（物理化学专业论文）光刻法及激光诱导法制作细胞微图案.pdf

摘要 摘要 细胞微图型化技术是一个多学科高度交叉的领域，它在许多方面有着重要的 潜在应用：第一，可应用于大规模的药物发现与筛选；第二，是细胞传感器上用 于固定细胞的一个重要手段；第三，是组织工程学的研究基础；第四，为分子细 胞基础生物学的研究提供另外一种方法。构建细胞微图案也是我课题组进行细胞 相关研究的基础。 目前已经发展了许多种细胞微图案的制作方法。主要有光刻法、软光刻法( 包 括微印章技术及微流体技术) 、“墨水”喷印技术、模板辅助图案技术、激光诱导 直写技术、电化学图案化技术等。这些方法各有各的优缺点，但它们的制作均较 为复杂，操作较为困难。 本论文主要是运用光刻法及二氧化碳激光诱导法制作细胞微图案，主要的研 究内容及获得的结果如下： 1 建立了以光刻法为基础的细胞微图案技术，得到了蛋白质微阵列及初步 的细胞差异化图案。 2 利用四氢铝锂对p m m a 表面进行化学活化，活化后的表面可以进一步 修饰各种分子基团，从而提高p m m a 表面的可修饰性及细胞可贴附性。 并用h e l a 细胞进行了验证。 3 利用具有强氧化性的溴水诱导牛血清白蛋白变性，验证了牛血清白蛋白 可抑制动物细胞的非特异性粘附，而牛血清白蛋白变性后的表面则可进 行细胞粘附。 4 提出并建立了以二氧化碳激光诱导蛋白质变性为基础制作细胞微图案 技术。利用二氧化碳激光诱导自组装在基底上的牛血清白蛋白变性，得 到了变性月 变性的牛血清白蛋白微图案，进一步接种上h e l a 细胞后可 得到细胞微图案。此法可以实现快速简便地制作复杂的细胞微图案。若 使用较小激光光斑诱导b s a 变性，理论上可以得到单细胞微图案。 关键词：细胞微图案；牛血清白蛋白；c 0 2 激光诱导 a b s t r a c * t a b s t r a c t c e l lm i c r o p a t t e r n i n gi sa ni n t e r d i s c i p l i n a r yt e c h n o l o g ya n dh a sg r e a tp o t e n t i a l a p p l i c a t i o n s o nm a n yf i e l d s f i r s t ，i ti sav a l u a b l ea p p r o a c ht o w a r d sf u n d a m e n t a l c e l l b i o l o g ys t u d i e s s e c o n d ，i tc a nb ea p p l i e dt ot h ec e l l b a s e dd r u gd i s c o v e r ya n d s e l e c t i o no nl a r g es c a l e t h i r d ，i ti sa ni m p o f t a n tt o o lf o ro r g a n i z i n gc e l l s o n t r a n s d u c e r sf o rc e l l b a s e ds e n s i n g t h el a s to n e ，t h ea b i l i t yt op r o d u c ep a t t e r n so fc e l l s t h r o u g hp r e c i s es u r f a c ee n g i n e e r i n gi st h eb a s i co ft i s s u ee n g i n e e r i n g a l s o ，i ti st h e b a s i ct oo u rg r o u pf o rf l l r t h e rr e l a t i v er e s e a r c ho nc e l l s a tp r e s e n t ，t h e r ea r em a n ym e t h o d st of a b r i c a t ec e l lm i c r o p a t t e m s u c ha s p h o t o l i t h o g r a p h y , s o f t l i t h o g r a p h y ( g c p a n d p f l p ) ，i n k - j e tt e c h n o l o g y , s t e n c i l a s s i s t e dp a t t e r n i n g ，l a s e r g u i d e dw r i t i n gw i t hc e l l s ，e l e c t r o d e a s s i s t e dp a t t e m i n ga n d s oo n e a c ho ft h et e c h n i q u e sh a si t so w ns p e c i f i ca d v a n t a g e sa n dl i m i t a t i o n s t h e m a i np u r p o s eo ft h i st h e s i si st od e v e l o pan e wm e t h o dt of a b r i c a t ec e l lm i c r o p a t t e m e a s i l ya n dq u i c k l y t h em a i nw o r ka n dr e s u l t sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w ： 1 f a b r i c a t e dp r o t e i na n dc e l lm i c r o p a t t e mb yp h o t o l i t h o g r a p h y 2 m o d i f i e dp m m as u r f a c ew i t hl i a l h 4 ，t h e nt h es u r f a c ec a l lg r a f to t h e r m o l e c u l e s t h ep r o c e s si m p r o v e st h em o d i f i c a t i o na b i l i t ya n dc e l ta d h e s i o n o fp m m a ，w h i c hi sp r o v e db yh e l ac e l l sa d h e s i o n 3 d e n a t u r et h eb s ab ys t r o n go x i d i z e r - - b r o m i cw a t e r i tp r o v e dt h a tn a t u r e b s ac a np r e v e n tn o n - s p e c i f i ca b s o r p t i o no fc e l l s ，b u td e n a t u r eo n ec a n t 4 p r o p o s e dan e w m e t h o dt of a b r i c a t ec e l lm i c r o - p a t t e r n sb yc 0 2l a s e ri n d u c e d b s ad e n a t u r i z e d t h eb s am o d i f i e do ns u r f a c ew a sd e n a t u r e db yc 0 21 a s e r b e a ms e l e c t i v e l y , a n dt h e nw ec a ng e tn a t u r e d e n a t u r eb s am i c r o p a t t e r n s a n dg e tc e l lm i c r o p a t t e ma f t e rc e l l sa d h e s i o no nt h es u r f a c e2 5h o u r s w e c a 7 g e tc o m p l e xc e l lm i c r o p a t t e r nq u i c k l ya n de a s i l ya n ds i n g l ec e l lp a t t e r n i nt h e o r e t i ci ft h eb s aw a si n d u c e db ye x c i m e rl a s e r k e yw o r d s ：c e l lm i c r o p a t t e r n ；b s a ；c 0 2l a s e r t i 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权 利和责任。 声明人( 签名) ：r 、召格 立占年易月移日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大 学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电 子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学 校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适 用本规定。 本学位论文属于 1 、保密( ) ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( o ( 请在以上相应括号内打“”) 作者签名：幽、召才告日期：2 锌。月泷 导师签名：吉旁耸弘日期：九刮缉6 月彩，日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 细胞微阵列生物芯片的背景及意义 微阵列生物芯片是2 0 世纪9 0 年代生命科学领域中迅速发展起来的一项新技 术。其本质是通过平面微加工技术或是超分子自组装技术，把大量具有生物识别 功能的分子探针有序点阵排列集成到一个微小的固相载体表面上，可以同时实现 对蛋白质、核酸、细胞等的高通量、快速、低成本、高平行化的检测和分析。 细胞微阵列生物芯片( 细胞微图案化) ，也就是将所研究的细胞规约在限定 的空间位置上，它在许多方面有着重要的潜在应用。目前已有相关的应用报告： 第一，药物开发。利用细胞徽阵列可大大降低药物开发的成本，并且更为准 确地预示结果。细胞阵列介于基因、蛋白质与动物之间，被认为更适用于药物筛 选。b h a d r i r a j u 的综述【1 介绍了如何用细胞微阵列来提高药物开发及测试效率。 美国匹兹堡c e l l o m i c s 公司将生物标志物与细胞阵列技术结合，以高信息量筛选 技术( h i 曲c o n t e n ts c r e e n i n g ) 应用于大规模的药物发现与筛选，将先导化合物优 化周期所需时间缩短了一半，并对药物开发决策产生重要影响。z i a u d d i n 等【2 j 利 用确定位点上打印形成的d n a 去转染各个位置上导入的细胞，形成可表达确定 c d n a s 的细胞微阵列，为细胞基因组( c e l l u l a rg e n o m i c s ) 3 l 与蛋白质组的结合提供 了很好的预示。 第二，细胞传感器【4 ) 。细胞的微阵列化技术是细胞传感器上用于固定细胞的 一个重要手段。 第三，组织工程学。干细胞生长成不同的细胞系很大程度上取决于细胞的形 状，暗示着通过控制细胞生长微环境的表面工程有可能是研究功能化细胞的一种 手段，更有可能对用于细胞组织工程的基底设计非常关键。同时，在体组织中的 细胞实际上也以有序的方式排列着，从细胞共培养技术的发展来看，未来的工程 化组织制造的一种模式，很可能是先造就细胞微阵列的图式，作为进一步立体化 组织构造的基础。 第四，细胞基础生物学。在分子细胞基础生物学研究中，实现细胞在基底表 面上粘附与铺展的规约或控制的技术，可能是细胞与基底、细胞与细胞相互作用 厦门大学理学硕士论文 研究获得深入认识的关键，它提供了全新的方法来深入研究细胞粘附于材料表 面，细胞的繁殖、扩散及分子信号通道的各种影响因素。由于细胞的“活”的特 性，大部分组织细胞在表面上的粘附与铺展特征，实质上是生化途径及其网络特 性与生物物理特性呈现的结合体。微阵列技术体现在细胞水平上的一个发展趋 向，就是使细胞在适宜基底表面上呈现特定排列以及功能，此即所谓细胞图型化 ( c e l lm i c r o p a t t e m i n g ) 技术。 1 - 2 细胞粘附 当细胞接近于另外的细胞或是个固体基质，在适宜的条件下，借助物理化 学化学作用力，它们之间可能发生粘附口“。细胞粘附在多细胞生物的发育与组 织修复过程中的形态建成和功能维持上起着非常重要的作用。细胞粘附在许多细 胞生理过程中发挥调节功能，如细胞生长、分化和运动、性细胞结合、免疫网络 的细胞激化等。根据粘附对象的不同，细胞粘附可分为两大类：细胞与非细胞表 面的粘附和细胞之间的粘附。粘附过程涉及非特异性的相互作用( 静电、水化和 立体空间等性质的相互作用) 或者特异性的相互作用( 锁与钥匙的分子互相作 用) 。细胞粘附能力强弱差别很大，它不仅取决于粘附细胞本身，还取决于被粘 附的细胞或基质，影响相互作用的因素包括细胞或基质的类型及它们的表面特 性、细胞的生理状况和环境条件( 如离子强度、p h 、蛋白质组成等) 。 细胞表面之间或细胞与固体表面之间的涉及物理上的作用力 7 , 8 , 9 】，例如静电 相互作用力( 如静电斥力、多价离子键) ，定向力( 范德华基森) 、诱导力( 范 德华一德拜) 以及最重要的色散力( 范德华一洛多思) 。上述各类非平衡的表面力 赋予表面以自由能。从根本上说，粘附过程中，表面自由能的降低提供了驱动细 胞间或细胞与基质之间相互作用的力。也就是说，如果系统的自由能( f ) 降低 有利于粘附过程的发生；反之，系统自由能升高，刻过程在热力学上就不可能进 行。自由能降低得愈多，粘附过程就愈可能发生。 如果不考虑细胞粘附中任何特殊的生物化学相互作用( 即把细胞当作可变形 的多聚体颗粒) 和忽略重力等系统外力，细胞粘附( 于固体表面) 过程中的表面 自由能变化a f o 可以由图1 1 的式中给出，式中yp s 和yp l 分别为细胞一固体基 质和细胞一液体介质之间的界面自由能，ys l 则为固体基质一液体介质的界面自由 ， 第一章绪论 蘸。这样，形成的细胞一固体基质界面自由能部分也破坏了细胞液体介质和固体 基质一液体介质的界面。自由能之差等于细胞粘附于表面过程中能够获得的最大 的功。当z s f 列“是负值时，从热力学讲，粘附过程就可能自发进行。在式中各界 面自由能实际上是与细胞、固体基质和液体介质的表面疏水性相关的。三者相互 影响，相互作用而决定粘附过程中系统的自由能变化。由此，不仅被吸附的表面 而且环境液体介质的表面张力都对细胞吸附产生重大甚至决定性影响。例如，当 液体介质表面自由能大于粘附细胞的表面时与细胞相互作用的表面的疏水性愈 强( 表面自由能减少) 就愈容易发生粘附。 f a d h = yp s _ yp l - - ys l s 图1 - 1 细胞粘附过程中的表面自由能变化 上述简化的粘附模型虽然一定程度上阐明了涉及表面粘附的自由能变化及 某些重要的热力学条件，但是由于细胞表面结构的复杂性，细胞的粘附涉及的作 用力不仅表面张力有关，而且涉及细胞与被吸附表面之间复杂的相互作用。 细胞与细胞及细胞与非细胞表面的粘附都有两种基本结构，即暂时粘附 ( t r a n s i e n ta d h e s i o n ) 和永久性细胞连接( p e r m a n e n tc e l li u n c t i o n s ) 。两种细胞表 面的粘附结构都有许多粘附分子和其他结构成分参与，有些分子参与两类粘附结 构。大多数细胞粘附和细胞连接结构主要由跨膜的粘附因子( 或连接蛋白) 、细 胞外配体、细胞内连系的细胞骨架和胞内一些小的连系蛋白4 部分组成。 细胞主要是通过其细胞表面粘附分子( c a m s ) 与其它细胞或固体基质粘着 的，不同的细胞表面粘附分子介导不同类型的细胞粘附。在体外细胞培养中，细 胞能够粘附和生长在玻璃或塑料基底表面，体内细胞赖以粘附的固体基质则是细 厦门太学理学硕士论文 胞外基质( e x t r a c e l l u l a rm a t r i x ，e c m ) 。e c m 对后生动物的绝大多数细胞的发 育和生理功能有着重要的调控作用。e c m 主要包括胶原、非胶原糖蛋白( 如纤 维连接蛋白【1 0 、层连接蛋白【1 l 】) 及带有多糖胺聚糖链的蛋白多糖等。 细胞间的粘附和细胞与固体基质问的粘附所涉及的粘附分子和它们的粘附 过程有许多差异，但是它们都涉及以下几个共同或相似的步骤。首先是在靠近与 接触过程中的识别，细胞间或细胞与固体基质的靠近可以是细胞无规则运动的结 果，也可能是化学趋向性的运动，当细胞靠近到一定的距离( 1 0 m n ) ，细胞与 被接触表面就有一个相互认识或认同的过程，也就是识别过程，实际上取决于两 者间产生的吸附力是否能克服静电的或空间位阻的排斥力，而达到系统自由能最 小。这种接触与识别往往是细胞的主动行为( 如形成微小的突起或伸出伪足) ， 有利于最初接触部位的互补性接触，达到低排斥力，高吸引力的效果。当相互认 同，即建立起最初的稳定性局部粘附，分散的点状局部粘附斑形成。随之，结合 区发生结构变化，接触区及至整个细胞铺展开( s p r e a d i n g ) 。这是一个由跨膜信 号传导介导的细胞骨架重组过程，是细胞粘附中最复杂和需要能量的过程，因此， 依赖于细胞的代谢状态。细胞的粘附是一个动态的过程，细胞粘附是粘附与去粘 附的动态变化过程。细胞的粘附是一个包括多个步骤的复杂动态过程，受到诸多 因素的影响，包括细胞与被粘附表面的特性( 疏水性、电荷状态、膜流动性) 、 细胞外介质环境( p h 、离子强度、流动状态) 、细胞生理和代谢状态以及细胞“群 体”间的“社会性”影响等。 1 3 目前细胞微阵列生物芯片的构建方法 迄今为止的细胞微图型化技术大多针对细胞生存的基底，对它的表面特性作 精细工程加工或修饰，以期达到对细胞粘附与铺展甚至细胞群构筑的精确操纵。 构筑细胞微图型化可以采取以下两种策略：( a ) 先构建使细胞优先粘附的微图型 化的粘附性薄膜模板，间接地促进细胞的选择性粘附：( b ) 提供一层可以在细胞 粘附后取走而不会使细胞受到损伤的微图型化物理阻隔层。实际设计中往往针对 不同细胞对象做出相应的表面拓扑形貌徽加工或是物理化学特性修饰。如果将细 胞的空间位置限定在一个平面上，那么上述这些策略实现的细胞微图型，无疑是 一种类型的细胞微阵y j ( c e l lm i c r o a r r a y ) 。对于表面微图型的加工，人们想到了各 第一章绪论 种各样的方法，主要就是根据这两种策略来实现细胞微图案。 1 - 3 1 光刻法( p h o t o l i t h o g r a p h y ) 对于微图案的加工技术，光刻法是人们首先考虑的。在光刻法里，通过紫外 光( u v ) 照射使掩模板的几何图案转移到基底上( 详见第二章) 。通常模板是用 包被有一层薄的不透光的铬石英玻璃制作的，并画有预设的几何图形。模板可以 用c a d 或由生产模板的公司制作。这样的铬，石英玻璃模板的最小尺寸可以达到 1 - 2 p r o 。当然较差的分辨率也是可以接受的，比如可以允许到1 0 i t m ，可以用商 用的喷墨打印机简便地制作出来。 1 - 3 2 软光刻法( s o f t - l i t h o g r a p h y ) 近年来，w h i t e s i d e s 小组率先发展了一类称之为“软刻法( s o f tl i t h o g r a p h y ) ” 的微加工技术，用于控制细胞与表面相互反应，其共同特征在于利用由p d m s ( 聚 二甲基硅氧烷) 加工成豹微结构表面来形成图型。其优点在于：( 1 ) p d m s 表 面上可以毫无损坏性地复制微加工主模上的图型，因而基本上减去了超净室的费 用；( 2 ) 由于p d m s 的化学惰性，生物图型化过程中所涉及材料不会损坏p d m s 表面。这些基本特点使它越来越多地成为生命科学领域实现微图型化所采用的方 法。它主要有两种相关的技术：一是微印章( m i c r o c o n t a c tp r i n t i n g ，i t c p ) ，一是微 流控阵列( m i c r o f l u i d i c sp a t t e m i n g ，i l f l p ) 。 1 - 3 - 2 - 1 微印章技术( m i c r o c o n t a c tp r i n t i n g ，岖p ) 在所有的软光刻技术中，微印章技术是应用最广的。最早应用于制作微电极 阵y o t l3 1 ，并迅速引用到用于制作细胞微阵列的基底【1 4 】。并产生大量的关于生物 的应用文章及介绍了许多有用的方法。这种技术的流行源于基底及微印章的材 厦门大学理学硕士论文 图1 - 2 微印章及微流体图案化技术示意图，两种方法均用相同的微印章制作方法。( a ) 液 状的预聚体浇注到模板i 上，处理后i i ，弹性印章i 便可以用了。( b ) 在微印章技术里， 印章沾上含有生物分子的溶液，通过印刷把分子转移到基底上i i i 。然后基底再填充另外一种 分子。( c ) 在微流体图案化技术里，首先使印章与基底紧密接触，然后将溶液引入沟道 中，粘附上想要的分子后去掉印章，最后填充上另外一种分子。( d ) 为染色的纤维素细胞 粘附在玻璃表面上，利用微印章技术在玻璃表面接上纤维素蛋白，并填充上p l l - g - p e g ， 图案的大小为1 0 9 0 , u r n 2 ，标尺为5 0 p m 。 料制作的简单、低廉及兼容性。微印章的制作过程如图1 1 所示：首先，把液态 的聚合物浇铸到具有微结构的模板( 如硅片) 上，形成弹性微印章。固化后，把 微印章从模版上剥离。然后用微印章沾上“墨水”，并将此“墨水”转移到基底 上。最后一步通常将末印上墨水的区域填充上另外一种分子。在下面的章节中每 一步骤会进行详细的介绍。 1 ) 模版的制作：技术的起始是加工一个三维的微结构模版，传统上是用光 刻法加工( 如1 2 - 1 节所介绍) ，虽然现在还有其它的方法如机械雕刻l l5 j 或是超 声微加工【1 6 】。将弹性聚合物浇铸于上面制作出相应的微印章。制作准确的微模版 是一关键的步骤，因为微印章材料限制了可复制的微结构【l ”。 6 第一章绪论 2 ) 微印章材料：最广泛应用的微印章材料是聚二甲基硅氧烷( p d m s ) ，当 然也有其它的硅烷被成功应用于制作微印章材料，如琼脂糖凝胶( a g a r o s eg e l s ) ， p o p s ( p o l y o l e f i n p l a s t o m e r s ，p o p s ) 。在大部分应用中，p d m s 首先用氧等离子 体处理来促进“墨水”在表面的吸附。微印章表面的活化提供了更多的可能性。 比如，b e m a r d 等把p d m s 表面硅烷化然后组装上抗体以特性吸附n g c a m 到表 面上。这些修饰过的微印章用来提取组织中的n g c a m 分子，然后印到干净的表 面上。 3 ) “墨水”的转印：墨水是指在印刷过程中从微印章表面转移到基底的分 子层。分子层可以进一步的功能化或是直接构建细胞微图案。虽然微印章沾上溶 液( 水或有机溶剂) ，但是印刷过程本身是在干的状态下进行的。 4 ) 间接细胞微图案：细胞已成功地在包被有金或是银的微图案上粘附，这 种微图案是利用微印刷技术控制硫醇自组装到表面上。在常规的方法里，疏水的 硫醇被印刷到金基底上形成疏水微图案18 , 伸1 。下一步，通过吸附末端为乙烯基 乙二醇的硫醇( e t h y l e n e g l y c o l t e r m i n a t e dt h i o l s ) ，使没有印刷的区域钝化( 抑制 蛋白质粘附) 。紧接着，疏水区域进行功能化修饰，修饰上纤维素蛋白( f i b r o n e c t i n ) ( 其它感兴趣的蛋白质也可以用) 。在这一过程中，钝化这一步可以将生物功能 化仅仅限制在印刷的区域内。在其它的应用中，p a t e l 等1 20 】在聚苯乙烯表面上构 建生物素可链接的聚丙酯聚乙二醇薄层，然后将抗生物素蛋白印刷到修饰的基底 上。抗生物素蛋白微图案可以用任何生物素可链接的蛋白功能化。生物素已成功 用于活化聚合物表面比如说羧酸衍生的聚合物【2 1 1 。为了保证图案中的所有分子功 能化，o l i v e a 等选择了另外一个途径。他们首先将蛋白质a 微印刷到玻璃基底 上，第二步再将微图案用嵌合体蛋白( c h i m e r i c p r o t e i n ) 功能化，并使a 连接到 i g g 的f c 片段上，然后再在其它区域修饰上多聚赖氨酸。接种上神经细胞后， 发现图案生长有神经轴突。l a h a n m 等用化学蒸气沉积法包裹活性多聚物，提供 了一种表面可修饰平台并可进一步构建细胞微图案【2 2 1 。 5 ) 直接微图案：这是一类直接用功能性分子( 促进细细胞粘附) 构建微图 案的方法。举个最简单的例子，具有长链的分子直接物理吸附于表面。在大部 分的情况下，不同细胞的细胞外基质( e x t r ac e l l u l a r m a t r i x ，e c m ) 蛋白或是用细 胞外基质结点构建的人造肽直接印章到表面上。在印章过程中，它需要蛋白的功 厦门大学理学硕士论文 能保持不变，文献p 驯阐述了大部分的长链蛋白或肽在印刷过程后能够保持生物活 性并用于生物实验。转印的细胞外基质蛋白必须匹配于所要实验的细胞，在最开 始的细胞转印报告中，b e r n a r d 等转印了各种不同的蛋白( 不同的免疫蛋白，牛 血清白蛋白，n g c a m ) ，j a m e s 等用多聚赖氨酸。以纤维素蛋白为“墨水”构建 了内皮细胞和其它几种细胞微图案【2 3 2 5 1 。 神经细胞已成功地粘附在层粘连蛋白( l a m i n i n ) 或合成的含有细胞可连接 的层粘连蛋白的多聚肽28 1 ，接有多聚赖氨酸的层粘连蛋白【2 9 1 ，或是树突棘状的 分子如集聚蛋白( a g r i n ) 。通过特殊的抗体印刷也可以构建和检测细菌( 埃希氏 杆菌，e s c h e r i c h i ac o l i ) 3 0 。另外一种有趣的作法是h o v i s t 3 1 1 等提出了可以用不 同成分的腊质双层( l i p i db i l a y e r ) 构建细胞可糖附及不可粘附的微结构。 由于分子微图案不是化学连接于底表面上，所以其稳定性不能完全满足于 细胞生物的长远研究。在间接细胞微图案的情况下，金表面化学自组装硫醇，将 含有细胞可粘附结点的低聚肽连接到硫醇上便可形成稳定的分子图案。玻璃的 硅化或是二氧化硅包被的表面也可以形成化学链接的微图案p 。3 5 j 。当然，化学活 化各种多聚物表面也一种构建稳定图案的可行方法阮36 1 。 6 ) 填充过程：微印刷区域以外的空白地方通常修饰上另外一种分子。在大 多数的情况下，这种填充是为了表面钝化以保证细胞仅仅粘附在微图案上。微印 章技术发明以后，提出了多种钝化方法。根据不同的基底，可用不同的化学钝化 方法如本节所总节的。在一些应用里，对于基底的钝化并不一定是强制的，因为 细胞( 如神经细胞) 会选择性的粘附在印刷的区域【”】，或是表面本身如疏水的聚 苯乙烯( p o l y s t y r e n e ，p s ) 【2 7 ，3 7 ，3 舯，聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ) 3 9 1 ，或是p d m s 4 0 l 在一定程度上对细胞吸附有抑制作用。利用p e g 作为抵制细胞或是蛋白的吸附 也有很多报告。在金的表面，硫醇化的p e g 就有几篇报告队1 8 , 1 9 】。其它的表面 ( 玻璃，金属氧化物，疏水的聚苯乙烯) 接有多聚赖氨酸的p e g ( p l l g p e g ) 也是一个有效的钝化系统。末修饰的p e g 也已成功用于钝化硅化的玻璃表面【3 4 】。 当表面是疏水时，聚丙二醇与环氧乙烷的多聚物( 聚醚，p l u r o n i c s ) 提供了另外一 种钝化的方法m4 2 1 。磷脂双层也可以用来抑制内皮细胞的吸附口钔。牛血清白蛋 白也常作为钝化试剂 4 3 1 ，但是有些报告认为b s a 的效果较差且时间较短m l 。 7 ) 反相图案法：虽然在大部分的文献报告中，微印章是用于形成细胞可粘 第一章绪论 附的区域( 然后进一步填充使其它区域钝化) ，但也有例外。一个例子就用把可 抑制细胞粘附的十二烷基磺酸钠( o c t a d e c y i t r i c h o l o r o s i i a n e ，o t s ) 印刷到硅表面 形成细胞不可粘附区域，然后填充( n 3 一( t r i m e t h o x y s i l y l ) p r o p y l 】d i e t h y l e n e t r i a m i n e d e t a ) 形成细胞可粘附的区域。反相图案法技术相对较少，可能是因为其墨水 的转移效率，低于1 0 0 ：因此即使在印章表面是蛋白或细胞抑制的，但是转移 到基底后就不一样了。 8 ) 基底的选择：p c p 的一个优点是可以兼容各种不同的基底。事实上，所 有用来研究细胞表面的基底均可用“c p 微图案化。正如前面所提到的，金、银、 金属、金属氧化物、玻璃和不同的塑料表面1 4 驯包含生物可降解的聚亚安酯薄层均 已成功地掏建出微图案。甚至于极稀有材料如人类眼球被膜( 外科手术中获得) 也构建了抑制细胞可粘附因子【4 6 j 。 9 ) 此方法的缺点：a 结构上的跟制一p c p 的成功很大程度上取决于微印章 材料的机械性能。一方面，微印章必须有足够的柔软度以保证与基底的全面接触， 并将基底本身的粗糙度造成的无效空间也接触到。另一方面，一个精确的三维微 图案要求要用刚性材料。这一对相对的要求不仅仅限制了这技术的分辨率( 最 小的尺寸) 也限制了可能的几何掣1 7 ，47 1 。文献报告的最小尺寸是1 0 0 n m 2 6 ，48 1 ，然 而它要求用特殊的印章材料或是机械辅助。实际上，一股的p d m s 印章最小的 合理尺寸大约为1 肛m ，这种方法的另外一个限制是在通常的实验条件下，它难于 重复并且最大的图案不能高于2 2 c m 2 。 微印章软材料虽然确切的r t c p 机理尚未完全清楚，但实际经验认为要获 得好的结果必须是基底比印章对墨水有更大的亲合力。并且，基底材料不能比微 印章材料软，因此较软的基底只能用喷墨法等( 参见下一节) 。 构建复杂结构通过印刷及进一步的填充可以在表面上只能形成两种分 子，构建三种或是更多的分子是一个挑战性的任务。一种方法是印章表面沾有不 同的墨水，比如说b e r n a r d 等用i _ t f l p ( 参见接下去的章节) 方法沾了1 6 种不同 的蛋白，然后转印到聚苯乙烯基底【4 。也可以同一基底上用含有不同蛋白的微印 章进行多次的c p p 4 5 0 】。另一种法如t i e n 等介绍的用h c p 构建不同成分的图案。 首先制作出复杂微图案，然后在不同部分沾上不同的蛋白并转印到基底上( 4 “。 控制分子链密度：在一些生物应用里，控制图案分子链的密度非常关键。理 厦门大学理学硕士论文 论上，可以通过调整墨水的浓度来控制其密度。如果正如一些文献【5 ”报告的转移 率1 0 0 ，这样就可以控制其密度。然后在实际中，转印的效率倾向于低于1 0 0 而且不同的实验会有很大的区别。并且，在转印过程中，小部分活性分子会失去 它的生物活性j 。另一个常出现的问题是在大部分的g c p 应用中，分子是以物 理吸附于表面，因此当细胞培养液( 特别是含有血清时) 接触到基底时，变性及 降解总是会出现h ”。 1 - 3 - 2 2 微流体图案技术0 x f l p ) 不同于许多其它方面的应用，微流体也可以用来构建化学的微图案表面。在 微流体图案技术中，微沟道被用于传送液体到基底的选择性区域。如图i 1 所示， 微印章表面的墨水转换为没有接触到的位置( 末起保护作用) 充满液体。所用到 的化学试剂及可能的材料与微印章技术都是一样的。微液体图案技术有自己的优 缺点。在所有本文提到微图案技术中，l a f l p 是最容易制作大量不同分子的微图 案的技术pz ，”j 。它也无需一个干燥的表面，这一点对于某些应用非常重要，如在 生物传感中，功能性依赖于活性生物分子的固定如不稳定的蛋白质及酶等。相比 p c p ，提高了对表面分子链浓度的控制。但是在另一方面，表面的几何学被限制 于开放的网状结构，虽然栅格状的微结构可以通过多次沉积及微沟道的旋转来实 圳52 1 。 对于微沟道的填充可以通过毛细管力，外压或是电渗力等驱动液流【5 。使用 p d m s 的微沟道提供了另一个优点：u c p 与g f l p 可以同时进行，表面接触的地 进行微印刷而沟道可进行液体分配陋“。 在特殊的情况下( 虽然很少用) ，g f l p 就是液相的g c p 。将微印章表面凸起 的区域沾上墨水，并与基底接触使墨水转移到基底上55 1 。 1 - 3 _ 3 墨水喷印技术o n k - j e tt e c h n o l o g y ) 墨水喷印技术是另一个被组织工程学认可，用于生物研究及应用的例子。比 如说，利用较小改造的商用打印机直接喷射硅烷或蛋白质构建表面化学图案 1 5 6 5 9 。w i l s o n 等报告了直接喷印细胞于凝胶膜表面，2 7 小时后2 5 的细胞死亡。 死亡的主要原因是细胞微环境的脱水而不是细胞通过喷头【6 0 1 。喷印技术具有便 o 第一章绪论 宜、对于不同基底的兼容性、快速的优点；并且，利用喷嘴装置喷印蛋白可得多 种功能的表面。对同一个点喷印多种混合物有着足够的精度，但是它的尺寸大大 地受到打印机的分辨率，喷嘴的直径及液固界面的张力。报道利用此技术得到的 最小的尺寸约为1 0 0 p _ m 。我们相信，如果将此技术与含有细胞可粘附及抑制区别 的表面相结合，具有很大的发展空间。它的挑战在于如何将单个细胞喷射到细胞 可粘附的小岛上( 或靠的足够近) ，形成高通量的阵列单细胞。 1 3 4 模板辅助图案技术( s t e n c i l - a s s i s t e dp a t t e r n i n g ) 模板就是含有大量预定尺寸和形状的孔洞的膜( 硬的或软的) 。当模板紧贴 于基底时，露出的小孔可被修饰而其它的匀受保护( 如图1 3 ) 。只有通过小孔露 出的表面可进行化学图案的沉积或是剥离，或是细胞的直接粘附( 未经过任何化 学修饰) 。模板材料可以是软的( 如p d m s ) ，或是较硬的材料( 如金属等) 。如 f o l c h 掣“1 用p d m s 弹性膜( 光刻法制造) 直接在未经任何化学修饰的表面构建 细胞阵列。这个简单的技术无需任何特殊的仪器或化学试剂，只要一个合适的模 板。在细胞粘附之前先把模板贴在基底表面上，粘附在模板表面上的细胞可以人 工剥离。当没有将基底进行预先抑制细胞粘附修饰时，细胞会很快繁殖到图案以 外。利用这种方法构建的细胞图案可以用来研究细胞的迁移行为，也可用来研究 两种或多种细胞的共培养。t o u r o v s k a i a 小组k 2 1 开发了一种方便的p d m s 模板及 无污垢的基底。一层均匀的互相贯穿的网状p a a m c o e g 聚合物聚合连接在玻璃 表面，然后利用腐蚀法( 氧等离子体) 去掉预先设定位置的蛋白或是细胞，这种 高膨胀性的i p n 阻碍了蛋白质的进一步粘附，因此细胞图案可保持到6 0 天【6 3 】。 最近，k i m 等提出另一种程序来制作软的，无残留应力的修饰有s u - 8 光刻 胶的模板方法【6 。此法可达到微米或纳米( 1 0 0 p m ) 尺寸，可用于构建单细胞图 案1 6 5 1 。 模板辅助细胞图案技术可以适用于任何的基底材料( 金属，金属氧化物及 软或硬的聚合物) 。另外一个优点是无需用到有机溶剂，有利于的较为脆弱的分 子的固定。 厦门大学理学硕士论文 图1 - 3 以p d m s 为模板辅助细胞图案技术示意图：( a ) 含有均匀的网状聚合物薄膜紧贴于 玻璃表面，右图为贴于玻璃前后的膜形状。( b ) 以膜作为牺牲层用氧等离体使部分玻璃表面 活化。( c ) 标有荧光物的纤维素蛋白接到玻璃表面，剥离弹性膜。( d ) 将修饰有纤维素蛋白 的基底用细胞悬浮液培养。( e ) 溶液更换去掉末粘附的细胞。标尺为1 0 0 p m 。 1 - 3 5 激光诱导直写细胞技术 光产生的力( o p t i c a lf o r c e ) 是另外一种可以将细胞直写在表面特定位置的 方法。目标物需具有高反射系数，如细胞或是颗粒，就会被限制在称为“光陷阱” 的位置，它是由激光聚焦产生的。此种控制是很精确的，允许一次移动一个细胞 。线性光陷阱是由光束及低数值孔径透镜决定的。o d d e 和r e m 【7 0 恨示了可 1 2 第一章绪论 将一束的细胞固定在表面上，及可将合适的细胞固定在一条长3 0 0 p m 线上。激 光可在介质中持续地将细胞移动到预先设定的位置。光学力来自于两个表面不同 的反射率。每次，细胞随着光的改变方向而改变，力的大小大约为几个皮牛顿 ( p i c on e w t o n ) 。光程越远时，光束的力量越小。最大的力传送距离约为3 0 0 p m ， 超过这个范围时就无法控制。但这个限制可通过将细胞引入中空的光纤，光纤的 内径约为1 0 0 p m ，光纤的全反射可控制细胞移动距离超过7 m m ，移动速度约为 5 0 p m s 6 ”。 随着最近发展起来的高级空间光调节器，g l u c k s t a d 等可以实时地微操纵各 种颗粒及细胞6 8 1 。用一个适当的装置，他们可以用电脑鼠标任意地移动光陷阱。 这个装置的平行实时操作对于细胞图案及组织工程应用有很大的发展潜力。 如同喷墨印刷细胞图案技术一样，激光直写细胞图案可由不同的细胞构成， 因此可以制作不同的组织。弗且，相对喷墨技术的分辨率为1 0 0 p m ，激光直写的 分辨率达到l “m ，因此允许更高精确的空间组织。这种非接触式的技术特别适用 于构建多层的细胞及三维网络或是组织。然而，此技术的一个重要方面尚无很好 的研究，那就是激光对细胞的损伤程度。o d d e 等报道了利用近红外可见光操纵 细胞，但是在操作过程中功能性生物分子有没有受到损伤还不清楚。还有报道【6 9 1 说，当平行操纵大量细胞时需要较高的光能，因为这时相对于环境它的对比度较 低。需要较高的光能可能会进一步导致细胞的改变。还有，当细胞开始扩散到表 面后，对于细胞的控制就较难，且改变了图案，除非先对表面进行化学修饰。 1 3 6 光固定及光化学构建微阵列技术 表面固定光活性分子已应用于构建化学微图案，并用于细胞粘附。h u 和他 的同事固定含有a r g g l y a s p ( r g d ) ，顶端为乙烯基乙二醇修饰的硅烷，用u v 或是激光活化苯甲酮( b e n z o p h e n o n e ) 基团。光照时间及表面固定的寡肽成线性 关系( 范围为0 , , - 0 5 p m o l c m 2 ) 7 0 o 通过激光不同的扫描速度( 不同的照射时间) ， 他们成功地构建肽的浓度梯度。2 4 小时后，纤维素蛋白大量地粘附在含肽较多 的位置。最近，d i l l m o r e 等用一个类似的方法，通过光化学解保护把接有硅烷的 对苯二酚从n v o c 基底上去掉。接着，用电压使对二苯酚基团不可逆地氧化为 了苯醌。最后，肽共价地固定在活化的区域并提供细胞连接的位点。3 t 3 s 瑞士 厦门大学理学硕士论文 纤维素细胞接种在无血清的介质中，四小时后更换含有血清的介质。2 4 小时后， 细胞贴在肽的图案位置【7 1 。 表面光活化有几种方法。文献l s s 中，用光掩模板法可以将尺寸缩小到】j a m ， 用一束直径为2 0 1 _ l m 的激光同样也可以进行光活化。激光光束活化的一个优点是 可以采用不同的照射时间来构建均匀的图案，同时也可构建复杂的三维图案吲。 然而，相比光刻法大面积的平行构建能力，此方法速度较慢。在文献7 1 1 中，单片 缩影胶片掩模方法说明了平行处理方法的可行性。第二种策略是用汞灯及显微镜 来对表面直接扫描活化。作者总结了当利用扫描近场光学显微镜活化技术可以构 建出高分辨率的图案。这些技术对不同类型及浓度的固定分子有很大的兼容性。 然后，它们不适用于长于2 4 小时细胞粘附的培养，因为在此环境下，硫醇容易 氧化州。 i 3 7 等离子聚合及光刻法或激光剥离法 光刻法结合等离子法薄层聚合己在几年前开发，用于构建二维生物材料图案 并进行细胞培养7 4 ，7 5 1 。等离子体是电离的气体，由大量自由电子和离子以及中性 粒子组成，是物质的一种奇特聚集态。人为的等离子体通常产生于无线电发光发 热的放电器件。适当的等离子体参数可以沉积厚度从几个纳米到微米的聚合物薄 层。由h o f f a m a n 和他的同事阐述了用等离子体光刻法可以是一个很好的替代方 法【7 6 】。p e t 表面首先甩上一层乙烯乙二醇二甲基醚( t e t r a g l y m e ) 。然后用如前 面所述的光刻法( 甩胶，光刻等) ，然后在表面甩上一层碳氟化合物。接着，去 掉光刻胶，表面形成了一层细胞不可粘附的碳氟化合物。无血清的平滑的肌肉细 胞溶液接种表面，长时间培养后，1 0 血清再加入培养液中，由此得到的细胞图 案( 1 0 1 0 0 帅2 ，4 0 4 0 胁2 ) 可以保持至少1 4