（动物学专业论文）盘基网柄菌尿囊酸酶基因表达产物的纯化及多克隆抗体制备.pdf

盘基网柄菌尿囊酸酶基因表达产物的纯化及多克隆抗体制备 研究生：魏晓静 学号：5 1 0 5 1 3 0 0 0 4 6 专业：动物学 研究方向：动物细胞与分子生物学 导师：侯连生 摘要 盘基网柄菌( d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m ) 是一种“土壤阿米巴一，以吞食细菌 为生。在营养丰富条件下，以单细胞形式存在；一旦食物匮乏，单个细胞聚集成 多细胞体，细胞历经细胞丘、蛞蝓体、拔顶阶段完成发育和分化过程，最终形成 由孢子细胞和柄细胞组成的子实体，在合适条件下，孢子细胞萌发开始新生命周 期。由于其具有单细胞和多细胞的生命过程，生命现象丰富，作为非常好的模式 动物，用来研究细胞的运动性，细胞间的信号转导以及细胞类型的特化和细胞发 育等。 l a g c 基因编码的g p l 5 0 蛋白是一种膜蛋白，一种异嗜性细胞表面粘附分子， 通过细胞间异嗜性粘着的相互作用来调节细胞的粘着，以此来调节细胞的分化。 g p l 5 0 缺失的细胞株a k l 2 7 不能完成多细胞发育，发育只能停留在细胞松散聚 集阶段。由此推测，g p l 5 0 蛋白在盘基网柄菌发育过程中起着重要作用，它可能 参与介导细胞分化和凋亡的信号转导途径，但具体的信号通路至今仍未完全清 楚。为了研究g p l 5 0 对盘基网柄菌多细胞发育相关基因的影响，运用d d r t - p c r 方法发现在野生型细胞k a x 3 和突变细胞a k l 2 7 发育到1 4 小时，有一差异表 达片断并提交至g e n e b a n k ，长度为6 0 2 b p ，获得登陆号a y 8 9 4 7 1 8 ，通过b l a s t 同源序列比对，该序列中9 8 的碱基与盘基网柄菌中尿囊酸酶基因( 长度为 1 1 0 0 b p ) 部分片断几乎完全一致，e 值为零，因此我们判断该基因在野生型细胞 株k a x 3 和突变型细胞株a k l 2 7 在发育过程中存在差异表达。 2 0 0 5 年盘基网柄菌全基因组测序工作完成，全基因组由六条染色体，线粒 体d n a ，以及核糖体d n a 组成。a l l c 基因位于第三号染色体上，编码的蛋白分 子量约为4 2 k d 。尿囊酸酶( a l l a n t o i c a s e ) 是嘌呤代谢中一种重要的酶，催化尿 囊酸生成脲基乙醇酸，后者进一步降解为氨、二氧化碳和乙醛酸。而代谢过程中 产生的氨是一种盘基网柄菌发育调控中一种重要的信号分子，氨通过抑制诱导分 化因子( d i f ) 的累积来抑制柄细胞的发育并促进孢子细胞的形成。为此我们克 隆表达了尿囊酸酶基因，并制备多克隆抗体，为研究该基因在盘基网柄菌发育调 控中的功能提供依据。 本实验提取盘基网柄菌野生型细胞株k a x 3 发育到1 4 小时细胞的总r n a ， 逆转录p c r 得到c d n a 第一链，以e d n a 第一链为模板克隆出尿囊酸酶基因， 将盘基网柄菌( d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m ) 尿囊酸酶基因克隆入融合表达载体 p e t - 3 2 a ，并在大肠杆菌e e o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 中进行诱导表达，结果获得较高纯度 的表达蛋白。表达菌株经lm m o l l i p t g 诱导4 h 后，尿囊酸酶蛋白高效表达并 形成包涵体，融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的3 7 。包涵体经8 m o l l 尿素 溶解后，经n i - n t a 金属螯合层析柱在变性条件下纯化，得到纯度达7 0 的尿 囊酸酶融合蛋白。采用切胶回收的方法切割回收该融合蛋白，免疫新西兰大白兔， 制备和获得了多克隆抗血清。用w e s t e r nb l o t 检测该抗血清与融合尿囊酸酶免疫 反应，结果发现即便抗血清稀释到l ：2 0 0 0 ，也能与融合尿囊酸酶产生良好的识 别反应。因此本研究成功制备了尿囊酸酶多克隆抗体，为研究该基因在盘基网柄 菌发育过程的功能提供有力的工具，也为今后研究该基因与g p l 5 0 蛋白的关系提 供理论依据。 关键词：盘基网柄菌；尿囊酸酶；原核表达；蛋白纯化；多克隆抗体 一 ，p r o t e i np u r i f i c a t i q，p o l y c l o n a la n t i b o d y e x p r e s s i o np r o t o np u r i l i c a t i o np o l y c l o n a la n t i b o d y ， p r e p a r a t i o no fa l l a n t o i c a s e ( 口盯 f r o md i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m c a n d i d a t en a m e ：w e i x i a o - j i n g s p e c i a l i t y ：z o o l o g y d i r e c t i o n ：c e l l u l a ra n dm o l e c u l a rb i o l o g y s u p e r v i s o r ：h o ul i a n - s h e n g a b s t r a c t t h es o c i a la m o e b ad i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u mw h i c hp h a g o c y t o s i ss o i lb a c t e r i a f o rf o o di sau n i c e l l u l a re u k a r y o t e u n d e rf a v o r a b l ec o n d i t i o n ，i tm u l t i p l i e sa sa u n i c e l l u l a ro r g a n i s m u p o ns t a r v a t i o n , ap a t h w a yi n v o l v i n ga g g r e g a t i o n ，m o u n d ，s l u g ， c u l m i n a t i o ns t a g e si n d u c e st h ef o r m a t i o no faf r u i t i n gb o d yc o n s i s t i n go fah e a do f s p o r e ss u p p o r t e do nas t a l ko fv a c u o l a t e dc e l l s s p o r e sa w a i td i s p e r s a la n dg e r m i n a t e i nf a v o u r a b l ec o n d i t i o n sf o ra m o e b o i dg r o w t h d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u mi sa l l e x c e l l e n ts y s t e mi nw h i c ht os t u d yc e l lm o b i l i t y , c e l l - c e l ls i g n a lt r a n s d u c t i o n ，c e l lt y p e d i f f e r e n t i a t i o n ，d e v e l o p m e n ta n ds oo nf o ri t su n i c e l l u l a ra n dm u l t i c e l l u l a rl i f es t a g e s a n dr i c hl i f ep h e n o m e n a t h em e m b r a n eg l y c o p r o t e i ng pl5 0e n c o d e db yl a gc p l a yar o l ei nc e l l - t y p e s p e c i f i c a t i o nb yh e t e r o p h i l i ci n t e r a c t i o n s as t r a i n i nw h i c hl a g ci s d i s r u p t e d ， a k l 2 7 ，u n d e r g o e sn o r m a lc h e m o t a x i s ，b u ti sa r r e s t e da tt h el o o s ea g g r e g a t es t a g e s o w ei n f e r r e dt h a t g pl5 0p l a y ak e yr o l e d u r i n gt h ew h o l ed e v e l o p m e n to f d i c t y o s t e l i u m i tm a yb ei nt h es i g n a lt r a n s d u c t i o nw a yo fc e l ld i f f e r e n t i a t i o na n d a p o p t o s i s h o w e v e rt h ec o n c r e t es i g n a lr o u t eh a sn o tb e e nk n o w n t os t u d yt h e i n f l u e n c eo ft h ec e l la d h e s i o nm o l e c u l eg pl5 0o nt h ee x p r e s s i o no fg e n e sn e e d i n gf o r d d i s c o i d e u md e v e l o p m e n t ，m r n ad i f f e r e n t i a ld i s p l a yw a su s e dt oa n a l y s et h e d i f f e r e n c e so fg e n ee x p r e s s i o nb e t w e e nt h ew i l ds t r a i nk a x - 3c e l l sa n dt h em u t a n t s t r a i na k l2 7c e l l s w eg o tad i f f e r e n t i a le d n af r a g m e n t ，6 0 2 b p ，b e t w e e nk a x 一3c e l l s a n da k12 7c e l l sd e v e l o p e df o r14 h t h i ss e q u e n c eh a db e e ns u b m i t t e dt ot h en c b i g e n b a n ka n dt h ea c c e s s i o nn u m b e ri sa y 8 9 4 718 w ed i dh o m o l o g o u ss e q u e n c e a l i g n m e n tb yt h eb a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l ( b l a s t ) ，a n dw ef o u n dt h e 9 8 b a s es e q u e n c eo ft h ed i f f e r e n t i a lc d n af e a g r n e n tw a st h es a m e 硒 ( a l l a n t o i c a s e ) a l l c ，e - v a l u ei so s ow ec o n c l u d e dt h a tt h ea l i cg e n ew a sd i f f e r e n t l y e x p r e s s e db e 铆e e nt h ew i l ds t r a i nk a x - 3 c e l l sa n dt h em u t a n ts t r a i na k l 2 7c e l l s t h es 仪l u ：i l c co fd i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u mw a sc o m p l e t e di n2 0 0 5 t h eg e n o m e ， a b o u t3 4m bo fd n a ，c o n s i s t so f6c h r o m o s o m e s ，m i t o c h o n d r i a ld n aa n dr i b o s o m e d n a a l l ci sl o c a t e di nc h r o m o s o m e3c o o r d i n a t e s318 3 9 7 9t o318 5 311 i te n c o d e sa p r o t e i nn a m e da l l a n t o i c a s ea n di t sm o l e c u l a rw e i g h ti sa b o u t4 2 k d a l l a n t o i c a s ei sa l l i m p o r t a n te n z y m ei nt h ed e g r a d a t i o no fp u r i n e s i tc a t a l y z e st h ec o n v e r s i o no f a l l a n t o i ca c i d i n t ou r e i d o g l y c o l a t ea n du r e a a n dt h ef o r m e rw a sr e s o l v e di n t o a m m o n i a 、c 0 2 、g l y o x y l a t e a m m o n i ai sa ni m p o r t a n ts i g n a lm o l e c u l ew h i c hr e g u l a t e t h ed e v e l o p m e n to fd i c t y o s t e l i u m a m m o n i ai n h i b i t ss t a l kc e l ld i f f e r e n t i a t i o na n d p r o m o t e s d i f f e r e n t i a t i o no f p r e - s p o r e c e l l st o s p o r e sb ys u p p r e s s i n gd i f c u m u l a t i o n t h u sw ec l o n e dt h ea l l ca n dg o tt h ep o l y c l o n a la n t i b o d yo fa l l cf o r s t u d y i n gt h eg e n ef u n c t i o ni nd i c t y o s t e l i u md e v e l o p m e n t t o t a lr n aw a si s o l a t e df r o mk a x - 3c e l l sw h i c hh a dd e v e l o p e df o r14 h a f t e r r e v e r s et r a n s c r i p t i o nw eg o tt h ef i r s ts t r a n dc d n a t h e nw ec l o n e dt h ea l i cb yp c r t h ea l l a n t o i c a s eg e n e ( a l l c ) o fd i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u mw a sc l o n e di n t ot h ef u s i o n e x p r e s s i o nv e c t o rp e t - 3 2 aa n de x p r e s s e di ne c o l ib l 21 ( d e 3 ) h o s tc e l l s a f t e rt h e e x p r e s s i o ns t r a i nw a si n d u c e df o r4h o u r sb ylm m o l li p t l 3 it h ef u s i o np r o t o n a l l a n t o i c a s ew a ss u c c e s s l ye x p r e s s e da n dd e t e c t e di ni n c l u s i o nb o d i e s t h ef u s i o n a l l a n t o i c a s ea c c o u n t e d37 o ft o t a lb a c t e r i a lp r o t e i n s i n c l u s i o nb o d i e sd i s s o l v e di n t h es o l u s i o no f8 m o l lu r e aw a sp u r i f i e db yn i - n t as u p e r f l o wc a r t r i d g eu n d e r d e n a t u r i n gc o n d i t i o n s w eg o tt h ef u s i o na l l a n t o i c a s ew i t hp u r i t yq u o t i e n to f7 0 t h e i n c l u s i o nb e d yp r o t e i nb a n di ns d s p a g ew a se x c i s e da n dt h ep r o t e i nw a s e x t r a c t e d t h e nt h ep u r i f i e dp r o t e i nw a si n j e c t e di n t on e wz e a l a n dr a b b i t st oi n d u c e i m m u n o r e a c t i o n t h ei n d u c t i o nw i t hf o u r i n j e c t i o n sl a s t e df o r4 5d a y s ，a n dt h e nt h e a n t i - s e r u mw a sp r e p a r e d w e s t e r nb l o t t i n gs h o w e dt h a tt h ea n t i s e r u m ( d i l u t e dt o1 ： 2 0 0 0 ) h a ds p e c i f i ca n t i g e n a n t i b o d yr e c o g n i t i o nt ot h ef u s i o na l l a n t o i c a s e w eg o t p o l y c l o n a la n t i b o d yo fa l l cw h i c hs u p p l i e sg o o dt o o lf o rr e s e a r c h i n gt h ef u n c t i o no f a l l cd u r i n gd i c t y o s t e l i u m d e v e l o p m e n ta n df o rs t u d y i n gt h ei n t e r a c t i o nb e t 、) l ，e e n a l l a n t o i c a s ea n dg pl5 0 k e yw o r d ：d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m ；a l l a n t o i c a s e ；p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n ；p r o t e i np u r i f i c a t i o n ；p o l y c l o n a la n t i b o d y 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在 文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：磊缸堕盘 日期： 学位论文授权使用声明 研占 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 学位论文作者签名：导师签名： 日期： 么移易 乙 日期：尘塑一业 第一章前言 1 盘基网柄菌发育细胞对称性与细胞分化 社会变形虫盘基网柄菌( d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m ) 隶属原生动物门网柱超 纲，在营养丰富的条件下以单细胞阿米巴形式生长和繁殖；剥夺食物触发多细胞 的发育，野生型细胞k a x 3 经历细胞聚集、细胞丘和蛞蝓体阶段，最后形成由 柄和孢子组成的子实体【l 】。饥饿的盘基网柄菌细胞进入多细胞发育期。在趋化物 作用下，细胞内受体及其相关组分呈极性分布，使细胞有方向地极化和移动，聚 集成多细胞体。在形态发生素和分化诱导因子协同和组合作用下，细胞体对称模 式被破坏，细胞分化并分类成不同类群。因此趋化物和形态发生素对发育细胞模 式形成和分化决定有重要作用。 一旦饥饿发生，在固体基质上细胞群中某些细胞开始分泌振荡的c a m p 信 号，其它细胞通过g 蛋白偶联环腺苷受体( c a r ) 作出反应，趋化性地爬向c a m p 源，在这里细胞聚集成多细胞体。在受体刺激同时也激活腺苷环化酶( a c a ) 来 合成和分泌另外的c a m p ，使得c a m p 波能够向外扩展，聚集更多细胞：这样 c a m p 波不断向外扩展，越来越多细胞趋化性地爬向c a m p 处，聚集成一个多细 胞体。不过反应是短暂的，随着激活，趋化性和腺苷环化酶反应细胞适应了c a m p 信号，已分泌的c a m p 被胞外的磷酸二脂酶降解，因此允许细胞对下一轮c a m p 波作出反应。应答和适应状态间的循环保证了c a m p 信号的传播并向内聚集更多 的个员细胞【2 】。这两种状态之间的循环是通过磷酸酰肌醇3 激酶( p 1 3 k ) 调节 a c a 的激活和应答来实现的【3 】。 多细胞聚集经历两个基本的细胞模式形成过程( 图1 ) 【4 】。在形态发生素 c a m p 和分化诱导因子( d i f 1 ) 协同和组合作用下，多细胞体启动了细胞分化 过程。细胞分化成前柄细胞和前孢子细胞，然后又分类成特定的类群。多细胞体 沿前后轴组成能迁延的蛞蝓体；其后部( 7 5 ) 主要是前孢子细胞，而前柄细 胞主要局限于蛞蝓体的前部。这些没有终末分化的前孢子和前柄细胞细胞最终形 成孢子细胞和柄细胞，组成完全分化的子实体【5 】。 盘基网柄菌发育细胞在多种分化诱导因子作用下，细胞内的对称模式发生了 改变，各种信号分子被募集到相应位置，细胞发生分化并且这整个发育过程中基 因的时空表达受严格的控制。盘基网柄菌在非常低的趋化梯度中是如何整合激活 和抑制网络使细胞有方向地极化和移动? 盘基网柄菌多细胞体内如何指引未分 化细胞的命运选择的拮抗信号级联系统? 这些途径与其他生物相似途径问存在 什么联系呢? 这些问题都有待进一步的阐述。 o f ) o 0 0 6 0 o 生长细胞 趋化性聚集蛞蝓体子实体 ：冀竺丢竺竺：脚) 呻 0 前柄细胞 三罴咖 图1 盘基网柄菌发育的各主要时期 营养生长期的个员盘基网柄菌细胞以二分裂繁殖和生长。一旦营养匮乏，细胞进入发育周期。某些饥饿 细胞分泌c a m p ，其四周细胞趋化性地爬向c a m p 源处，形成多细胞聚集体。聚集体内细胞有了初步分化， 分化成前柄细胞和前孢子细胞。随着发育进程，聚集体经历了形态发生和已分化细胞的分类。在蛞蝓体阶 段，蛞蝓体后部主要由前孢子细胞组成( 黑色) 前部的前柄细胞区又分化成三类亚型前柄细胞。蛞蝓体后 部的前孢子细胞最终分化成子实体的孢子，前柄细胞群则分化成子实体的各种柄结构。 1 1 趋化和聚集：c a m p 作用 盘基网柄菌的细胞如何感觉趋化因子浓度梯度并对此作出反应的几条途径 与高等生物中的基本相似。趋化因子受体c a r l 的激活，导致趋化细胞极性的形 成。趋化细胞的前缘由定向于趋化物的新形成的f 肌动蛋白组成，接着由连接 于f 肌动蛋白的肌球蛋白i i 的组装来调节其后部的收缩( 图2 ) 【4 1 。在没受到刺 激和极化的细胞中，c a r i 及其偶联的g 蛋白基本上是均匀分布在细胞表面；受 体影响的下游效应子在空间上也没显示出任何极性【】。一旦受趋化物梯度刺激， 受体和g 蛋白有比例地激活，在刺激后4 秒钟内，发生肌动蛋白的聚合，随后 立即发生解聚作用，即使细胞周围c a m p 的浓度仍在上升；这种快速组装和拆卸 与冠蛋白和a i p l 蛋白的募集反应有关【l0 1 。在越过细胞体c a m p 梯度相差5 左 右情况下，引起细胞内g 蛋白下游信号的放大，使胞内各种信号传递组分明显 地呈极性分布，许多信号传递组分在空间上开始集中于细胞另一极。最终导致前 缘的肌动蛋白的聚合作用及另一极的肌球蛋白的装配。 2 盘基网柄菌首次( 5 s ) 可见的极性化反应之一是磷酸酰肌醇3 激酶( p 1 3 k ) 激活和募集只局限于前缘空间处【l l 】，而p 1 3 k 途径的负调节者p t e n 从前缘消失 并逐渐优先分布在相反一极( 图2 ) 【1 2 1 。这些互相协调过程使p t d l n s ( 3 ，4 ，5 ) p 3 募集一组含p h 域的蛋白，包括c r a c 、a k t p k b 和p h d a 到细胞前缘【1 3 1 。这 些蛋白的定位作用调节了f 肌动蛋白的形成和伪足的伸展。p 1 3 k 突变细胞极性 化和趋化性受到损害，p t e n 的丢失也能导致趋化性严重缺损【1 4 _ 5 1 。 细胞的后部展示了另一种极性化的反应。占优势的腺苷环化酶a c a 和肌球 蛋白i i 调节子p a k a 都局限于趋化细胞的后部。有意思的是它们的活性分别依赖 位于前缘的信号传递蛋白c r a c 和a k t p k b t l 6 1 。鸟苷环化酶( g c s ) 突变细胞的 肌球蛋白装配缺损，丢失抑制侧向伪足形成的能力【1 刀，结果这些细胞展示了扩大 的前部信号传递。与此相反，c g m p 磷酸二脂酶突变的细胞积累了高浓度的 c g m p ，变得超极化，在前缘主要形成细长的伪足。在哺乳类动物细胞中也显示 趋化细胞前后部之间的拮抗作用【l 引。但是这种拮抗作用并不是绝对的，如果在盘 基网柄菌细胞两端各放置不同的c a m p 浓度梯度，细胞仍然显示向两端极化反应 【9 】 o 细胞极化既需要激活途径也需要抑制途径，这样就使得胞外梯度能够放大为 胞内反应。有研究提示依赖受体激活的r a s 蛋白位于p 1 3 k ，a c a 和g c 信号传 递途径的上游，但是r a s 的激活是局部的还是整体的仍然不太清楚。此外，趋化 反应中的抑制途径或适应性途径的机制我们知之甚少。在盘基网柄菌细胞中，通 过g a 9 调节了对c a m p 的适应性反应，但是剔除g a 9 基因细胞并不消除对c a m p 梯度的适应性或是极化受到损伤，相反突变细胞变得超极化，并对趋化超敏【i 刀。 前缘 后缘 c a m p 的g 的被 卜 富集p t e n ，a c a ，p k a a 和肌球蛋白i i 图2 盘基网柄菌趋化性和极性的调节 细胞前后功能差异调节了细胞趋化性和极性。在c a m p 浓度梯度下盘基网柄菌细胞呈高度 极化的细胞组织。趋化物c a m p 受体及其耦联g 蛋白分布在细胞四周，c a m p 刺激成比例 地激活c a m p 受体和g 蛋白；而且，特定信号传递分子有极性地分布在细胞的前后缘。p 1 3 k 、 p t d l n s ( 3 ，4 ，5 ) p 3 、p h 蛋白a k t 、c r a c 和p h d a 优先分布在与c a m p 源最近的细胞的 边缘，这些组分调节f 肌动蛋白多聚化和伪足向c a m p 梯度方向伸展逆着p h 蛋白募集方向， 在细胞侧面和后缘集聚p t e n ，借此抑制侧向和后缘的伪足形成，肌球蛋白i i 的组装明显增 加了这些位置的张力，这也限制了伪足的伸展，同时又促进了细胞后缘的收缩 1 2 细胞分化决定源于信号途径的拮抗作用：c a m p 和g s k 3 信号传递 盘基网柄菌胞外的c a m p 不但能作为趋化因子而且还能作为形态发生 素以调节发育细胞命运的选择。通过各种拮抗途径，c a m p 信号传递既能指导前 孢子细胞分化也能指导前柄细胞的分化。c a r 3 ( 有4 种c a r ) 激活酪氨酸激酶 z a k l 和z a k 2 ，进而磷酸化蛋白激酶g s k 3 两个必需的酪氨酸残基，使g s k 3 激活，激活的g s 硒促进前孢子孢子分化，抑制前柄细胞柄细胞决定。缺乏 c a r 3 、z a k l ( z a k 2 ) 或g s k 3 细胞，或表达激酶失活细胞，或不能磷酸化的 g s k 3 蛋白的细胞都显示了前柄细胞标记基因的广泛表达，孢子形成明显减少 【1 9 1 。而c a m p c a r 4 激活蛋白酪氨酸磷酸酶( p t p a s e ) ，该酶使g s k 3 去磷酸化， 并使其失活，促进前柄细胞分化。如预料那样，c a r 4 突变细胞的表型与g s k 3 突 4 变细胞的表型相反，包括增强前孢子信号传递，减弱前柄细胞的传递途径。 g s k 3 活性的拮抗调节是所有高等生物发育的中心环节。初级抑制途径涉及 w n t 的应答，其最终调节了转录辅助因子1 3 连环蛋白。在未受到刺激的细胞内， 1 3 连环蛋白与a x i n 蛋白形成的复合物是g s k 3 磷酸化的底物，磷酸化的1 3 连环 蛋白经a p c 和其他组分定向地通过蛋白酶体降解。在典型的w n t 途径中，刺激 f z 和l r p 共同受体，使得a x i n 裂解，复合物形成受阻，抑制了g s k 3 磷酸化1 3 连环蛋白【2 0 】，结果1 3 连环蛋白水平得以稳定，使得它们增强了与转录因子l e f t c f 家族的缔合。核1 3 连环蛋白l e f 复合体激活一组基因以决定特定细胞命运。在脊 椎动物中，某些w n t s ( 如w n t 5 a ) 也有典型拮抗途径的功能，在该途径中，b 连环蛋白稳定性以一种独立与g s k 3 激活途径的方式降低。 尽管在盘基网柄菌细胞中还没有找到编码w n t 样因子基因的证据，但是 c a m p c a r 和w n t f z 途径间在数个水平是十分相似的，c a r 4 和典型的w n t 途 径都是把抑制信号传递到g s k 3 。同样地，c a r 3 和w n t 5 a 途径都分别拮抗它们 的对应物，尽管它们涉及的机制不同。当比较c a r 和f z 蛋白的跨膜序列后，进 一步发现了它们之间的关系；c a r s 缺乏胞外富半胱氨酸的w n t 结合域，但是两 蛋白共享显著的保守区，尽管进化距离大于5 亿年。也值得强调的是，在盘基网 柄菌和后生动物中，用遗传和生化处理抑制内源性的g s k 3 活性形成的无激酶活 性的g s k 3 可作为表型显性失活调控因子【l 引。这些数据预示了a x i n 是g s k 3 和 8 连环蛋白的支架蛋白，并在功能上作为盘基网柄菌细胞中相似的因子奠定了基 础。 在盘基网柄菌中还没有鉴定出直接位于( 激活的或去活化) g s k 3 下游的靶 基因。有数据提示1 3 连环蛋白相关蛋白a a r d v a r k 位于g s k 3 下游，能激活前孢 子基因表达【2 l 】，但是还没有完全建立明确的生化联系。不过该途径似乎并不抑制 前柄细胞的分化。调节g s k 3 在核内的位置可调控其他转录因子的功能【2 2 1 。盘基 网柄菌中c a r g s k 3 信号传递对调控转录因子的细胞内转运有重要功能。w n t 信号传递途径和核靶位确实是秀丽线虫发育期间交叉点，所以有可能c a r g s k 3 信号传递途径也是盘基网柄菌发育的交叉点。 1 3 抉择的关键点：d i f 调控 d i f 1 是一个氯化六苯环化合物，首次作为能诱导单层培养的未分化的盘基 5 网柄菌细胞形成柄细胞的物质被纯化出来【2 3 1 。在单层培养细胞中，d i f 1 也能迅 速诱导主要的前柄细胞群( p s t a 、p s t b 、p s t o ) 特异基因的表达，抑制前孢子细 胞( p s p ) 特异基因的表达，抑制孢子细胞形成。因此认为d i f 1 是模式形成中 关键的信号传递分子。有异义的地方是，在被认为是受抑制的前孢子区域合成 d i f 1 【2 4 】，而其降解主要发生在前柄细胞内【2 5 1 。 d i f 1 甲基转移酶，d m t a ，是催化d i f 1 生物合成的终末步骤的酶。d m t - a 突变细胞不能合成有活性的d i f 1 ，但是值得指出的是，在发育期，它们依然能 正常地产生柄细胞和诱导p s t a 和p s t b 细胞典型的特异基因表达【2 6 】，当然前孢子 细胞基因表达没有受到影响。因此，d i f 1 真正的功能完全不同于单层细胞培养 研究的那样，丢失d i f 1 唯一受到影响的细胞群是p s t o 和某些p s t o 标志基因的 表达【2 7 1 ，而不是全部的标志基因；这表示在体内d i f 1 的功能只促进p s t o 细胞 分化。可是单层培养的d m t a 突变细胞保持着对d i f 1 的反应以诱导柄细胞形成 和抑制孢子细胞分化。这就是使我们感到迷惑的地方，为何外源的d i f 1 对盘基 网柄菌分化有这样的全面影响，而去除d i f 1 后引起的发育上缺损只限于p s t o 细胞群。 目前还难于鉴定d i f 1 信号传递的受体及其下游的靶底物，d i f 1 效应启动 子元件对数个s t a t 有很高的亲和性，但是缺乏各种s t a t 的细胞表型完全不同 于缺乏d i f 1 细胞的表型。为了找到d i f 1 下游途径的成员，t h o m p s o m 及其同 事最近筛选了抗d i f 1 抑制培养细胞孢子形成的突变细胞株，该细胞缺乏d i m a ， 是转录因子b z i p 家族的一个成员【2 8 】。在发育期间，d i m a 突变细胞展示的形态发 生表型与d m t a 突变细胞的形态发生表型几乎相同，提示了d i m a 为d i f 1 调控 系统所必需。然而，两突变株也有明显差异，d i m a 突变细胞能产生正常水平的 d i f 1 ，在培养细胞中，对外源d i f 1 诱导前柄细胞柄细胞分化和抑制前孢子 孢子分化命运的作用完全没有反应；相反，缺乏d i f 1 细胞的反应是非自主的， 对d i f 1 诱导和抑制功能反应正常。 d i f 1 各种应答反应的整合需要转录因子d i m a 。d i m a 自主性地调控d i f 1 诱导单层培养细胞p s t a 、p s t b 和p s t o 的基因及柄细胞形成的功能，并且d i m a 的丢失就失去了d i f 1 对前孢子孢子分化的抑制作用。存在的问题是d i m a 处 于这些分化途径的什么位置，或d i m a 为何既能起激活调控作用又能起抑制调控 6 作用。最新研究发现一种和d i m a 相关的b z i p 家族转录因子d i m b ，d i f 一1 刺激 d i m a 和d i m b 亚细胞定位的快速变化表明二者直接处于d i f 1 信号途径的下游， 二者能够形成n - 聚体或异二聚体，通过相互作用来调节各种下游靶信号【2 9 1 。 相对来说，在盘基网柄菌细胞分化开始后不久，模式形成就开始建立。然而， 在成熟子实体形成前，没有一个祖细胞是终末分化的，它们每一个依然保留着发 育可塑性。用物理或基因手段去除蛞蝓体的一个成员，能引起细胞类型间的反分 化，使前柄细胞和前孢子细胞的比例保持恒定，信号途径间广泛的相互作用或许 是盘基网柄菌发育的主要本质，没有一条途径是排外的或是绝对的，新的挑战是 了解信号是如何整合起来以引导非极化的，对称的细胞群建立起不对称的发育模 式。 2 盘基网柄菌细胞发育中g p l s 0 分子与尿囊酸酶关系的分析 在后聚集阶段，g p l 5 0 蛋白调节另一类型的e d t a 抗性位点【3 0 1 ，通过异嗜性 粘着的相互作用来调节细胞粘着。g p l 5 0 缺失，细胞的形态发生不能进行，发育 停滞在某一阶段，最终不能形成子实体【3 l 】；而d d c a d 1 和g p 8 0 突变细胞能完 成发育，主要原因是g p l 5 0 提前表达，在细胞粘着的功能上有替代d d c a d 1 和 g p 8 0 的作用【3 2 】，因此g p l 5 0 对多细胞发育有着不可或缺的作用。 最初把g p l 5 0 看作为主要的伴刀豆球蛋白a ( c o n a ) 结合糖蛋白【3 2 】。在细胞 发育1 0 h 能检测到g p l 5 0 蛋白，1 2 h 时细胞处于疏松结合阶段，出现依赖g p l 5 0 蛋白的细胞粘着【3 3 1 。随着发育进程，g p l 5 0 明显增加【3 4 1 。研究证实l a g c 基因编 码g p l 5 0 分子，一个9 7 k d 蛋白，被高度糖基化后，s d s p a g e 电泳结果为1 5 0 k d 。 数据库显示g p l 5 0 有潜在的m t 序列，有哺乳类p l e x i n 和m e t 受体蛋白中发现 的免疫球蛋白样折叠阱】。它们是异嗜性细胞粘附分子，但它们配体的性质还很不 清楚【3 4 j 。g p l 5 0 通过这种细胞间异嗜性粘着的相互作用来调节细胞的粘着，以此 调节细胞类型分化【3 3 】。 2 1g p l s 0 分子在盘基网柄菌细胞发育中的作用 g p l 5 0 是l a g c 基因的表达产物，剔除l a g c 将导致细胞发育停止在松散聚集 期，细胞外基质成分不能合成，细胞分化停止【3 5 】。研究表明，除了在形态发生过 程中建立粘附环境，g p l 5 0 在细胞类型确定和分化过程中也起着重要的作用。l a g c 信号途径包括c o m c 和l a g d 基因，当敲除以上基因的细胞分别与野生型细胞嵌 合培养时，最终都能形成孢子。但是，当以上三种基因的突变细胞两两嵌合培养 时，都不能最终分化形成孢子【3 6 1 。这说明这三种基因功能是作用于相同的信号途 径，转录和功能试验都证明c o m c 抑制l a g c 的表达，而l a g d 和l a g c 是相互影响 的，l a g c 处于这个信号网络的末端。关于l a g c 的下游，目前已了解到，超表达 g b f ( g - b o xb i n d i n gf a c t o r ) 能弥补缺失l a g ( 2 引起的表型缺陷。g b f 是一种调节 聚集末期基因转录的转录因子，它能调节l a g c 的表达，l a g ( 2 也能增强g b f 的表 达。缺失g p l s 0 或g b f 的细胞表现出相同的发育缺陷，发育停止在松散聚集期 的细胞最终分解形成单细胞【3 7 1 。 g p l 5 0 蛋白由l a g c 基因编码，多细胞发育到疏松聚集阶段，l a g ( 2 基因开始 表达，其后的整个发育阶段都有l a g cm r n a 3 8 】。细胞丘内，细胞经历了形态发 生行为的变化，在紧密结合的细胞丘表面形成一个“突出，随后“突出 伸长 成细高的指状结构，它们倒向一边，然后向蛞蝓一样在基质上爬行。“突出 是 一个组织中心，协调蛞蝓体和子实体的形态发生【3 7 】。研究发现g p l5 0 蛋白首先出 现在多细胞外周【州，因此从空间位置上来说，g p l 5 0 与多细胞的外膜最近，并且 它们表达的时间与这层外膜出现的时间相差不多，外膜的形成不但能使多细胞体 能在一个相对独立的微环境内完成发育，而且使多细胞体真正进入细胞分化阶段 【3 9 1 。在发育过程中，整体结构出现空间区域的划分，它限定特定区域内细胞群密 切关联在一起，然后向特定方向发育，因此空间区域的划分就限定了不同区域内 细胞的发育前途。 g p l 5 0 分布位置明显地把多细胞体分成两个部分，前一部分是前柄细胞区， 后一部分是前孢子细胞区；并且随着发育进程，g p l 5 0 在前柄细胞区逐渐增加， 而在前孢子区内是基本没有分布【3 9 】。所以单从g p l 5 0 分布的空间位置来看，该分 子与柄细胞分化有着密切关系。g p l 5 0 突变细胞不能表达前柄和前孢子细胞特异 基因；如果把g p l 5 0 突变细胞与野生型细胞混合培养，突变细胞形成柄细胞而不 是孢子细