ELISA基础知识和注意事项.ppt

2019/12/18,ELISA基础知识和注意事项,2019/12/18,类容,ELISA的基本原理和相关概念特别说说捕获法ELISA结果的影响因素ELISA结果的处理,2019/12/18,ELISA的基本原理和相关概念,将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体后，这种酶标抗原或抗体既能保留与相应抗体或抗原结合的免疫活性，又同时保留酶的活性。由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗体反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感性。,2019/12/18,ELISA的基本原理,抗原或抗体在体外结合到某种固相载体表面后，仍然能保持其免疫学活性而能相互特异性结合。,2019/12/18,抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的底物在酶的作用下显色，颜色的深浅与特异性抗体水平成比例关系，可进行定性和定量分析。,2019/12/18,ELISA的分类,测抗原：竞争法（也可用于测抗体）、双抗体夹心法。测抗体：间接法、捕获法、双抗原夹心法,2019/12/18,竞争法elisa,竞争法ELISA原理标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，标本中的抗原含量越多，结合在固相上的酶标抗原越少，显色越浅。要用于小分子抗原或半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。,2019/12/18,2019/12/18,双抗体夹心法,双抗体夹心法ELISA将特异性抗体包被于固相载体表面，与标本中相应抗原相结合，洗涤后再加入酶标的第二特异性抗体与抗原结合，加入底物后显色。检测测抗原要有至少具有2个抗原决定簇,2019/12/18,包被特异性抗体,2019/12/18,双抗原夹心法,双抗原夹心法ELISA检测标本中的总抗体（包括IgM和IgG型抗体）。将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本中特异性IgM和IgG型抗体结合，洗涤后加入酶标的特异性抗原与相应的抗体结合，洗涤后加入底物显色,2019/12/18,2019/12/18,间接法,间接法ELISA（IndirectELISA）将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本中相应特异性抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗人IgG或IgM抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子只需要变换包被抗原，就可用一种酶标二抗检测各种与抗原结合的抗体,2019/12/18,2019/12/18,捕获法,ELISA（CaptureELISA）专门用来检测IgM型抗体的方法。将抗人IgM抗体包被于固相载体表面，与标本中所有人IgM抗体结合，洗涤后加入特异性抗原与相应的特异性IgM抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗原特异性抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。,2019/12/18,2019/12/18,区别理解,检测抗原？抗体？包被什么？标记什么？,2019/12/18,间接法和捕获法比较,间接法：假阴性，假阳性捕获法：酶标抗体的要求较高,2019/12/18,间接法的假阳性,2019/12/18,间接法的假阴性,麻疹IgG,麻疹抗原,麻疹IgM,酶标抗人IgM抗体,阳性结果,假阴性结果,2019/12/18,ELISA的有关名词概念,质控血清：质控血清是为了对实验结果进行控制而配制的血清。质控血清可以是定值也可以是不定值，可以购置也可以自配。自己配制时要注意选用无脂血的血清或血浆，不能用试剂盒内的阳性对照。若用稀释的血清作为质控血清，应考虑稀释基质成分对结果的影响。因质控血清与临床标本不一致，应该注意对结果的分析，应该注意质控血清只能用于质控活动，不可用于标定仪器或评价方法。用于室内质控的质控血清一般选取CUTOFF值2-3倍的质控品。,2019/12/18,室内质控：实验室内部使用控制实验结果可靠性的一种质量控制。室间质评：用于考核各个实验室结果可靠性的一种考核，可分为国家级和地方级的室间质评。可以理解为“各个实验室的质量评比”。,2019/12/18,临界值（CUTOFF值）：临界值是判断阴阳性或有临床意义水平的数值，临界值的确定是测定大量数据后应用统计学方法确定的。许多试剂都会给出临界值或临界值的计算方法。本底：就是底色。如ELISAHBsAg，阳性显色，阴性不显色，本底就是整个阴性显色的情况。ELISA抗HBcAb，阳性不显色，阴性显色，本底就是整个阳性显色的情况。,2019/12/18,灵敏度：能检测到的分析物的最小量，表示检测下限的能力。相对灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）100%测定方法及表示方法：灵敏度标准品、质控血清、阳性标本稀释终点、血清盘（pannel）及临床标本阳性率。,2019/12/18,特异性：真阴性标本的检出能力。相对特异性=真阴性/（真阴性+假阳性）100%测定及表示方法：质控血清、血清盘、临床标本阴性率。,2019/12/18,Elisa结果的影响因素,试剂盒的选择标本加样与稀释温育洗版显色质控,2019/12/18,试剂盒的选择,同行的试剂使用情况上级部门对试剂实际使用的综合评价使用临界值质控血清进行实际检测比较,选择林敏度和准确度高、特异性强试剂盒,2019/12/18,标本,应注意避免溶血在5天内测定的血清标本可放置于4、超过一周测定的需20保存尽量避免反复冻融（少量分装）,2019/12/18,加样和稀释,加样本的准确性（个人因素和实验条件）尽可能排除主关因素（尽可能用加样枪，避免直接使用滴瓶）各种试剂盒标本的稀释使用，严格按照说明是操作,2019/12/18,温育,温度水浴箱发硬板应漂浮于水上或水面应高于反应板,2019/12/18,洗版,手洗洗板机（微孔液体残留45s）,2019/12/18,显色,通常是A、B两种液体，不稳定，又颜色应立即丢弃先加A后加B，显色时间严格按说明书进行终止后15内比色,2019/12/18,质控,室内质控血清即刻法,2019/12/18,ELISA试剂的常见问题原因及其解决,显色浅，灵敏度低假阳性多，本底高甚至花板重复性不好白板,2019/12/18,显色浅灵敏度低,2019/12/18,2019/12/18,假阳性多，本底高甚至花板,2019/12/18,2019/12/18,重复性不好,2019/12/18,白板,2019/12/18,结果处理,OD值出现负值阴性对