（动物学专业论文）人类camp依赖型蛋白激酶抑制因子基因的克隆及特征分析.pdf

人类c a m p 依赖型蛋白激酶抑制因子基因的克隆及特征分析 摘要 7c a m p 依赖型蛋白激酶在细胞的代谢，离子通道和基因转录中发挥着非常重要 的功能。c a m p 依赖型蛋白激酶抑制因子是一种能够穿梭于核膜内外，并能特异地与 游离的c a 肝依赖型蛋白激酶的催化亚基结合，从而抑制该亚基的催化活性。由于 人的c a m p 依赖型蛋白激酶的催化亚基目前被发现有3 种( c 。、c 。、c ，) ，而只有一 种人的c a m p 依赖型蛋白激酶抑制因子基因被克隆，从而需要找到人体中存在的其 它类型的c a m p 依赖型蛋白激酶抑制因子，以便于深入探讨c a m p 依赖型蛋白激酶的 ，矿 调控机制，以及这种调控机制同人类疾病的关系。) 本研究采用生物信息学分析方法 和实验分析技术，克隆和鉴定了两个人类c a m p 依赖型蛋白激酶抑制因子基因p k i b 和p k i g , 并对p k i 家族中三个成员( p k i a ，剧和p k i g ) 和p k a ( c 。、c 。、c ，) 三个催化亚基的组织表达谱进行了比较分析。 p k i bc d n a 全长1 0 2 9 b p ，含一个编码7 8 个氨基酸的开放读框，g e n b a n k 注册 号为a f 0 8 7 8 7 3 ，被人类基因命名委员会( h u m a ng e n en o m e n c l a t u r ec o m m i t t e e ) 命名为“p r o t e i nk i n a s e ( c a m p d e p e n d e n t ，c a t a l y t i c ) i n h i b i t o rb e t a ”。蛋 白质序列分析表明，它与鼠的c a m p 依赖型蛋白激酶抑制因子p k i b 氨基酸序列一 致率达7 0 。p k i gc d n a 全长1 1 8 5 b p ，含一个编码7 6 个氨基酸的开放读框， g e n b a n k 注册号为a f l1 5 9 6 6 ，被人类基因命名委员会( h u m a ng e n en o m e n c l a t u r e c o m m i t t e e ) 命名为“p r o t e i nk i n a s e ( c a m p d e p e n d e n t ，c a t a l y t i c ) i n h i b i t o r g a m m a ”。蛋白质序列分析表明，它与鼠的c a m p 依赖型蛋白激酶抑制因子p k i g 氨 基酸序列一致率达9 0 根据来自不同物种中该基因家族成员的1 1 个o r t h o l o g 的 同源比较，发现了删船和p k i g 同该家族中的其它成员一样具有一个假底物结合 位点结构域( f x 。r x g r 。n a ) 和一个富含亮氨酸的核输出信号结构域( l x l x l x ：l x h y ) 。分 别用p k i b 和p k i g 的核酸序列搜索人基因组序列库，找到它们相应的基因组序列并 发现p k i b 由5 个外显子组成，而p k i g 仅由2 个外显子组成。利用辐射杂种细胞 技术( g e n e b r i d g e 4p a n e l ) ，发现p k i b 定位于人染色体6 q 2 1 2 2 1 ，在染色体位 标d 6 s 4 0 8 和d 6 s 4 0 7 之间。同样采用辐射杂种细胞技术( s t a n f o r dg 3p a n e l ) ，发 现p k l 6 定位于人染色体2 0 q 1 3 1 2 1 3 1 3 ，在位标s h g c - 3 3 9 2 2 和s h g c - 2 7 9 5 之间。 n o r t h e r n 杂交显示人c a m p 依赖型蛋白激酶抑制因子基因家族中的三个成员 ( p k i a , p k i ba n d 删在人1 6 种组织中的表达谱有明显的差异。p k i b 基因有 1 9 k b 和1 4 k b 两个转录本。其中1 9 k h 的转录本只在胎盘和大脑组织中高度表达。 而1 4 k b 的转录本则广泛表达，在胎盘中表达量最高，其次是大脑，心脏。肝脏和胰 脏，再其次是肾脏，骨骼肌和大肠，在其它8 种组织中几乎不能被检测到。p k i g 基 因则只有一个1 5 k b 的转录本在1 6 种组织中广泛表达，除了在心脏中高度表达和 在胸腺和外周血白细胞中几乎不表达以外，在其它组织中都有或多或少的一定程 度的表达量。比较特别的是p k i a 只在心脏和骨骼肌中表达，而且在两种组织中都 有3 3 k b 和1 5 k b 两个转录本。为进一步探索p k i 与p i c a 的关系，本研究还检测 了人c a m p 依赖型蛋白激酶催化亚基的三个成员( c 。、c 。、c ，) 在人1 6 种正常组织 中的表达谱，发现这三个成员在1 6 种组织中的表达也存在非常显著的差异性。 基因有3 o k b 和2 o k b 两个转录本。其中2 o k b 的转录本只在肺和脾脏组织中高 度表达。而3 0 k b 的转录本则广泛地高度表达，在脾脏和小肠中表达量最高。o 基因则只有个5 7 k b 的转录本在1 6 种组织中广泛表达，在脑中表达量最高。在 脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、大肠和外周血白细胞中中度表达，而 在其它7 种组织中表达量非常低。g 在1 6 种组织中都有或多或少的表达。值得 注意的是g 在睾丸组织中有3 2 k b 和2 0 k b 两个转录本，而在其它被检测的1 5 种组织中则只有一个3 2 k b 的转录本。而且g 睾丸中的表达量远远地高于在其它 组织中的表达量。 以上结果为研究人类c a m p 依赖型蛋白激酶抑制因子基因家族的功能，c a m p 依 赖型蛋白激酶的调控机制以及c a m p 依赖型蛋白激酶抑制因子与人类疾病之间的关 系提供了有价值的资料。、，j 7 关键词：蛋白激酶抑制因子、基因克隆、r h 定位、组织表达谱、p k a 催化亚基 中图分类号“q 7 5 。 蔓t 大掌日| 士掌t 惶文 郑利华 c l o n i n g a n dc h a r a c t e r i z a t i o no fh u m a n c a m p - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s ei n h i b i t o rg e n e s a b s t r a c t t h ec a m p d e p e n d e n t p r o t e i nk i n a s e ( p k a ) h a sb e e n d e m o n s t r a t e dt o p l a y i m p o r t a n tr o l e si nv a r i o u sc e l l u l a ra c t i v i t i e s s u c ha sm e t a b o l i s m ，i o nt r a n s p o r t ，a n d g e n et r a n s c r i p t i o n t h ep r o t e i nk i n a s ei n h i b i t o r ( p k i ) i sap r o t e i nt h a tc a ns h u t t l e b e t w e e nn u c l e a rm e m b r a n ea n db i n ds p e c i f i c a l l yw i t hi s o l a t e dc s u b u n i t so fp k aa n d h e n c ei n h i b i tt h ea c t i v i t yo ft h ec s u b u n i t s r e c e n ts t u d i e so nt h em o l e c u l a rs t r u c t u r e o f h u m a np k ah a v e p r o v e dt h a ti t sc s u b u n i ti n c l u d e st h r e ei s o f o r m s ( c 。，c 6 ，cv ) b u t o n l yo n eh u m a np k g e n eh a sb e e nc l o n e d t h ei d e n t i f i c a t i o no fa d d i t i o n a lh u m a n p k lw i l lb ee s s e n t i a li no r d e rt os y s t e m a t i c a l l ye l u c i d a t et h er e g u l a t o r ym e c h a n i s mo f p k aa n di t sr e l a t i o n s h i pt oh u m a nd i s e a s e s i nt h i ss t u d y ，t h r o u g ht h ec o m b i n a t i o no f b i o i n f o r m a t i c st o o l sa n dw e t - l a be x p e r i m e n t s ，t w on o v e lh u m a n p 融g e n e s ，p k i b a n d p k i g w e r ec l o n e da n dc h a r a c t e r i z e d i na d d i t i o nt h ee x p r e s s i o np a t t e r n so ft h r e ep g e n e s ( p _ w a ，p k i ba n dp r d g ) a n d t h r e ec a t a l y t i cs u b u n i tg e n e so f p k a ( c 。，c 口，c ，) w e r e a n a l y s e d t h ee d n ao fp k i bi so f1 0 2 9 b p ，c o n t a i n i n ga no r f e n c o d i n g7 8r e s i d u e s i t w a sd e p o s i t e di ng e n b a n ka st h ea c c e s s i o nn oa f 0 8 7 8 7 3a n dw a s n a m e d “p r o t e i n k i n a s e ( c a m p - d e p e n d e n t ，c a t a l y t i c ) i n h i b i t o rb e t a ”b yh u m a n g e n en o m e n c l a t u r e c o m m i t t e e ( h g n c ) t h ed e d u c e dp e p t i d es e q u e n c ei s7 0 i d e n t i c a lw i t hm o u s ep k i b e t a t h ee d n ao fp k i gi so f 11 8 5 b p ，c o n t a i n i n ga no r fe n c o d i n g7 6r e s i d u e s i t w a sd e p o s i t e di ng e n b a n ka st h ea c c e s s i o nn oa f l1 5 9 6 6a n dw a sn a m e d “p r o t e i n k i n a s e ( c a m p - d e p e n d e n t ，c a t a l y t i c ) i n h i b i t o rg a m m a ”b yh g n c t h ed e d u c e d p e p t i d es e q u e n c e i s9 0 i d e n t i c a lw i t hm o u s ep k i g a m m a t h e c o n s e r v e d p s e u d o s u b s t r a t es i t e ( f x 4 r x g r 2 n a ) a n dl e u c i n e r i c h n u c l e a re x p o r ts i g n a lm o t i f ( l x l x l x 2 l x h y ) w e r ed e f i n e df r o mt h e 11 e x i s t i n gp k io r t h o l o g sf r o mv a r i o u s o r g a n i s m s t h eg e n o m e s t r u c t u r eo f p k i ba n dp k i gw e r ec h a r a c t e r i z e db ys e a r c h i n g t h eh u m a n g e n o m es e q u e n c e d a t a b a s ei nn a t i o n a lc e n t e rf o r b i o t e c h n o l o g y i n f o r m a t i o n a sar e s u l t ，p k i bw a sf o u n dt ob ec o m p r i s e do f5e x o n sa n dp k i g o n l y 3 ，：j l 掌硕士掌位匏- 文郑耳口华 2e x o n s t h ep k i ba n dp k i gg e n e sa r e r e s p e c t i v e l ym a p p e d t oc h r o m o s o m e 6 q 2 1 - 2 2 1 b e t w e e nm a r k e rd 6 s 4 0 8a n dd 6 s 4 0 7 ，u s i n gar a d i a t i o nh y b r i dg b 4 p a n e l a n dt oc h r o m o s o m e 2 0 q 1 3 1 2 - 1 3 1 3 b e t w e e nm a r k e rs h g c 一3 3 9 2 2a n d s h g c - 2 7 9 5 ，u s i n g as t a n f o r dg 3 p a n e l n o r t h e r nb l o ta n a l y s i so ft h r e ep g e n e sr e v e a l e ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si nt h e i r e x p r e s s i o np a t t e r n s p k i b h a dt w ot r a n s c r i p t so f1 9 k ba n d1 4 k b t h e1 9 k b t r a n s c r i p tw a so n l ya b u n d a n t l ye x p r e s s e di np l a c e n t aa n db r a i n a n dt h e1 4 k bw a s e x p r e s s e dw i d e l y ，m o s ta b u n d a n ti np l a c e n t a ，h i g hi nb r a i n ，h e a r t ，l i v e r ，p a n c r e a s ， m o d e r a t ei nk i d n e y ，s k e l e t a lm u s c l ea n dc o l o n ，a n dv e r yl i t t l ei nt h eo t h e re i g h tt e s t e d t i s s u e s p k i gw a s w i d e l ye x p r e s s e da sa1 5 k bt r a n s c r i p tw i t hh i g h e s tl e v e li nh e a r t ， h a r d l yd e t e c t e d i n t h y m u sa n dp e r i p h e r a lb l o o dl e u k o c y t e ，a n d w a sm o d e r a t e l y e x p r e s s e d i nt h eo t h e rt e s t e dt i s s u e sw i t hs l i g h t l yd i f f e r e n tl e v e l s h o w e v e r ，p k i aw a s s p e c i f i c a l l ye x p r e s s e da s t w ot r a n s c r i p t so f3 3 k ba n d1 5 k bi nh e a r ta n ds k e l e t a l m u s c l e f o rf u r t h e rs t u d yo fp k i sr e l a t i o n s h i pw i t hp k a ，t h ee x p r e s s i o np a t t e r n so f t h et h r e ec a t a l y t i cs u b u n i t so fp k aw e r ea l s od e t e r m i n e da n df o u n dv e r yd i f f e r e n t f r o me a c ho t h e r c 。h a dt w o t r a n s c r i p t so f3 0 k ba n d2 0 k br e s p e c t i v e l y t h ef o r m e r w a sw i d e l ye x p r e s s e dw i t h h i g h e s tl e v e li ns p l e e na n ds m a l li n t e s t i n e t h el a t t e rw a s o n l ye x p r e s s e di nl u n ga n ds p l e e n c 口h a dau n i q u e 5 7 k bt r a n s c r i p tm o s ta b u n d a n ti n b r a i n ，m o d e r a t ei ns p l e e n ，t h y m u s ，p r o s t a t e ，t e s t i s ，o v a r y ，s m a l li n t e s t i n e ，c o l o na n d p e r i p h e r a lb l o o dl e u k o c y t e ，a n dl o w i no t h e rt e s t e dt i s s u e s c r w a sw i d e l ye x p r e s s e d a sa3 2 k b t r a n s c r i p t a n du n i q u e l y e x p r e s s e da s a2 0 k b t r a n s c r i p t i nt e s t i s t h e e x p r e s s i o nl e v e li nt e s t i sw a sp r o m i n e n t l yh i g h t h ea b o v er e s u l t sa r ev a l u a b l ei n f o r m a t i o nf o rf u r t h e rs t u d yo ft h ef u n c t i o no f c a m p d e p e n d e n tp r o t e i n k i n a s ei n h i b i t o r g e n ef a m i l y ，t h e d e t a i l e d r e g u l a t o r y m e c h a n i s mo f c a m p - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s ea n d t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e np k ia n d h u m a nd i s e a s e s k e y w o r d s ：p r o t e i n k i n a s ei n h i b i t o r 、g e n e c l o n i n g - r hm a p p i n g 、t i s s u ee x p r e s s i o n p a t t e r n 、p k ac a t a l y t i cs u b u n i t 前言 c a m p 依赖型蛋白激酶( c a m p d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e ，p k a ) 是由两个催化 亚基( c a t a l y t i cs u b u n i t ，c - s u b u n i t ) 和两个调节亚基( r e g u l a t o r ys u b u n i t r - s u b u n i t ) 组成的四聚体”1 。完整的四聚体是没有活性的，只有当细胞内的c a 肝 信号分子增多时，c a m p 分子与调节亚基特异结合，从而催化亚基脱离四聚体而游 离在细胞内，在细胞质或核内发挥激酶的催化活性，参与细胞的代谢，转录调控 等过程。c a 肝依赖型蛋白激酶抑制因子( c a m p - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e i n h i b i t o r ，p k i ) 是一类能够特异地与游离的c a m p 依赖型蛋白激酶的催化亚基结 合而抑制其催化活性的蛋白，但是不能抑制c g m p 依赖型蛋白激酶，蛋白激酶c ，磷 酸化酶激酶，酪蛋白激酶和肌球蛋白轻链激酶1 。除此，c a m p 依赖型蛋白激酶抑 制因子还能够穿梭于核膜内外，并能将游离于核内的p k a 催化亚基运输出细胞核， 使游离的催化亚基重新与调节亚基结合，形成不具激酶催化活性的四聚体。4 。 目前为止，对人和小鼠的c a m p 依赖型蛋白激酶的研究表明人或小鼠的p i c a 调 节亚基共有四种亚型，分别是r iq ，r ib ，r i ia ，r i ib ，而催化亚基共有3 种亚型，分别是c 。、c 。、c 。”1 。在小鼠体内，已经有三种c a 肝依赖型蛋白激酶抑 制因子基因( 助j 口，尸七j 口，a n dp k iy ) 被克隆。”，并且发现三种抑制因子对不同 的催化亚基( c 。、c 。c ，) 可能有抑制的偏爱性”1 。而至今只有一种人的c a m p 依赖 型蛋白激酶抑制因子基因( 本文中的，肌锄被克隆，但我们推测人体中也存在着 其它类型的c a m p 依赖型蛋白激酶抑制因子。 本研究利用生物信息学分析方法和实验分析技术，如期望的那样，分别从人 胎盘和心脏e d n a 文库中克隆和鉴定了两个新的c a m p 依赖型蛋白激酶抑制因子基 因，p k i b 和p k i g o 还分析比较了c a m p 依赖型蛋白激酶抑制因子基因家族中的三 个成员和c a m p 依赖型蛋白激酶的三个催化亚基在成人1 6 种正常组织中的表达谱。 材料和方法 一研究策略和技术路线如图1 所示 分别以小鼠的p k i b 和，* 冶的e d n a 序列为出发片段 生物信息学方法 搜索n c b i 的g e n b a n kh u m a ne s t 数据库，将同源的e s t 片段拼接成两个重叠群 根据上述两个重叠群分别设计引物，e d n a 文库中p c r 扩增，产物克隆并测序 生物信息 学分析 物信息 l r h 方法 n o r t h e 分析l 杂 推导蛋白质ll 基因组结 的一级结构ll 构分析 图1 研究策略和技术路线示意 染色体 定位 6 月基因的 组织表达谱 克隆鉴定p k a 激酶 的三个催化亚基基 因，n o r t h e r n 杂交 催化亚基基因 的组织表达谱 复j l 大掌硕士掌位论文郑利华 二材料与设备 a 分子生物学实验材料及试剂 1 p c r 引物( 上海生工生物工程有限公司合成) ( 1 ) 根据c o n t i g l 设计p k i b 的克隆引物： l z b 。：5 一g c ca g gg a ga g ga a ag a ta g ga g - 3 l z b ：5 一c a ca t gc t gc t ta g gg c tg c aa t g - 3 ( 2 ) 根据p k i bc d n a 序列设计r h 定位引物： l z b r h 。：5 一g t aa c tg t gg t aa c at t gc a gc c - 3 l z b r h 。：5 一c 从a c ac a ct c ta t cc a tg t ga g 一3 ( 3 ) 根据c o n t i 9 2 设计p k i g 的克隆引物： l z g ，：5 一a c ag g cc t ga g ga g cg a tg c ac 一3 l z g 2 ：5 一g g ag c tc a ga g aa g ag g ct g ct g 一3 ( 4 ) 根据p k i gc d n a 序列设计r h 定位引物： l z g r h ，：5 一t c tg a cc t tg t cc 从g 从g g ct g 一3 l z g r h ：5 - g t cc t ag g tg t ca c tt a tc c tg g 一3 ( 5 ) 根据已知的p k i a 序列设计p k i a 的克隆引物： l z a ，：5 - c c tg c ta t gt g ga t at t tg g ta g - 3 l z a ：5 一g g tt c ct g ca a tg c ag c ac a gc c a 一3 ( 6 ) 根据已知的c o t 亚基基因序列设计的引物： p k a c a l ：5 - a t gg g c 从cg c cg c cg c cg c c 从一3 p k a c a 2 ：5 - a c tt c tc a tt g at g ga g ac c cg g - 3 ( 7 ) 根据已知的c d 亚基基因序列设计的引物： p k a c b i ：5 - t c tt g cc a tc g cc c ca g ac a tg g 一3 p k a c b 2 ：5 一g g tc t ca g ct c ta c ct t at c tc t c 一3 ( 8 ) 根据已知的c y 亚基基因序列设计的引物： p k a c g i ：5 - t a gt c gt a gt t cc c gt a gt a tg g 一3 p k a c g 2 ：5 - a c aa g ca c ac c cc t aa a ac t ca g 一3 ( 9 ) p g e m - t 载体的正反向引物： 7 f 2 ：5 一c g cc a gg g tt t tc c ca g tc a cg a c 一3 r 2 ：5 一t c aa c aa g ga a ac a gc t at g ac - 3 2 人8 种组织c d n a 文库( 脑、骨骼肌、睾丸、肾、骨髓、肝、胎盘和外周血白 细胞，c l o n t e c h 公司) ：文库载体分别为噬菌体九g t l o 及垤t l l ，滴度为3 9 1 0 9 m l 。 3 人9 种组织c d n a 文库( 脑、心、肺、肾、骨骼肌、睾丸、t 细胞、骨髓和胎 盘，g i b c ob r l 公司) ：文库载体为质粒s u p e r s c r i p t “。 4 p c r 扩增试剂盒( 上海p r o m e g a 公司) 5 d n a 测序试剂盒( p e 公司) 自动测序，b i g d y et e r m i n a t o rc y c l es e q u e n c i n gr e a d yr e a c t i o n 。 6 p c r 产物纯化试剂盒( q i a g e n 公司) 7 p c r 标记试剂盒( a m e r s h a m 公司) 。 8 质粒抽提试剂盒( b o e r h r i n g e rm a n n h e i m 公司) 9 柱离心式胶回收试剂盒( b o e r h r i n g e rm a n n h e i m 公司) 1 0 放射性0 【一3 2 p - d a t p ( a m e r s h a m 公司) 1 1 人体1 6 种组织m r n an o r t h e r n 印迹膜( m u l t i p l et i s s u en o r t h e r nb l o t ， c l o n t e c h 公司) ，包括m t ni 和m t ni i ，载有的m r n a 分别来自心脏、脑、胎 盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾、胰腺、脾、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、 结肠粘膜和外周血白细胞等1 6 种组织。 1 2 人鼠体细胞辐射杂种板g e n e b r i d g e4 ( r e s e a r c hg e n e t i c s 公司) 。 1 3 人鼠体细胞辐射杂种板s t a n f o r dg 3 ( r e s e a r c hg e n e t i c s 公司) 。 1 4 克隆载体和宿主菌： 质粒p g e m t 载体( p r o m e g a 公司) 大肠杆菌j m l 0 3 ( 本室保存) 大肠杆菌j m l 0 9 ( p r o m e g a 公司) 大肠杆菌b l 2 1 ( p h a r m c i a 公司) 大肠杆菌d h 5d ( 本室保存) 1 5 各种限制性内切酶为p r o m e g a 公司、b i o l a b 公司和华美生物工程公司。t 4d n a 连接酶为p r o m e g a 公司产品。 ，：l 大学士掌位饨文郑耳9 j 1 6 各种溶液： l b 培养基( p h7 0 ) ：1 p o l y p e p t o n e ( d i f c o 公司) ，0 5 b a c t o y e a s te x t r a c t ( d i f c o 公司) ，1 n a c l 。 n o r t h e r n ( 预) 杂交液：5 0 甲酰胺，5 xs s p e ，l o xd e n h a r d t 液，2 s d s ，c t d n a ( 1 0 0 斗g m 1 ) 。 其它常用试剂：1 0 s d s ，2 0 x s s c ( 3mn a c l ，0 3h l 柠檬酸三钠，p h7 o ) ， 0 5me d t a ，imt r i s h c i ，t e ，x - g a l ( 2 0m g m l ，二甲基甲酰胺配制) ， 1 0 0m mi p t g 、3 mn a h c ，5mn a t l ，等参照分子克隆实验指南配制。 b 生物信息学分析软件和数据库 1 w i s c o n s i np a c k a g e ( v e r s i o n1 0 0 ，g e n e t i c sc o m p u t e rg r o u p ( g c g ) ，u s a ) 2 c l u s t a l wm u l t i p l e s e q u e n c ea 1 i g n m e n t p r o g r a m ( v e r s i o n1 8 ，j d t h o m p s o n ，e t c ) 3 s e q u i n ( v e r s i o n2 7 ，n a t i o n a lc e n t e rf o rg i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n ， u s a ) 4 g e n b a n k 数据库和b l a s t 序列数据库搜索软件( n a t i o n a lc e n t e rf o r b i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n ，u s a ) ：b ! ! p ；翌型：! b i ：! 里：n i b ：g ! ! 5 p d b 数据库( p r o t e i nd a t ab a n k ) ：h t t p ：w w w r c s b o r g p d b 6 t h ee s tm a c h i n e ：h ! ! p ；z ! ! ! 型：! i 9 2 里：i ! z e ! 坐h i n ! ：h 里1 7 o m i m ( o n l i n em e n d e l i a ni n h e r i t a n c ei nm a n ，n a t i o n a lc e n t e rf o r b i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n ，u s a ) ：n ! ! q ；! ! 型：! b i ：! ! ! ：i b ：g ! ! q 里i ! 8 s a n g e r r h m a p p i n g s e r v e r： b ! ! p ；! ! 塑! a n g ! ! ：i ! ：女k ! ! ! ! i ! ! b h ；! ! ! ! b h ! ! ! ! ! ：! h ! 里1 9 s t a n f o r dh u m a ng e n o m ec e n t e rr hs e r v e r ： h 主兰乜；! ! ! 型= 兰b g 曼：墨! 旦卫f q ! 鱼：曼亟坠星h h ! 曼! 皇! f q ! 盟卫星塑：b ! 里1 1 0 g e n o m e d a t a b a s e ：b ! ! e ；! ! 盟：g g b ：! ! g i i m e m e ( m u l t i p l e e mf o rm o t i fe l i c i t a t i o n ，v e r s i o n2 2 ) ： 垒羔! 巳；里皇里皇：呈堕曼：旦亟坚里旦里旦曼里b 墨i ! 望 】2 h u m a ng e n en o m e n c 】a t u r ed a t a b a s e： 9 主要仪器设备： o r i g i n 2 0 0 ，o c t a n e ，0 2 工作站( s i l i c o ng r a p h i c 公司( s g i ) ) p c r 扩增仪：p t c 一1 5 0 、p t c 一2 0 0 型( 耵r e s e a r c h 公司) ；p e9 6 0 0 型( p e 公司) 杂交反应箱( 英国h y b a i d 公司) a b l 3 7 7 型全自动d n a 测序仪( p e 公司) 微型同位素检测仪：m i n i - m o n i t o rs e r i e s9 0 0 型( m i n i i n s t r u m e n t s 公司) 微量加样器：1 0 0 0 “i 、2 0 0 “i 、2 0 u 1 规格各一支( 法国g i l s o n 公司) 凝胶成像装置及软件：f r 一2 0 0 ( 上海复日公司) 和s m a r tv i e w3 0 凝胶成像及扫描分析软件：a n n u t a t i n gg r a b b e r - i t 2 5 1 及u v pg e l w o r k si d a d v a n c e dv e r s i o n2 5 1 p c g e n e 软件包( u n i v e r s i t yo fg e n e v a ，r e l e a s e6 7 ) 三方法 1 c d n a 序列的克隆和测序 以鼠的肼j 基因c d n a 序列为出发序列，用b l a s t n 程序在人的e s t 数据库搜 索同源序列，利用e s ta s s e m b l y 将得到的同源序列拼接成重叠群。根据e s t 拼接 得到的重叠群序列设计引物，以多种人组织c d n a 文库为模板进行p c r 扩增( 反应 体系和条件见图2 ) ，产物通过1 琼脂糖胶电泳检测p c r 产物大小及特异性，目的 p c r 产物经p c r 产物纯化试剂盒( 按操作手册) 或柱离心式胶回收试剂盒( 按操作 手册) 纯化后克隆至p g e m t 载体( 连接体系和条件见图3 ) ，转化大肠杆菌，测序 验证( p e 公司a b l 3 7 7 自动测序仪，反应体系和条件见图4 ) 。用b l a s t 程序“1 在 g e n b a n k 数据库中查新。向g e n b a n k 递交序列注册申请，h u m a ng e n e n o m e n c l a t u r e c o m m i t t e e ( h g n c ) 递交命名申请。 2 推导蛋白质的一级结构分析 利用w i s c o n s i np a c k a g e ，参考同源序列，分析得到推导的读框。以推导的蛋 白质序列，用b l a s t p 搜索g e n b a n kn r 数据库，得到不同物种的相应序列；利用 c l u s t a l w ”“1 对不同物种的相应序列做多重联配，以了解序列间的同源关系；利用 c 1 2 3 4 5 6 7 8 ，二e 犬掌士学位论文 郑利华 m e m e 程序“1 对多物种相应序列做m o t i f 分析。 p c r 扩增反应体系： d n a 模板 2 5 r a m 引物1 2 5 m m 引物2 1 0 x b u f f e r 2 0m md n t p s 2 5m mm g c l2 t a q 酶( 5 u p 1 ) 1 0i x l 1 0u l 1 0u 1 5 0u l 1 0u l 1 5u 1 1 0u 1 加d d h z 0 至5 0 0u l p c r 扩增反应条件： 9 3 3 m i n - + 9 3 x l m i n - - - 6 0 x 4 5 s - - 7 2 lm i n _ 7 2 5m i n 图2 克隆基因时的p c r 反应体系和反应条件 连接体系 p c r 产物( 5 0 n g ) p g e m t 载体( 5 0 n g ) t 4d n a 连接酶l o x b u f f e r t 4d n a 连接酶( 1w e i s su n i t 9 1 ) 1 0u l 1 0 “l 1 0u l 1 0u l 加d d h 2 0 至 连接条件：1 4 1 6 连接过夜 图3 p c r 产物与p g e m t 载体连接体系及条件 1 0 0u l ，：苴大掌日f 士掌位t e 文郑利牛 测序反应体系 商品化m i x t u r e 引物 质粒p c r 产物 4 0u 1 1 6p m 0 1 2 0 0 4 0n g 加d d h 2 0 至 1 0u 1 反应条件：9 4 x t os e c - + 5 0 c x 5s e c _ 6 0 0 x 4m i n i i、。，一 2 5c y c l e 8 产物纯化：乙醇沉淀法，具体操作如下：1 0p l 反应产物+ 8p l 水+ 3 2 “l 无水乙醇，室 温放置0 5h ，1 5k2 0m i n 离心，弃上清，加7 0 7 , 醇2 0 0u l 洗涤，1 5k2 0m i n 离心，弃 上清，自然晾干，溶于2 - 4l a l 上样b u f f e r 中，取2u l 电泳测序。 测序胶：长3 6c m 电泳板，胶浓度为4 7 5 ，交联度( 丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰胺) 为1 9 ：1 含6m 尿素。 电泳： 1h 左右出峰，收集9h ，计算机自动采集。 图4 测序反应的体系、条件和方法 9 4 x 3 m i n - - ) 9 4 l m i n _ 6 3 1 m i n _ 7 2 x 4 0 s e c o n d - - ) 7 2 x 5 m i n 图5 p , h 定位中的p c r 反应条件 2 3 染色体定位 利用r a d i a t i o nh y b r i d 方法“。根据c d n a 的3 u t r 区域设计引物，分别用 人