（药理学专业论文）全氟化合物在斑马鱼胚胎中的毒性及毒代动力学研究.pdf

夕 i 目录 缩略词表1 摘要2 a b str a c t 4 前言6 第一章利用斑马鱼胚胎检测化合物毒性实验方法的优化及应用评价 1 材料和方法8 1 1 试剂8 1 2 仪器9 1 3 实验动物9 1 4 溶液的配制9 1 5 斑马鱼胚胎检测化合物毒性实验方法的优化1 0 1 6p f c s 在斑马鱼胚胎中的毒性实验1 1 1 7 数据分析12 2 结果12 2 1 培养板的选择12 2 2 毒液更换频率的确定13 2 3 最佳染毒起始时间的确定13 2 4p f c s 的急性毒性实验14 2 5p f c s 的亚急性毒性实验16 3 分析与讨论17 ，1；0r；0 jjo 4 ，j 、结19 第二章p f o s 在斑马鱼胚胎中的毒性效应及毒代动力学研究2o 1 材料和方法20 1 1 试剂20 1 2 仪器20 1 3 实验动物20 1 4 溶液的配制20 1 5p f o s 在斑马鱼胚胎中的毒性效应21 1 6p f o s 在斑马鱼胚胎中的毒代动力学研究2 2 1 7 数据分析2 2 2 结果2 2 2 1p f o s 在斑马鱼胚胎中的毒性效应2 2 2 2p f o s 在斑马鱼胚胎中的毒代动力学研究33 3 分析与讨论3 4 总结与展望3 9 参考文献4o 附录47 致谢4 8 综述4 9 独创性声明63 温州医学院硕士学位论文 缩略词表 缩略词英文全称中文全称 p f c s p e r f l u o r i n a t e dc h e m i c a l s全氟化合物 p f o s p e r f l u o r o o c t a n e s u l p h o n i ca c i d全氟辛烷磺酸 p f o s k p f o a p e r f l u o r o o c t a n e s u l p h o n i ca c i d p o t a s s i u ms a l t p e r f l u o r o o c t a n o i ca c i d 全氟辛烷磺酸钾盐 全氟辛酸 p f h x s k p e r f l u o r o h e x a n e s u l f o n i ca c i d全氟己烷磺酸钾盐 p o t a s s l u ms a l t p f b s k h p f d p f p b s d m s o e g f p o e c d p e r f l u o r o b u t a n e s u l f o n i ca c i d p o t a s s i u ms a l t h o u r sp o s tf e r t i l i z a t i o n 全氟丁烷磺酸钾盐 受精后小时数 d a y sp o s tf e r t i l i z a t i o n受精后天数 p h o s p h a t eb u f f e rs o l m i o n磷酸缓冲液 d i m e t h y ls u l f o x i d e二甲基亚砜 e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n t p r o t e i n o r g a n i z a t i o nf o re c o n o m i c c o o p e r a t i o na n dd e v e l o p m e n t 增强型绿色荧光蛋白 经济合作与开发组织 温州医学院硕士学位论文 全氟化合物在斑马鱼胚胎中的毒性及毒代动力学研究 摘要 全氟化合物( p e r f l u o r i n a t e dc h e m i c a l s ，p f c s ) 广泛应用于工业和生活领域中， 己经对环境和人类健康构成了严重威胁，近年来备受人们关注。其代表性化合物 全氟辛烷磺酸( p e r f l u o r o o c t a n e s u l p h o n i ca c i d ，p f o s ) 具有难降解性、生物蓄积性和 沿食物链在生物体内富集作用，已经成为一种新型的持久性有机环境污染物。目 前对p f c s 的毒性研究尚不全面，特别是在水生生物中的研究相对较少，且p f o s 在斑马鱼仔鱼中的行为毒性和毒代动力学研究在国内外还未见报导。 本文以斑马鱼胚胎为实验材料，优化了利用斑马鱼胚胎检测化合物毒性的实 验方法，并以五种p f c s 为研究对象，进行了急性和亚急性毒性实验，结果表明， 自6 h p f 染毒至1 2 0 h p f ，p f o s 在p f c s 中的毒性最大，其半数致死浓度( l c 5 0 ) 和 半数致畸浓度( e c 5 0 ) 分别为4 3 8 9 9 m 和2 2 3 0 h m ，胚胎内p f o s 的含量随着染毒 浓度的升高而升高。 p f o s 在胚胎中主要致畸效应为脊柱弯曲，主要表现为脊柱侧凸和脊柱后凸。 p f o s 降低了斑马鱼胚胎的心率和孵化率，且对斑马鱼胚胎的自主运动有影响。 利用吖啶橙染色技术检测2 4 h p f 胚胎内细胞凋亡，结果显示大量的细胞凋亡出现 在脑部、眼睛和尾部。病理组织切片结果表明p f o s 会导致尾部肌肉纤维断裂、 排列紊乱。利用f l i 1 ：e g f p 转基因斑马鱼胚胎检测p f o s 染毒后的血管形态， 结果显示躯干血管有断裂、交叉、甚至缺失的现象。行为学研究中，基本活力测 试结果表明，胚胎自6 h p f 染毒至9 6 h p f 后脱毒的斑马鱼仔鱼，第5 天的活力呈 “倒u 型”，即低浓度表现为刺激活力，高浓度抑制活力；但在6 d p f 用不同浓度 的p f o s 对胚胎染毒1 h ，其活力表现为随着染毒浓度上升而升高的趋势；光刺 激测试中，p f o s 染毒后胚胎与对照组没有显著差异。这些结果说明p f o s 在斑 马鱼胚胎中有发育和潜在的神经毒性。 为研究p f o s 在胚胎中的染毒窗1 2 效应，以2 4 h 间隔( 1 2 5 h p f 、2 5 4 9 h p f 、 4 9 7 3 h p f 、7 3 9 7 h p f 、9 7 1 2 1 h p f ) 对胚胎进行不同发育阶段的染毒，结果表明各 组胚胎在脱毒后毒性作用不可逆，9 7 1 2 l h p f 的染毒窗1 2 胚胎畸形率最高，p f o s 体内蓄积量也最大，且泳速最低。 为考察p f o s 在斑马鱼胚胎体内的毒代动力学特征，以4 9 mp f o s 对l h p f 的斑马鱼胚胎进行暴毒，分别在染毒后2 ，4 ，6 ，1 0 ，2 4 ，4 8 ，7 2 ，9 6 和1 2 0 h 进行测定，结果显示染毒时间越长，吸收速率越高。这表明前期的绒毛膜对毒物 的吸收有一定的阻挡作用，且随着后期器官发育逐渐完善，吸收功能也渐渐增强。 以1 6 9 mp f o s 自脱膜胚胎6 h p f 染毒至3 6 h p f 后脱毒，每隔2 4 h 进行测定，结果 温州医学院硕士学位论文 显示在整个的清除时问内，胚胎内浓度处于一个相对稳定的状态，且p f o s 在胚 胎中基本没有被清除，说明p f o s 在斑马鱼胚胎中易吸收难消除。p f o s 对水生 生物、环境及人群的健康风险不容忽视。 关键词：斑马鱼胚胎；p f o s ；毒性；染毒窗口；行为；活力；毒代动力学 一 温州医学院硕士学位论文 t o x i c i t ya n dt o x i c o k i n e t i c si nz e b r a f i s he m b r y o sf o l l o w i n g e x p o s u r et op e r f l u o r i n a t e dc h e m i c a l s a b s t r a c t p e r f l u o r i n a t e dc h e m i c a l s ( p f c s ) h a v et h r e a t e nt oe n v i r o n m e n ta n dh u m a nh e a l t h a n dh a v eb e e nc o n c e m e dg r e a t l yr e c e n t l yb yp e o p l eb e c a u s eo fi t se x t e n s i v e a p p l i c a t i o ni ni n d u s t r ya n dh o u s e h o l d p e r f l u o r o o c t a n e s u l p h o n i ca c i d ( p f o s ) ，a t y p i c a lc h e m i c a lo fp f c s ，h a sb e e nan e wp e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t a n t 。p f o si sh a r d t od e g r a d ea n dh a sat e n d e n c yt ob i o a c c u m u l a t et oh i g h e rt r o p h i cl e v e l si nt h ef o o d c h a i n t h er e c e n tr e s e a r c h e ss t u d i e do nt h et o x i c i t i e so fp f c sw e r en o tv e r y c o m p r e h e n s i v e ，e s p e c i a l l yi nt h ea q u a t i co r g a n i s m s n oi n f o r m a t i o no nt h eb e h a v i o r e f f e c t sa n dt o x i c o k i n e t i c sk i n e t i c ss t u d y t h ep r e s e n ts t u d yo p t i m i z e dt h em e t h o do ft o x i c i t yt e s ti nc o m p o u n d su s i n g z e b r a f i s he m b r y o s w ea l s od e t e r m i n e dt h el c s 0a n de c 5 0o ff i v ep f c si nt h ea c u t e t o x i c i t yt e s ta n ds u b a c u t et o x i c i t yt e s t t h et o x i c i t yo fp f o sw a st h em o s ts e r i o u si n t h ep f c sa f t e re x p o s u r ef r o m6t o12 0h o u r sp o s t - f e r t i l i z a t i o n ( h p f ) t h el c 5 0a t12 0 h p f w a s4 3 8 9 ma n dt h ee c s o a t1 2 0h p f w a s2 2 3 0 mf o rp f o s t h ec o n t e n to f p f o si nz e b r a f i s he m b r y o si n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n go fe x p o s u r ec o n c e n t r a t i o n z e b r a f i s he m b r y o se x h i b i t e dt h ed o m i n a n tm a l f o r m a t i o no fb e n ts p i n e ( c y p h o s i s a n ds c o l i o s i s ) a f t e re x p o s u r et op f o s p f o sd e c r e a s e dh e a r tr a t ea n dh a t c h i n gr a t e ， a n da f f e c t e dt h es p o n t a n e o u sm o v e m e n ti nz e b r a f i s he m b r y o s p f o si n d u c e dc e l l u l a r a p o p t o s i s a t2 4h p fw a sc o n s i s t e n t l yl o c a t e di nt h eb r a i n ，e y e ，a n dt a i lr e g i o no f e m b r y o su s i n ga c r i d i n eo r a n g es t a i n i n g p f o se x p o s u r ei n d u c e dl e s i o n si nt h em u s c l e f b e r sw i t hh i s t o l o g i c a le x a m i n a t i o n t h em a j o r i t ym u s c l ef i b e r si np f o st r e a t m e n t w e r eb r o k e n ，w i t had i s o r d e r e da n dl o o s e na r r a y , w h i l et h em u s c l ef i b e r si nc o n t r o l w e r el a t h ya n dc o m p a c t t h ee x p o s e de m b r y o sa p p e a r e dc r o s s e d - o v e r , c r a c k e do r a b s e n tv a s c u l a rp a t t e r n i n gi nt h i n k s i nt h eb e h a v i o r a ls t u d y , t h eb a s i ca c t i v i t ya t5d a y s p o s t - f e r t i l i z a t i o n ( d p f ) o fl a r v a lz e b r a f i s he x p o s e d f r o m6t o9 6h p fe l i c i t e da n “i n v e r t e du ”d o s e - r e s p o n s ep a t t e m t h el o wc o n c e n t r a t i o n sr e s t r a i n e da c t i v i t ya n d t h eh i g hc o n c e n t r a t i o n se x c i t e da c t i v i t y l a r v a ee x p o s e dt op f o sf o ro n l y1ha t6d p f s w a mf a s t e rw i t hi n c r e a s i n gp f o sc o n c e n t r a t i o n i nt h el i g h ts t i m u l a t i o nt e s t ，t h e r e w a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nt h ee m b r y o se x p o s e dt op f o sc o m p a r e dw i t hc o n t r 0 1 t h e s er e s u l t se l e v a t e dt h a tz e b r a f i s he m b r y o se x h i b i t e dd e v e l o p m e n t a lt o x i c i t ya n d p o t e n t i a ln e u r ot o x i c i t ya f t e re x p o s u r et op f o s 4 温州医学院硕士学位论文 i no r d e rt ot e s tw h i c hp h a s eo fe m b r y o g e n e s i si sm o s ts e n s i t i v ew i n d o w t op f o s ， z e b r a f i s he m b r y o sw e r ee x p o s e dt op f o sf o r2 4hp e r i o d sf r o m1t o12 1h p f ( 1 2 5 ， 2 5 - 4 9 ，4 9 7 3 ，7 3 - 9 7 ，a n d9 7 - l2lh p f ) l a r v a es h o w e da ni n c r e a s ep r o p o r t i o ni n m a l f o r m a t i o nw i t hn or e c o v e r yi nt h ed e t o x i f i c a t i o ne m b r y om e d i u mw a t e rf o ra l l g r o u p t h em a l f o r m a t i o nr a t ea n dt h ec o n t e n to fp f o si nt h ee m b r y o si st h eh i g h e s t ， m a dt h es w i m m i n gs p e e di st h el o w e s ti ne m b r y o s e x p o s e df r o m9 7t o121h p fw h e n c o m p a r e dt ot h eo t h e r s i no r d e re x p l o r et h et o x i c o k i n e t i c sk i n e t i c sc h a r a c t e r so fp f o si nz e b r a f i s h e m b r y o s ，e m b r y o sa tlh p fw e r ee x p o s e dt op f o s ( 4p m ) a n dt h ep f o sc o n t e n ti n z e b r a f i s hw a sd e t e r m i n e da t2 ，4 ，6 ，10 ，2 4 ，4 8 ，7 2 ，9 6 ，a n d12 0ha f t e re x p o s u r e t h e a b s o r p t i o nk i n e t i c so fp f o se x h i b i t e da u n i q u et r a i to fi n c r e a s i n gw i t ht h ee x p o s u r e t i m e t h ez e b r a f i s hc h o r i o nm a y p l a yar o l ea sap r o t e c t i v eb a r r i e rb e t w e e nt h e e m b r y oa n dt o x i c a n t s t h eo r g a n sw e r es l o w l yw h o l e s o m e ，a n dt h ea b i l i t yt oa b s o r b i n c r e a s e di nt h ep o s t - d e v e l o p m e n t t oi n d i c a t et h ee l i m i n a t i o no fp f o sf r o mt h e e m b r y o s ，t h ed e c h o r i o n a t e de m b r y o sw e r ee x p o s e dt op f o s ( 16p m ) f r o m6t o3 6 h p fa n dd e t e r m i n e de v e r y2 4h a m o n gt h ew h o l ec l e a r a n c et i m e ，t h ec o n t e n to fp f o s e n g e n d e r e dam o r eo rl e s ss t e a d y s t a t ec o n d i t i o n ，a n dt h ee l i m i n a t i o nr a t es e e m e dt o b ez e r o t h e s er e s u l t se l e v a t e dt h a tp f o sw a se a s yt ou p t a k ea n d h a r dt oe l i m i n a t i o n w ec a n ti g n o r et h eh e a t hr i s k so fp f o si na q u a t i co r g a n i s m s ，e n v i r o n m e n ta n d h u m a nh e a l t h k e y w o r d s ：z e b r a f i s he m b r y o ；p f o s ；t o x i c i t y ；e x p o s u r ew i n d o w ；b e h a v i o r ； t o x i c o k i n e t i c s 温州i 医学院硕士学位论文 1 l - j 刖吾 全氟化合物( p e r f l u o r i n a t e dc h e m i c a l s ，p f c s ) 是一类新的备受重视的环境持 久性有机污染物【ij 。自2 0 世纪5 0 年代由3 m 公司开发以来，以其优良的热稳定 性、化学稳定性、高表面活性及疏水疏油性能，被广泛应用于工业和生活领域中， 尤其足它的代表性化合物全氟辛烷磺酸( p e r f l u o r o o c t a n e s u l p h o n i c a c i d ，p f o s l 以 及其盐类更是被大规模长时间地应用在表面活性剂、润滑剂、黏合剂、泡沫灭火 剂、航空液压油、纺织、涂料、皮革、合成洗涤剂、炊具制造及农药和灭白蚁、 蟑螂药剂等诸多与人们日常生活息息相关的生产中【2 训。近年来随着对其研究的 深入，人们逐渐认识到p f o s 具有难降解性、生物蓄积性和沿食物链在生物体内 富集作用。p f c s 在野生动植物、环境水体和人体中广泛的检测到【5 - 2 2 ，而p f o s 在其中的含量最大。p f o s 在高营养级动物的肝脏中蓄积了很高的浓度，比如在 水貂肝脏中曾检测到3 6 8 0 n g g f s j ；在美国的氟化物生产基地田纳西河下游检测到 p f o s 浓度达6 0 0 n g l 2 3 1 ；加拿大一次意外释放消防灭火泡沫事件中，小溪中总 的p f c s 泄露高达1 7 0 0 0 p g l 2 u ；g i e s y 和k a n n a n 等调查了来自美国、哥伦比亚、 巴西、比利时、意大利、波兰、印度、马来西亚、韩国等9 个国家4 7 3 份人全血、 血清及血浆中的p f c s 的含量。在这几种检测物中，p f o s 是主要的污染物，且 美国与波兰人血中p f o s 含量最高( 3 0 n g m l ) ，韩国、l l 禾i j 时、马来西亚、巴西、 意大利和哥伦比亚人血中p f o s 含量中等( 3 2 9 n g m l ) ，印度人血中含量最低 ( 1 2 h p f 2 4 h p f ( 4 8 h p o 。然而1 - 1 2 0 h p f f r - t l3 1 2 0 h p f 细 温州医学院硕士学位论文 的对照液中出现死亡胚胎，6 1 2 0 h p f 组和其他组的对照液中却没出现胚胎死亡现 象，且大多死亡胚胎在实验后4 h 左右出现，说明在l h p f 或3 h p f 挑选早期胚胎 时即使当时发育正常，到了6 h p f 左右，也会因为外界影响而无法继续正常发育。 1 9 mp f o s 在各个起始染毒时间组1 2 0 h p f 死亡率没有显著差异( p o 0 5 ) ；4 9 m p f o s 在1 1 2 0 h p f 组1 2 0 h p f 死亡率均显著高于其他各组( p p f o s k p f h x s k p f o a p f b s k 。 1 4 们 加 。 一零一：lqcon i_m套=m七。芝 温州医学院硕士学位论文 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 024681 01 21 41 6 p f o s ( i i m ) n 0n 510l52 0 e i f