（物理化学专业论文）竹叶的化学成分研究.pdf

竹叶的化学成分研究 摘要 经单嚣豢优选实验和正交实验，以黄酮类的含量为考察耳标，确定竹叶 最佳提取工艺( 5 5 乙醇为溶剂，1 0 0 c 水浴下提取三次，每次2 h ，溶剂用 量为：箔一次体积为竹叶重量的1 0 倍，第二次为7 倍，第三次为4 倍) 。经 该工艺提取，实验所用的德清产竹叶中黄黼类含量约为l o m g g 。 建立了套联合使用s e p h a d e xl h 2 0 殷相柱层析和反相制备性高效液相 色谱( p r e p a r a t i v eh p l c ) 分离天然产物的新方法，快速，高效，适用于极 性化合物或水溶性他台物的分离。比较系统遣研究了米本科刚竹属植物 p h y l l o s t a c h y sh e t e r o c y c l a 干磉秆予的亿学成分，分离得到1 4 个单体佬合物， 用i r 、n m r 、潲等物理诧学方法鏊定了冀结构，惫括：一羟罄一3 一甲氧基苯 荦醛( v a n i l l i n ) ，4 一羧基一3 ，5 一二甲氧基苯甲懿( 4 - h y d r o x y 一3 ， 5 - d i m e t h o x y b e n z a l d e h y d e ) ，对羟基苯甲鹱( p h y d r o x y b e n z a l d e h y d e ) ，4 一 羟基一3 甲畿基苯甲酸( v a n i l t i ca c i d ) ，4 - 羟基一3 ，5 - 二甲氧基苯甲酸( 3 ， 5 - d i m e t h o x y 一4 咄y d r o x y b e n z o i ca c i d ) ，4 - 羟基3 一甲氧慕肉桂酸乙酯 ( 4 - h y d r o x y - 3 - m e t h o x y c i n n a m i ca c i d ，e t h y le s t e r ) ，对羟基苯甲酸 ( p h y d r o x y b e n z o i ca c i d ) ，反式对羟基肉桂酸( t r a n s p _ h y d r o x y c i n n a m i c a c i d ) ，顺式对羟基肉桂酸( c i s p 咱y d r o x y c i n n a m i ca c i d ) ，3 ，7 ，4 一三 羧基3 ，5 二甲氧罄黄酮( 2 一 3 ，5 一d i m e t o x y p h e n y 卜3 ，5 ，4 一t r i h y d r o x y 一4 h l b e n z o p y r a n 一4 一o n e ) ，3 ，4 一二甲瓶基岗校酸( 3 ， 4 - d i h y d r o x y c i n n a m i ca c i d ) 等。 关键诞：嚣时，提取，黄藜，浆酸，s e p h a d e xl h 2 0 ，p h p l c ，h p l c c h e m i c a lc o n s t i t u e n t sf r o m l e a v e so f a b s t r a c t s 1 1 1 eb e s t t e c h n o l o g y f o r e x t r a c t i n g f l a v o n o i d sf r o mb a m b o ol e a v e si s e s t a b l i s h e do nt h eb a s i so fb e s ts i n g l ef a c t o rs e l e c t i n ge x p e r i m e n ta n do r t h o g o n a l d e s i g n ，w h i c h i sd e t e r m i n e d w i t i l w a t e r - e t h a n o l ( v ：v = 4 5 ：5 5 ) a ss o l v e n t ， a p p r o p r i a t ee x t r a c t i n gt e m p e r a t u r eo f1 0 0 * c ，e v e r yt w oh o u r sf o re a c ho f t h r e e e x t r a c t i o n s ( s o l v e n tv o l u m e ：t e n t i m e sm o r et h a nt h ew e i g h to ft h eb a m b o ol e a v e s a tt h ef i r s tt i m e ，s e v e nt i m e sa tt h es e c o n dt i m ea n df o u rt i m e sa tt h et h i r dt i m e ) n l ca m o t m to ft h ef l a v o n o i d se x t r a c t e df r o mt h ei n v e s t i g a t e db a m b o ol e a v e si s a b o u tl o m g g am e t h o dc o m b i n i n gs e p h a d e xl h 2 0c ca n dp r e p a r a t i v eh p l cf o rn a t u r a l p r o d u c ts e p a r a t i o nw a sd e v e l o p e d ，w h i c hi se s p e c i a l l ys u i t a b l ef o rt h ep r e p a r a t i o n a n dp u r i f i c a t i o no fa q u e o u so rp o l a rc o m p o u n d s i th a sb e e np r o v e dt h a t t h i s m e t h o di se f f e c t i v ea n d r a p i di nt h i sw o r k f o u r t e e nc o m p o u n d s w e r es e p a r a t e d f r o mt h ep h y l l o s t a c h y sh e t e r o c y c l al e a v e s a c c o r d i n gt ot h ei r ，n m ra n dm s m e a s u r e m e n td a t a , t h e s e c o m p o u n d sh a v e b e e nd e t e r m i n e da s v a n i l l i n ， 4 - h y d r o x y 一3 ，5 - d i m e t h o x y b e n z a l d e h y d e p h y d r o x y b e n z a l d e h y d e v a n i l l i c a c i d ，3 ，5 - d i m e t h o x y 一4 一h y d r o x y b e n z o i ca c i d ，4 - h y d r o x y 一3 一m e t h o x y c i n n a m i c a c i d ，e t h y le s t e r p h y d r o x y b e n z o i ca c i d ，t r a n s p h y d r o x y c i n n a m i ca c i d ，c i s p h y d r o x y c i n n a m i ca c i d ，2 3 ，5 一d i m e t o x y p h e n y 一 3 ，5 ，47 一t r i h y d r o x y 一4 h 一1 一b e n z o p y r a n 一4 一o n e 3 ，4 - d i h y d r o x y c i n n a m i ca c i d e t c k e y w o r d s ：b a m b o ol e a v e s ，e x t r a c t i o n ，f l a v o n o i d ，p h e n o l i c a c i d ，s e p h a d e x l h 2 0 ，p h p l c ，h p l c 2 第一章综述 1 1 竹叶的研究现状 本实验_ 莠孺蒋时必汞本科竹翌辩嚣l 露耩毛竹( p h c l o s t a c h yh e t e r o c y c l a ) 的 时，主产于激江、江嚣、濒枣、云枣、褪建、麴川等遮。我国镗耩瑟积约 3 5 0 万公顷，怒我国森林资源的熏要组成部分。竹子除美化环境、平衡生态 外，其药用价值也不可忽视。竹叶在我国有着悠久的食用和药用历史，是一 味传统的清热解毒筠，本草求真、本草逢原、药品化义、名医剐 蒙、本摹纲銎等书串均有谗载，嚣时蒎心缓瓣、渣痰丘咳、为治上焦强 邪烦热、咳逆喘促、呕岁蛙血、一切孛熙镣瘸等瘥，爨其轻8 解上、辛缝数 郁、甘能缓脾、凉能入心、寒能疗热。近年来，竹叶有效成分和生物学功效 的研究引起了食品、营养和医学领域的广泛关注。研究表明，竹叶有效成分 爸括黄黼、酚敬、慧醌、蒋豆素类内鞴、多糖、氨基酸、多肽、挥发油、微 量元素等，具蠢捷蠹豹撬囊由蘩、撬簸位、获疲势、抗衰老、抗菌、挠瘸毒、 增强免痰力、抗癌防癌等生物学功效【n 。 针对竹叶的药理活性和化学成分的研究，自9 0 年代以来方兴未艾。近 代翡理实验证明，竹叶提取物在体外模拟胃液的条件下，能有效的消除亚 磷羧盐粒隧舐强致潦秘n 一戳豹合成1 2 1 。终时提敬物是一种良好的活往氧自 由基清除裁，其囊时清除吼效果可达7 9 。6 8 ，嚣时掇取携j c | 瓯秘溅瓣清 除效果都要比维生素c 和苯甲酸要好 3 1 。竹叶提取物还能显麓提离小鼠体内 s o d 和g s h p x 的活力，所以体内外的实验都表明，竹叶提取物有着优良和 稳定的抗氧纯活性 4 3 。竹矸中提取的多糖对接种s 。瘤的小鼠具有良好的免 疫罐强佟臻帮抗脖瘸活瞧嘲。 黄潮类物质在镶叶中的含爨较瓷，对其他学缀成鲍磅究表明竹叶中黄黎 类物质龟括芦丁、荭草甙和异籁草甙类( 4 种) 、木犀距素甙类( 4 种) 、牡 荆甙( 1 种) 、洋芹甙( 1 种) 和其他4 - oh 黄酮甙类( 1 0 种) 等。药理研 究证实，竹叶黄酮有与银杏黄酮和内酯相似的确切的降血脂、降胆固醇和抗 氧化等作用，因此对竹叶黄酮类物质的研究倍受关注。竹叶是一种比银杏叶 资源量大而且廉价的可再生资源，所以有望成为银杏的替代品。竹叶资源的 开发利用可变废为宝，提高竹业生产的经济效益。近年来，将竹叶提取物应 用于保健食品、饮料、香料的开发已有报道，但作为新药开发还未见报道。 对竹叶中总黄酮的精制的研究国内外都有报道。国内主要使用大孔吸附树脂 吸附提取液，先用水洗脱，以除去提取物中的水溶性的糖类，氨基酸类等， 再以一定浓度的乙醇洗脱得到含有黄酮的组分，该组分进一步用聚己内酰胺 以同样的方法纯化，则得到更纯的竹叶黄酮精制品，经过这两步精制得到的 黄酮纯度可达7 5 7 ，得率为1 5 2 【6 】。目前，竹叶中总黄酮含量的测定主 要采用比色法7 1 和h p l c 法【8 】。在研究竹叶提取物清除超氧离子自由基0 2 的 效果时发现，竹叶提取物中总黄酮浓度从1 3 4 m g l 一1 2 0 2 m g l 的范围内， 随总黄酮浓度的增加，清除率呈上升趋势眠 本论文以竹叶提取物中的有效成分黄酮类作为研究对象，建立含量测定 方法和最佳提取工艺，对竹叶中的化学成分进行较为深入的研究，旨在为进 一步开发研究竹叶的药用价值提供科学依据。 1 2 黄酮类化合物分离方法研究进展 黄酮类化合物广泛分布于植物界，绝大多数植物都能合成黄酮类，到目 前为止已发现了2 0 0 0 多种，它们多数以甙的形式存在，少数以游离形式存 在。它们一般具有两个苯环通过中央三个碳链相互联接而成的c 6 一c 3 一c 6 基 本骨架，根据取代基团的不同又可分为黄酮、黄酮醇、异黄酮、异黄酮醇、 黄烷酮、喳尔酮、山酮及其衍生物等类型。大多数具有显著的生理药理活性， 如消除氧自由基、抗氧化、抗过敏、抗炎、抗菌、抗突变、抗肿瘤、保肝、 雌激素样作用、泻下、保护心脑血管系统和抗病毒以及杀虫等，且毒性较低。 因此，天然黄酮类化合物越来越广泛的被应用于药品、食品、化妆品领域， 成为3 0 年来国内外研究开发利用天然产物的热点之一。随着科技的不断进 步，植物成分提取、纯化、分离方面的新技术和新方法不断地被应用于黄酮 类化合物。下面对近年一些新技术和方法在黄酮类化合物单体分离方面的应 用作简单的介绍。 1 2 1 制备性薄层色谱和离心制备薄层色谱 李教社等人【9 】用制备性t l c 从密蒙花中分离得到3 个黄酮苷类化合物。 陈玉武等人【1 0 l 用制备性薄层层析从蜜柑草的干燥全草中分离得到4 个黄酮 苷类化合物。 离心制备薄层色谱( c t l c ) 是在薄层色谱和柱色谱基础上发展起来的 一种新的旋转离心、连续洗脱的圆形薄层色谱技术。洗脱剂的移动是依靠离 心力的作用，与常规的薄层色谱相比，其最大的优点是产品的洗脱过程对固 定相不会造成损坏，而且装填容量、分离速度和分离效能也比常规的制各薄 层色谱法和柱色谱法高出很多。c t l c 分离多是在硅胶p f 2 5 4 ( 经硫酸键合 的硅胶) 板上进行的【“】。 m v a h m o u de n 等人b 】以甲苯乙酸已酯一乙酸( 9 6 ：4 ：1 ) 为洗脱剂， 从l o n c h o c a r p u sm i n i m i f l o r u s 种子的氯仿提取液中分离出一种二氢黄酮；从 该种子的石油醚提取物中分离出另外两种二氢黄酮。在对p l a t a n u sa c e r i f o l i a 所含化学成分研究的过程中，k a o u a d j i m 1 4 】以硅胶为固定相，苯一丁酮甲醇 为流动相，经c t l c 法分离出一种三羟基黄酮醇单糖苷。 1 2 2 柱层析法 由于仪器设备简单，这是黄酮类化合物分离中应用最普遍的方法。根据 所用吸附剂可分为三类：聚酰胺柱层析法，硅胶柱层析法，葡聚糖凝胶柱层 析法。分离时一般都是采用不同溶剂系统进行梯度洗脱，既可采用一类方法 也可以上两类或三类方法联用以分离含广泛黄酮类组分的混合物。 臭灵丹地上部分的水浸提液分别用氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇进行 萃取，然后氯仿部分进行硅胶柱层析，用不同比例石油醚丙酮沈脱，分离 得化合物3 ，4 ，5 一三一o h 一3 ，6 ，7 - 三甲氧基黄酮；正丁醇部分进行硅 胶h 低压柱层析，以氯仿一甲醇一乙酸乙酯一水( 2 ：2 ：4 ：l 下层) 洗脱得橙 皮甙1 1 5 】。 羽叶千里光地上部分提取物的乙酸乙酯部分经聚酰胺层析，以 h 2 0 - c h 3 c h 2 0 h 梯度洗脱，3 0 乙醇洗脱物反复用2 0 2 0 0 目聚酰胺柱以氯 仿一甲醇洗脱和s e p h a d e x - 2 0 柱以甲醇洗脱，分离纯化得化合物：山奈酚一3 一o b d 一半乳糖苷，异鼠李素3 o b d 一半乳糖苷，槲皮素一5 o b d 葡萄糖菅 1 6 1 。 藏药兔耳草的干燥全草醇浸膏的乙酸乙酯提取物，先经聚酰胺柱层析， 水一乙醇梯度洗脱，后再经反复低压硅胶柱层析，不同比例的氯仿一甲醇水洗 脱，分离出1 1 种黄酮类化合物。 1 2 3 纸层析祛 最早的分离黄酮类的方法之一就是纸层析。v e r l a 9 1 1 8 1 用制备性纸色谱法 从大井口边草p t e r i sc r e t i c a 中分离得到3 中黄酮苷类化台物。 近年来在此法的基础上发展出一种新的方法一一胶束纸色谱法 ( m p c ) ，利用表面活性剂胶束水溶液进行纸色谱分离的一种分配色谱。郭 新华等分别以0 0 0 8 l m 0 1 l 的s d s 和0 0 0 1 3 m o l 1 c t a b 水溶液作为展开剂， 使五种黄酮类化合物芦丁、槲皮素、黄芩甙、4 甲基立可丁、甲基黄酮醇 胺的混合物得以分离，并测出了各自的r f 值。为了克服迁移过程中的脱尾 现象，他们探讨了醇类有机添加剂对分离效果的影响，结果表明以正戊醇添 加剂为最好 1 9 】。 1 。2 4 麓效渡攘色谱法( h p l c ) 近年来，h p l c 在黄酮类分析中的应用飞速发展，尤其是反相高效液相 色谱( r p ，h p l c ) 。以r p c 1 8 柱用褥最为普遍，但邬安珍等f 2 锄认为r p c 8 柱系绞对分离含广泛荧鞭类维分的滋台憋魄r p c 1 8 柱受必理怒。 圭内填充 粒径从近几年在黄酮类分析中的应用看，以5 u m 用得最多，其次为1 0 a m 。 最常用的流动相为甲醇水及乙腈一水体系。为了提高分离常常需要使用梯度 洗脱l 魏1 。 宋洪杰用h p l c 法对葛根的水提取液进行分离，采用h y p e r s i lo d s 2 ( 1 5 0 m mx4 6 m mx1 5 u r n ) 色谱柱，在前1 0 r a i n 以乙腈，0 0 2 m o l 1 磷酸二氢 镩 1 2 ：8 8 ) 为波动稳，嚣l o 一2 5 分镑戬乙薅0 0 2 m o l 露磷酸二氯铮( 2 5 ； 7 5 ) 为流动相分离出三种异黄酮：葛根素、大豆替、大甄苷元。 对杜鹃叶豹7 5 l 醇提取液采用z o r b a xs b c 1 8 为色谱柱，甲醇。水( 6 0 ： 4 0 ) 走滚麓糍，瘸h p l c 法分离出秘穗黄鬻攀俸：裰疫豢与由奈酪。 1 2 5 邋流色谱法( c c c ) c c c 法是嶷滚滚分配爨疆翡鏊糖上发袋酶一耱方法。宅与常麓麓羝色 谱、柱色谱的区别在于像无需任何固态载体，从而避免了物质分离提纯过程 中翻吸附作用引起的样品损失、样品组分的化学变性等问题。近年来用于黄 酮类镑震分离载逆渡色谱按拳主要鸯嚣秘：滚滚逆流琶谱法窝离心遂流色谱 法。 1 2 。5 。1滚滚逆流色谱法( d c c c ) d c c c 法是采用两相溶剂系统的上相或下相作为固定相，另一相作为流 动相，在管柱压力的作阁下，流动相在管柱中以液滴的形状上行或下行而进 嚣静一秘动态摹取。魏法多鞠予黄鬃栽类静分离。 t a n a k a 2 4 1 等人最近报道了采用d c c c 法从大时风尾蕨的地上部分分离 囊3 ”一o 乙簸擞皮蕺帮4 ”一o 一乙醮擞皮最。德们懿氯傍一甲醇一承( 4 ：4 ： 3 ) 的上层作流动相使这两种化合物褥副满意分离。 ，2 。5 。2离心逆流色谱法( c c c c ) 随着离心逆流色谱特别是高速离心逆流色谱( h s c c c ) 技术的不断发 展和其具有的优越性，使其逐步取代了d c c c 技术。h s c c c 法怒利用多层 螺旋罄行星斌运凄形成将殊弱塞心力矢量场亲实现掰褶溶裁稳农喾柱墨豹 单向性流体动力学分布状态，以促进两相间的充分混合和逆流传递，从而实 现样品的快速分离。它可并j 于水和非水体系，可分离物质的极性范围很宽。 张天德等班沙赫于袋五醇提取嚣的黄色于粉灸灏凝，氧蕊掣簿水( 4 ： 3 ：2 ) 为溶剂系统，把样潞溶于所选溶剂系统的上下褥相等量混合液中，以 上相作为固定相，下相作为流动相以2 0 0 m l h 的高流速泵入管柱，分离出异 鬣李素和搬蔽素嚣秘黄掰零髂【2 引。 v a n h a e l e nm 等通j 遣c c c c 和半制备h p l c 技术相结合，从锻杏叶中 分离出7 种黄酮苷担体。c c c c 分离过程采取梯度洗脱，开始用水做固定相， 乙酸乙繇浚怼，然鑫逐步两乙酸乙繇巾糖a 异丁醇，洗噩蔸终点懿乙酸乙琵。 异丁醇e e 例为6 ；4 2 6 1 。 另外，i t o y 等人采用三层螺旋管的装置，分别用适宜的两相溶剂系统， 辑究了h s c c c 法对霞揍赞醺类在肉鹣玉类恁合魏鹣事翱冬睦努亵瞧鼗 2 7 1 。 1 2 6 商效毛细管电泳法( h p c e ) h p c e 楚一耱迅速发淡戆分离耘技术，具毫分离效率褰、分辑避瘸短、 进样量少、低检测限和良好的重现性等优点。它是以高压电场为驱动力，毛 细管为分离通道，依据样黼中各组分间电泳淌度或分配行为的差辨而实现分 裹致滚摇分裹技零。它蠢多秘操终模式，瘸子黄察炎纯会骛载分褰，霉震兹 有两种：毛细管区带电泳和毛细管胶窳电动色谱。 6 1 2 6 1泡细管区带电泳( c z e ) c z e 又称为自由溶液电泳，它悬根据带电溶质在电场中的电容淌度的 差舅瑟实褒分褰熬，较逶会带电溶震鹃分褰。瘸予莛黧类，主要燕裁羯黄酮 类含有邻羟藏的特点，加入硼砂与之簸台后用此模式分离。 在6 0 m m o l 1s d s ，2 0 m m o l 1 硼酸体系中，p h 8 3 的条件下，1 0 分钟分 凌了金盏藏中载异鼠李索3 一o 一芦丁贰、算鬣李事。3 ，o 。戴、翼鼠枣亭- 3 一o 一麓 糖苷、异鼠举亭3 一o 一2 鼠李芦丁糖替、芦丁和异栎索1 2 飘。 m o r i n 簿也报道了c z e 分离黄酮的方法。首先研究了黄酮糖甙与硼酸 复合镕懿c z e 迁移援簿。在o 2 m o l t 豹硼酸孛，p i l l 0 。5 ，2 0 m i n 分离了擐 素一3 一o 半乳糖甙、栎素，3 o 一鼠李糖甙1 2 钟。 此外，a u s s e n a c t 研究了用c z e 法分离大豆摄取物中各异黄酮的条件， 莠弼越法磺究了不嗣撵耪期帮生长臻凌对大豆孛务羚黄酝含量与纽残弱影 响1 3 0 1 。 1 2 ，6 2 龟缨警茨索魄劫夔谱( m e c c ) 在缓冲体系中，引入表面活性剂如十二烷基硫酸钠( s d s ) 戏十六烷基 三甲基溴化胺( c t a b ) ，当高于临界胶束浓度时，表面活性剂疏水端聚集， 形或获索，爨爱溶矮在窳稿霾荻隶攘分嚣系数苓弱，其迂移速瘦移在差雾麸 而实现分粥。一般适合于中性物质的分离。 b j e r g e g a a r d 采用c t a b 作胶束，u v 检测，在1 2 m m o l f l 硼酸、2 0 m m o l o 磷酸彝4 0 m m o t b c t a b 体系中，热入碡豹嚣羧佟羧蛙裁，p h 7 ，1 2 m i n 分 离了十字栈科植物中的芦丁、栎素、茨非醇、茨非醇3 槐糖甙，7 葡糖甙、 茨非醇一3 - 葡糖甙、茨非醇3 ，7 - - - 葡糖甙、茨非醇。3 芥子槐糖贰葡糖甙、 菠饕醇一3 ( 6 ”一羧基蘩耩袋) 霸茨黪簿3 一魏璃本耱( i ，2 ) 警嚣糖贰5 孔 。 以u v 检测，在2 0 m m o l ls d s 和2 0 m m o l ln a h 2 p 0 4 的缓冲体系中加 入2 5 m m o l l 硼砂，1 5 m i n 内分离出黄芩根中六种黄酮类化合物：黄芩苷、 黄芩素、汉黄芩素一7 ，葡萄糖醛酸甙、汉黄芩素、黄芩素一6 - 甲醚一7 一葡萄糖醛 酸甙和黄芩素一6 一甲醚口“。 l i a n g h r 等人以m e c c 法，采用二极管阵列检测器从淫洋藿属的四种 植物即e b r e i c o m u m 、e h u m a n e n s e 、e c o a c t u m 和e t r u n c a t u m 中都分离出 淫洋藿甙、e p i m e d i nb 和e p i m e d i n c 及其它8 种化合物1 3 3 j 。 1 2 7 超临界流体色谱法( s f c ) s f c 是近几年才发展起来的一种新技术，利用超临界流体为流动相， 常用的为c 0 2 。它既可分析g c 不适应的高沸点、低挥发、热不稳定的样 品，又比h p l c 有更快的分析速度和更高的时间效率。流动相中可加入醇 类等物质作为改性剂以改进分离效果。刘志敏等人利用s f c 法对6 种黄酮 及黄酮苷类化合物做了研究，发现流动相组成是影响色谱分离的重要因素， 硅胶基质的键合苯基比较适合于此类化合物的分离【3 4 。 综上所述，新的技术不断地被应用于天然黄酮类物质的提取、纯化与分 离，必将促进对这一类物质更深入的研究，更合理地利用各种天然植物资源， 为人类的健康服务。竹叶中含有大量的黄酮类物质，对竹叶黄酮类分离、纯 化及药用价值的开发已有许多科学研究。我国具有大量的竹叶资源，对竹叶 的综合利用方面的研究已有很多的报道，但在真正合理利用方面的实际工作 还有待于进一步完善。本课题的研究目的是为了对竹叶中具有药用价值的竹 叶黄酮开发和利用，包括提取、纯化、有效成分的分离及药理药效的研究。 本实验主要在提取和分离方面做了大量的工作，以期为下阶段工作的顺利进 行提供科学依据。 第二章有效成分定量方法和最佳提取条件的选择 本章首先确定了黄酮类物质的测定方法，以便于最佳提取方法确定时 有统一的评价方法；然后通过正交设计试验确定了最佳提取工艺。 2 1 仪器与试剂 2 1 1 仪器 日本同立u 一2 0 0 0 紫外可见分光广度仪：分析天平( m e t t l e r 公司 a e 2 6 0 ) ；电热恒温干燥箱( 浙江新胜电热仪器厂s c 2 0 2 ) ；d t 动态提取浓 缩机组d t 5 ( 杭州大荣轻工设备厂) ；瑞士产b u c h i 微型喷雾干燥器；l x j i i 型离心沉淀机( 上海医用分析仪器厂) ：z f i 型三用紫外分析仪( 上海顾村 电光仪器厂) ；s h b i i i 型循环水式多用真空泵( 郑州长城科公贸有限公司) ； 电热恒温水浴锅( 江苏省东台市电器厂) ；r e 5 2 c 型旋转蒸发器( 上海亚荣 生化仪器厂) ： 2 1 2 试剂和材料 实验中所用试剂均为分析纯；提取用乙醇为工业纯； 伞形花内酯标准品美国s i g m ac h e m i c a lc o m p a n y n o l u 7 6 2 6 芦丁标准品中国药品生物制品检定所 2 2 竹叶总黄酮含量的测定 芦丁是竹叶中含量较高的黄酮类化合物，故测定竹叶中总黄酮含量时通 常选用芦丁为标准品，显色反应后用分光光度法进行定量。 9 2 2 1 芦丁标准曲线的制作 精密称取在1 0 5 。c 干燥至恒重的芦丁标准品o 1 0 0 1 9 ，置于5 0 m l 容量瓶 内，加入9 5 乙醇4 0 m l ，水浴上加热溶解，放至室温，再用9 5 乙醇加满 至刻度，即得芦丁标准贮备液。精确吸取此溶液5 0 m l 置于5 0 m l 容量瓶中， 用4 0 乙醇溶液稀释至刻度，即得标准芦丁对照液。精确吸取0 、0 3 、1 ，0 、 2 0 、3 0 、4 0 、4 5 m l 上述标准芦丁对照液于1 0 m l 容量瓶中，先加5 n a n 0 2 溶液0 3 m l ，放置6 m i n ，加1 0 a i ( n 0 3 ) 3 溶液0 3 m l ，放置6 m i n ，再加 4 n a o h 溶液4 m l ，最后用4 0 乙醇溶液定容至刻度，摇匀，放置1 5 m i n 后经紫外可见扫描，此溶液在5 1 0 n m 处有一最大吸收峰，所以选择5 1 0 n m 为测定波长，测定吸收度，结果见t a b l e 2 1 和图1 。 t a b l e 2 1d e t e r m i n a t i o no fs t a n d a r dc u r v e 0 o 0 o o2 0 f i g 4 06 08 0 1 0 0 c ( u g m 1 ) 1s t a n d a r dc u r v eo f r u t i n 1 0 苎工握壅垫臻 回归方程：a = 0 0 1 2 6 4 c + o 0 0 8 9 ，r = 0 9 9 9 9 ，线性范围：6 0 0 6 9 0 0 9 9 9 m l 。 2 2 2 样品溶液的制各 2 5 9 竹叶用7 0 乙醇溶液为溶剂，1 0 0 c 水浴提取三次，合并提取液， 减压回收至无醇，水溶液加热至沸并保持5 m i n ，放冷后用蒸馏水定容至 1 0 0 m l ，离心( 3 0 0 0 r m i n 1 5 m i n ) ，取上清液5 m l 上已经预处理的聚酰胺小 柱( 1 4 e m l c m ) ，先1 0 0 m l 水洗，再用5 0 m 1 9 5 乙醇溶液洗脱直至无液体 流出，并收集此洗脱液于1 0 0 m l 容量瓶中加蒸馏水定容，即得待测竹叶样 品溶液。 2 2 3 样品中总黄酮含量的测定 取上述样品溶液5 m l 于1 0 m l 容量瓶中，按标准曲线项下( 从“先加 5 0 o n a n 0 2 溶液0 3 m l ”起) 相同操作，测定其吸收度，并计算每克竹叶中总 黄酮含量。 2 2 4 样品溶液显色稳定性实验 上述样品溶液按1 3 中总黄酮含量测定方法显色反应后放置，分别在 5 m i n 、1 0 m i n 、1 5 m i n 、2 0 m i n 、3 0 m i n 时在5 1 0 n m 处测定吸收度，结果见 t a b l e2 2 。表中结果说明样品溶液显色后在2 0 m i n 内稳定性良好。 t a b l e2 2 s t a b i l i t yo fs a m p l es o l u t i o n 2 2 。5糖戆瘦实验 2 2 5 1 日内精密度实验 同一份竹叶提取液，按样品溶液制备项下方法( 自“取上清液5 m l ”起) 穗目操终，霪复5 次，分剿测定嚣 中慈蓑酮含量，结果觅t a b l e 2 3 。 2 2 5 2 日间精密度实验 嗣一份键时提取滚，按榉墓滚滚铡罄颈下方法( 囊“取上清波5 m l ”起) 相同操作，麓复5 次，每天一次，分别测定竹叶中总黄酮含量，缔粜见t a b l e 2 3 。 t f 由l e2 3e x a c t i t u d eo f d e t e r m i n a t i o n 0 7 4 2 o 7 3 7 0 ，7 3 8 0 + 7 3 4 9 2 3 0 9 1 6 8 9 1 8 0 9 。1 3 l 0 7 4 2 0 7 3 9 0 7 4 6 0 7 2 7 9 2 3 0 9 1 7 5 9 2 8 0 9 ，0 4 3 0 7 2 59 0 907 2 38 9 9 0 2 2 6回收率实验 在前述离心后的上滴液中分别加入高、中、低浓度的芦丁标准品，按样 嚣溶液溺爱方法透露溅悫，各皴5 餐，茨霉霞| | 芟攀缝采翌t a b l e 2 4 。 t a b l e2 4 a v e r a g er e c o v e r y 1 9 0 2 7 4 6 59 7 2 l 7 5 3 39 5 。s 8 7 5 8 09 8 ，0 59 7 5 6 7 5 8 09 8 o s 7 5 9 69 8 9 0 1 2 9 2 3 竹叶中黄酮类摄取的最佳工楚条件选择 班甏取矗铡褥静盼时中黄繇类含董为参考指标优选疆佳提取工装条件。 2 3 1 提取溶剂的初步筛选 取德淆产竹靖5 份，每份2 5 9 ，分弱焉2 5 0 m l 的东、3 0 乙醇、5 0 乙醇、 7 0 乙醇翔9 5 乙醇为溶裁，在1 0 0 c 水漆圆滚掇取3 次，每次l h ，会共3 次提取液，减压回收溶剂并制各样晶液，测定方法同前，结果见t a b l e2 5 。 由表结栗，裙步选定鬣佳提敬乙醇浓度范阑为5 0 到7 0 。 t h b l e 2 5d e t e r m i n a t i o no fs o l v e n t 2 3 2正交实验法优选最佳提取工艺 2 3 2 1实验因素与水平数的选择 以不同浓度的乙醇溶液为提取溶剂，乙醇浓度、提取次数、水浴温度和 提取时间为实验的四个因素，每个因素都选取四个水平，具体见t a b l e2 6 。 1 a b l e2 6f a c t o r sa n dl e v e l s 2 3 2 2正交实验 称取2 5 9 碎竹叶1 6 份，根据因素水平表，选择l 1 6 ( 4 5 ) 正交表，分别 进行提取并测定竹叶中黄酮及内酯类含量，结果见t a b l e2 7 。 t a b l e2 7r e s u l t so fl 1 6 ( 4 5 ) o r t h o g o n a lt e s t 实验 因素含量( m 眺) 号 abcd 黄酮类 1 11l12 3 13 2 222l4 6 7 6 6 7 33312 7 3 9 5 2 444137 3 6 7 8 512227 5 8 6 62l235 2 9 l 7342l7 7 5 0 84324 9 0 8 9 9l333 8 8 7 0 1 024321 0 1 0 0 1 l3l34 8 4 8 8 1 242 3l8 0 5 1 1 3l4441 0 2 0 9 1 4234l 1 0 2 0 9 1 53243 1 0 2 6 4 1 64l42 8 5 7 5 i2 8 9 8 2 4 6 l2 3 8 42 8 3 2 i i3 2 3 7 3 2 ，6 72 9 7 23 3 6 0 i i i3 3 9 0 3 5 5 63 5 5 13 1 7 9 i v3 3 0 2 3 5 4 33 9 2 03 4 5 5 由表中结果可以看出，最佳提取工艺为：a 3 8 3 c 4 d 4 。即5 5 乙醇为溶 剂，1 0 0 。c 水浴，提取三次，每次两个小时。以a 3 8 3 c 4 d 4 条件提取三批竹 叶，结果见t a b l e2 8 ，黄酮类含量约为1 0 1 m g g 。 t a b l e2 , 8 r e p e a t a b i t i t yo f o p t i m u m e x t r a c t i o np r o c e s s 2 4 讨论 据文献投邋0 5 , 3 6 1 ，撞耪串慧黄酮黪含量溅定方法大多怒采耀提毅滚壹接 经显色艇应后测定吸收度，然后计算出含量，我们通过实验确定了吸光度一浓 度相关曲线和相关函数关系，芳以此l 乍必我们摄取实验的怒量基础。在此正 交实验巾，溶剂的闲量没有作为影晌凼索考虑进去，每次的用量都魑竹叶重 量的1 0 倦，若大批量的提取，溶剂用缀太大，必然造成成本的增加。因此 将溶裁溺量骰了调箍：第一次为嚣时熬量豹l o 髂，第二次为7 倍，第三次 为4 倍。对比实验缀t 检验分析表明溶剂用量改变后提取效果无显著性差异。 结莱觅t a b l e2 。9 。蠢踅最终静最毽掇取工艺遥定为；5 5 豹乙醇为溶蠲， 1 0 0 1 2 水浴提取三次，每次2 h r ，第一次溶剂体积量为竹叶熏量的1 0 倍，第 二次戈7 嫠，第三次菇4 偿。 t a b l e2 。9 d o s a g eo fs o l v e n t 第三章化合物的分离和鉴定 本章通过有机溶剂萃取法，首先对竹叶提取物进行了初步的极性切割， 达到了初步分离的目的，然后对乙醚部分和正丁醇部分化合物分别进行了 分离和鉴定，各得到了十二个和四个化合物，其中乙醚部分绝大多数是酚类 物质，而正丁醇部分主要成分是黄酮类物质。 3 1 仪器与试剂 3 1 1 仪器 日本日立u 一2 0 0 0 紫外可见分光广度仪：分析天平( m e t t l e r 公司 a e 2 6 0 ) ；电热恒温干燥箱( 浙江新胜电热仪器厂s c 2 0 2 ) s h b i i i 型循环水 式多用真空泵( 郑州长城科公贸有限公司) ；电热恒温水浴锅( 江苏省东台市 电器厂) ；r e 5 2 c 型旋转蒸发器( 上海亚荣生化仪器厂) ：熔点由k o f l e r 显 微熔点仪测定( 未经校正) ；红外光谱由i r 4 6 0 测定，k b r 压片；核磁共振谱 由b r u k e ra m 一4 0 0 测定；质谱由m a t 9 5 型质谱仪测定。 岛津h p l c：s h i m a d z us c l 一6 as y s t e mc o n t r o ll e r s h i m a d z ul c 一6 ap u m p s h i m a d z us p d - 1 0 a v pu v v i sd e t e c t o r s h i m a d z uc t o - 6 ac o l u m no v e n c o l u m n 大连物化所c 1 8 ，0 5 * 2 5 ( 1 5 - 2 5 u m ) 工作站杭州英谱( 以上简称s h i m a d z uc h a n n e lb ) 制备性高效液相：w a t e r s6 0 0c o n t r o l l e r w a t e r s6 0 0p u m p w a t e r s2 4 8 7d u a l a b s o r b a n c ed e t e c t o r w a t e r sf r a c t i o nc o l l e c t o ri i c o l u m nw a t e r sb o n d a p a kc 1 81 5 - 2 0 u m1 9x3 0 0 m m 工作站m i l l e n n i u m ”( 以上简称w a t e r s 6 0 0 2 4 8 7 ) w a t e r sh p l c ：w a t e r s6 0 0c o n t r o ll e r w a t e r s6 0 0p u m p w a t e r s7 t 7p l u sa u t o s a m p l e r w a t e r s9 9 6p h o t o d io d ea r r a yd e t e c t o r c o l u m n 大连物纯新c 1 8 柱 工作嫔m i l l e n n i u m 3 2 ( 以上筠称w a t e t r s 7 1 7 9 9 6 ) 3 。1 。2 试裁弱材料 色谱纯甲醇，天津市四友生物医学技术有限公司；色谱纯异蹰醇，浙江 灏海有瓠缳王二厂实验串掰竭试翔均为分辑缝；媲洽哈纯净拳；摄取焉乙辩 为工业纯；其它实验试剂均为分析纯。芦丁标准品，中国药品生物制品检定 掰；s e p h a d e xl h 2 0 盘瑞典p h a r m a c i a 公司生产，上海试藕集团进口分装； 磁胶2 0 0 - 3 0 0 目枝层析用及硅胶h 为青岛海洋化工厂出晶；硅胶板h s g f ：。 烟台市芝黄务硅胶开发试验厂出黼。 3 2 萃取 2 0 0 宠赞蜉壤提彩按蔫述簸经提取王艺霉刭豹戆时轵提甥2 0 0 9 ，躅 3 5 0 m l 蒸馏水超声溶解，提取液减压回收溶剂，水溶液加热煮沸并傺持5 r a i n ， 敖冷，离心( 3 0 0 0 r m i n x1 5 m i n ) ，取土滚滚减蘧浓缭至俸积与琢辩重量魄 约为1 ：1 ，即得以下用于纯化的竹叶提取液。实验流程如c h a r t1 。 竹叶提取液 i 石油醚萃取 厂 上乙醚萃取 乙 部分 上乙酸乙酯或水饱和正丁醇萃取 厂 乙酸乙酯或正丁醇部分萃余液部分 c h a r t1 e x t r a c t i o no fc h e m i c a l c o n s t i t u e n t sf r l e a v e so f p h y i l o s t a c h y sh e t e r o c y c l a 实验结果见t a b l e3 1 ，表中含量是指萃取后各部分减压抽干溶剂后所得 固形物中黄酮类的重量百分含量。 t a b l e3 1e x t a c t i o no f d i f f e r e n t o r g a n i cs o l v e n t 乙醚部分乙酸乙酯部分 正丁醇部芬琴泵藕丽芬 乙酯或用正丁醇萃取后得到的剩余水溶液部分 3 3 分离乙醚部分单体化台物 1 9 乙醚萃取物缀硅胶柱层析，以甲醇一氯仿为洗脱剂，共获得6 个组分。 其中第一秘第三令缝分褒h p l c 上寒显示爨毒害鬟较裹夔纯合麴，弃去e 爨 4 个组分缀硅胶校层析、s e p h a d e xl h 2 0 桩层析、制备型商效液相( p h p l c ) 簿交互使箱，分离获薅了1 2 令纯举残分( b l 一 罅l 一1 2 ) ，总流程魏c h a r t 2 。 乙醚雏取物 i a f r ( 1 ) f r ( 2 ) f r ( 3 ) f r 4 )f r ( 5 ) f r ( 6 ) o 薯n 譬上爿oc i广 - 广t 甑 厂f 匕1 l a ：s i l i cc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y b ：s e p h a d e xl h 2 0c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y e ：p r e p a r a t i v eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y c h a r t2 i s o l a t i o no fc h e m i c a lc o n s t i t u e n t sf r o m l