（食品科学专业论文）枯草芽孢杆菌B34降解乙醇的研究.pdf

摘要 过量饮酒不但危害个人的身心健康，而且引起了一系列社会问题。因此研究开发解酒药剂和 保健食品成为国内外共同关注的课题。芽孢杆菌( b a c i l l i ) 由于能够产生抗逆性强的芽孢，在自 然界分布广泛，因此与人类关系极为密切，在食品、农业、工业、医学、林业、环保乃至军事等 诸多方面均有重要用途。本研究旨在筛选出具有解酒能力的芽孢杆菌，开发一种新型的解酒饮料。 研究内容主要包括： 1 从1 2 种中草药样品中筛选得到5 株解酒能力较强的芽孢杆菌，并对其进行生理生化鉴定。 其中b 3 4 菌株的生理生化指标与枯草芽孢杆菌十分接近，于是进行进一步的1 6 s r d n a 基因序列 分析，结果表明b 3 4 菌株与b a c i l l u ss u b t i l i ss u b s p s u b t i t i s 比较接近，鉴定为枯草芽孢杆菌枯草亚 种。 2 通过实验研究，得到b 3 4 菌株的优化发酵培养基和培养条件：柠檬酸5 9 l ，硝酸钾5 9 l ， 硫酸亚铁0 0 1 9 l ，磷酸二氢钾2 0 9 l ，氯化钙0 2 9 l ，硫酸锰0 6 9 l ，培养温度3 7 c ，初始p h 值7 5 ，接种量l ，装液量5 0 m l 3 0 0 m l ，最佳培养时间7 2 h 。 3 动物实验结果表明，利用b 3 4 菌株制备的醒酒乳饮料，具有比较理想的解酒效果。发酵 上清液含量越高醉倒率和醉酒维持时间越低，耐受时间越长，最佳可使醉倒率下降7 0 。 4 利用紫外线照射技术，对b 3 4 菌株进行诱变育种，得到1 0 株解酒能力明显提高的正向突 变菌株。其中b 3 4 - 4 6 、b 3 4 1 5 9 菌株不仅解酒能力较强，而且具有良好的遗传稳定性和酸稳定性， 具有进一步开发和利用的价值。 关键词：芽孢杆菌，降解乙醇，紫外诱变 a b s t r a c t t o om u c hd r i n k i n gn o to n l yi sh a r m f u lt oh e a l t ho fb o d ya n dm i n d ，b u tg i v e sr i s et oas e r i e so f s o c i a lp r o b l e m s s oi th a sb e c o m eas u b j e c to fc o m m o ni n t e r e s th o m ea n da b r o a dt h a ts t u d ya n d d e v e l o p m e n to fs o b e r - u pm e d i c a m e n ta n dh e a l t hf o o d b a c i l l ia r ec l o s e l yi d e n t i f i e dw i t ht h eh u m a n b e i n g , s i n c et h e yc a ng e n e r a t es p o r ew i t hr e s i s t a n c ea n dd i s t r i b u t ew i d e l yi nn a t u r e 1 1 1 e ya r ef o r i m p o r t a n tu s ei nm a n yr e s p e c t ss u c ha sf o o d ，a g r i c u l t u r e ，i n d u s t r y ，m e d i c i n e ，f o r e s t r y ，e n v i r o n m e n t a l p r o t e c t i o na n de v e nm i l i t a r ya f f a i r s t h i ss t u d ya i m e da ts c r e e n i n go u tb a c i l l iw h i c hw e r ea b l et o d e g r a d ea l c o h o la n dd e v e l o p i n gan e ws o b e 卜u pb e v e r a g e t h em a i nr e s u l t so ft h i sp a p e ra r ea sf o l l o w s ： 1 t h e r ew e r e5s t r a i n so fb a c i l l io b t a i n e df r o m12c h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c i n e s ，w h i c hh a ds h o w n t od e g r a d ea l c o h o le f f e c t i v e l y a f t e rp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a le x p e r i m e n t s ，t h es 仃a l n sb 3 4h a da c l o s ea f f i n i t yo fb a c i l l u ss u b t i l i s t h er e s u l to f16 s r d n as e q u e n c ea n a l y s i sh a ss h o w nt 1 1 a tb 3 4w a s i d e n t i f i e da sb a c i l l u ss u b t i l i ss u b s p s u b t i t i s 2 a f t e re x p e r i m e n t , t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nm e d i u ma n dc o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e da sf o l l o w ： c i t r i ca c i d5 9 l ，k n 0 35 9 l ，f e s 0 40 01g l ，k h 2 p 0 42 0 9 l ，c a c l 20 2 9 ，l ，m n s 0 4 0 6 9 l ， t e m p e r a t u r eo f3 7 * ( 2 ，i n i t i a lp h 7 5 ，i n o c u l a t i o na m o u n t1 ( v v ) ，a d d i n g5 0 m lm e d i u me a c h3 0 0m l f l a s ka n dt i m ef o r7 2 h 3 1 1 1 ea n i m a le x p e r i m e n ts h o w e dt h a tt h es o b e r - u pm i l kb e v e r a g em a d ef r o mb 3 4h a dg o o d d e a l c o h o l i ce f f e c t t h ei n t o x i c a n tr a t i oa n dk e e p i n g - t i m ew e r eb o t hr e d u c e d t h ei n t o x i c a n tr a t i oc o u l d r e d u c e7 0 t h em o s t 4 b 3 4w a st r e a t e dw i t hs p o n t a n e o u ss c r e e n i n ga n dt h e nb yu vm u t a g e n e s i sa n d10p o s i t i v e m u t a n t sw a so b t a i n e d b 3 4 - 4 6a n db 3 4 15 9c o u l dh i g h l ys o b e ru pi nl o w e rp ha n dh a dg o o dg e n e t i c s t a b i l i t y ，w h i c hs e r v ea sg o o dm i c r o b i a ls t r a i nr e s o u r c eo fi n d u s t r i a lp r o d u c t i o na n dh a dad e v e l o p m e n t v a l u e k e yw o r d s ：b a c i l l u ss u b t i l i s ；d e g r a d i n ga l c o h o l ；u vm u t a g e n e s i s 1 - 插图和附表清单 图( f i g u r e s ) 图2 1 乙醇标准曲线1 2 图2 2b 3 4 菌株的系统发育树1 5 图3 1 乙醇标准曲线i i 2 0 图3 2 起始p h 值对解酒效果的影响- 2 4 图3 3 装液量对解酒效果的影响2 4 图3 4 接种量对解酒效果的影响2 5 图3 5 培养温度对解酒效果的影响2 5 图3 - 6 发酵曲线”2 6 图5 - 1b 3 4 的正向突变菌株的酸稳定性3 4 表( t a b l e s ) 表2 1 目标菌株的解酒效果“1 2 表2 2 菌株的菌落形态特征”1 2 表2 3 菌株的菌体形态特征13 毒2 - 4 菌株的生理生化特征1 3 表2 5 不同处理下乙醇浓度的变化16 表3 1 不同碳源对解酒效果的影响2 0 表3 2 不同氮源对解酒效果的影响2 1 表3 3 氮源试验的方差分析2 1 表3 - 4 氮源的多重比较。2 l 表3 5 碳氮源优化试验方案和试验结果2 2 表3 - 6 碳氮源的因素水平2 2 表3 7 碳氮源优化试验的方差分析”2 2 表3 - 9 无机盐各因素的水平”2 2 表3 8 无机离子优化试验方案和试验结果2 3 表3 1 0 无机离子优化试验的方差分析2 3 表4 1 不同给酒剂量灌胃后小鼠的表现反应o ”2 9 表4 - 2 0 2 l m l 2 0 9 b w 给酒剂量下不同处理对小鼠表现反应的影响3 0 表5 1 紫外线的辐照效应掣3 3 表5 - 2b 3 4 菌株的紫外诱变结果”3 3 表5 3 辐照处理正向突变菌株的遗传稳定性( 第l o 代) 3 4 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：铡、志、一 时间：2 乡年月巧日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：5 心志、一 时间：3 f 年彳月巧日 聊躲印琏 | 1 1 过量饮酒的危害 第一章绪论 酒是人类古老而又经久不衰的饮料，与人类生活有着密不可分的关系，民间自古就有“无酒 不成席”的说法。现代医学证明，少量饮酒可加速血液循环，消除疲劳，酒和药的结合还有增强 药效的作用【l l ，少量至中等量饮用葡萄酒可预防心血管疾病，降低某些肿瘤的发病率，如子宫内 膜癌、食管癌和贲门癌【2 1 0 但是在日常生活中，人们有的时候很难控制自己的酒量，容易饮酒过 量，因过量饮酒而导致的酗酒和长期饮酒所导致的酒精依赖不但危害个人的身心健康，而且引起 了一系列的社会问题。 1 i i 乙醇的吸收和代谢 乙醇由胃和十二指肠吸收，其中8 0 由小肠上段吸收，空腹饮酒时，1 5 h 内吸收达9 5 以上， 2 5 h 已全部吸收。胃内有食物存在，可延缓酒精的吸收。被吸收的酒精通过血液流遍全身，约9 0 经肝代谢酶系统乙醇脱氢酶( a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e ，a d h ) 和乙醛脱氢酶( a l d e h y d e h y d r o s e g e c n a s e ， a l d h ) 催化氧化生成乙醛，最后代谢为二氧化碳和水。中间生成的乙醛可刺激肾上腺素、去甲 肾上腺素等的分泌。 饮酒后乙醇迅速进入血液循环而分布全身，但乙醇在各个组织器官中分布不均，在脑、脊髓 和肝中含量最高，因此，乙醇对神经系统和肝脏的损伤也最为严重p l 。 1 1 2 对消化系统的危害 乙醇对人体脏器会造成不同程度的损害，在这里，首当其冲的就是肝脏。这是因为，乙醇本 身可妨碍乙醛脱氧酶的活性，使乙醛水平升高 4 1 ，而乙醛会损伤肝脏细胞的微结构，降低微管功 能，损伤线粒体等，促使肝间质的纤维组织增生，引起纤维变性，影响能量代谢并产生自由基， 使肝脏损害的风险增加并可引起肝内炎症细胞浸润；此外，肝内微粒体氧化酶对乙醇的代谢干扰 了细胞内氧化还原反应，从而使肝细胞内的脂肪、碳水化合物及蛋白质的代谢发生紊乱，造成肝 内的脂肪堆积，引起酒精中毒性肝炎、脂肪肝以及肝硬化【2 5 “】。酗酒引起脂肪肝的发病机制主 要有以下几个方面1 7 l ： ( 1 ) 酒精在肝内代谢时产生大量乙酰辅酶a ，同时导致体内n a d h 浓度 升高，使肝线粒体三羧酸循环受抑制，于是肝中游离脂肪酸( f f a ) 的合成与酯化增强，生成大 量t g ： ( 2 ) 乙醇造成肝细胞内膜脂质过氧化，线粒体结构、功能改变，蛋白质合成与分泌功能 受阻； ( 3 ) 乙醇代谢中间产物乙醛有毒性作用，能抑制肝内f f a 氧化，降低肝线粒体的转化与 呼吸功能，促进肝纤维化，干扰d n a 修复，干扰微管组装与聚集。 酒精对胃粘膜也有直接的刺激作用，可造成粘膜炎性反应，严重时造成大出血；长期的刺激 造成慢性胃炎，导致维生素等物质的吸收障碍而发生神经炎l s 】也使消化系统的肿瘤发病率增加。 由于酒精本身及代谢产物的细胞毒作用，导致胰腺实质进行性损害及纤维化，胰液粘稠，蛋 白沉淀，引起胰管引流不畅及结石形成，是急性和慢性胰腺炎的重要原因。 药物 乙醇 ( 乙醇) 毒性代谢物 、上 a d h m c o s 人上 乙醛 l v 醋酸盐 图1 1 乙醇在肝细胞中的代谢 f i glm e t a b o l i s mo f a l c o h o li nc e l lo f m e n sl i v e r ( 注：h 过多的氢当量，a d h 乙醇脱氢酶，m e o s - 微粒体乙醇氧化系统， n a d 烟酰胺腺嘌呤双核苷酸，n a d p 烟酰胺腺嘌呤双核苷酸磷酸盐) 1 1 3 对中枢神经系统的危害 脂肪肝 少量乙醇( 每1 0 0 m l 血液含乙醇5 0 1 0 0 m g ) 具有兴奋作用，这是由于乙醇能作用于脑中枢丫 氨基丁酸受体，抑制1 ，氨基丁酸对脑中枢的抑制所致。血中乙醇浓度增高时，对大脑皮质、边缘 系统、网状结构、小脑均可产生抑制导致相应的临床症状。浓度极高时( 每l o o m l 血液含乙醇达 4 0 0 m g ) 可抑制延脑中枢，导致呼吸循环衰竭而死亡。 研究表明，慢性酒精中毒病人均存在大脑萎缩和脑室扩大，大脑重量减轻，大脑皮层神经元 变性、缺失，神经细胞计数减少、胞体萎缩、轴突和树突减少，大脑白质中水含量增加、类脂和 磷脂含量减少，这些大脑结构异常是神经损害的基础。主要表现为人的正常行为能力受到抑制， 无法控制自己的行为，也会出现欣快多动、精神错乱、被害、关系妄想、人格改变、烦躁虚构、 幻觉等。 1 1 4 对其它身体器官的危害 过度饮酒可引起血压升高，使心肌负荷加大，耗氧量增加。心肌肥大而致缺血，诱发心绞痛、 心律失常，另外，酒精可延缓血液脂肪的清除，使甘油三酯浓度升高，加剧动脉特别是冠状动脉 硬化的发展，加重心肌供血不足，引起心肌衰弱，增加脑出血、心律失常、心肌梗死的风险。 2 d 加 峨 删 厂 h 炉 h d a a 大豆甙 葛根索。 w i n g m i n gk e u n g 等1 2 0 】发现，葛根的粗提物比大豆甙和大豆甙元纯品对g o l d e nh a m s t e r s 自由饮酒 的抑制作用大。 葛花是野葛的花，用于解酒、醒酒、厌食、呕吐等，葛花解醒汤为汉方中醒酒的代表方剂。 日本学者新甫勇次郎对葛花的有效成分及药理进行了研究，发现葛花中的甲醇提取物及其分离得 到的异黄酮、三萜皂甙及色氨酸衍生物等成分对乙醇诱发的代谢异常有抑制作用。 王平【列j 研究了枳棋子解酒机理，测定了枳棋子浸渍液( h p ) 对酒后人体乙醇代谢的影响， 结果表明，h p 可显著降低机体组织乙醇含量( 相对降低率为5 0 0 5 ) 及乙醇代谢排出量( 相对 降低率为5 2 7 3 ) 。任发政、罗云波等【2 2 2 3 l 以小鼠为研究对象对枳棋子解酒效果及机理进行研 究，认为，长期摄入乙醇引起肝脏a d h 、s o d 、g s t 酶活性降低，导致m d a 含量升高和g s h 含量下降，枳棋子提取液可拮抗乙醇引起的上述变化，较好的延迟和减少乙醇吸收的作用，能有 效地降低乙醇在体内的蓄积浓度，有良好的防醉和解酒功效。 王岳飞、郭辉华等1 2 4 l 研究发现茶多酚有显著的解酒作用，能够有效抑制小鼠的兴奋性，降低 其共济失调能力，提高其乙醇半数致死量。毛连根、俞洁行【2 5 l 对茶叶提取物的醒酒作用进行研究， 也得出了类似的结果。日本学者【2 6 j 研究已知结构的茶( c a m e l l i a s i n e n s i s ( l ) o k u n t z e ) 种子皂 苷，发现它可以抑制乙醇的胃肠吸收，同时促进已吸收的乙醇及乙醛的消除。t a k a m i 等人1 2 7 1 研 究绿茶对乙醇代谢的影响，发现其粗提物可以降低小鼠服用乙醇( 2 9 k e 班w ) 后血中的乙醇和乙 醛的浓度。进一步的实验表明绿茶中的咖啡因具有与粗提物相似的功效，没食子酸表儿茶素酯能 够对抗乙醇代谢后引起的乙酸和丙酮的升高，降低血中酸浓度，减轻副作用 段钟平、刘青等1 2 8 j 通过研究发现酒精攻击组大多数显示胃粘膜糜烂，上皮细胞脱落，肝脏严 重大泡性脂变，而乳酸菌保护组胃和肝脏组织学基本正常。乳酸菌液通过保护胃粘膜减少酒精从 胃内的吸收，减少细菌，内毒素移位，起到预防酒精性肝损伤的作用。 动物药中也含有解酒活性成分。日本学者分别给大鼠服用牛胆汁和猪胆汁，3 0 m i n 后再服用 乙醇( 1 9 k p g b w ) ，发现大鼠血中醇浓度分别降低2 5 和4 0 ，血浆乙醇达峰时间分别延长1 1 5 倍和l1 3 倍。但乙醇消除时间、a d h 及乙醛脱氢酶( a d l h ) 的活性与对照组相比并无变化。另 有文献报道牛胆汁主要通过延迟胃排空和抑制乙醇在肠道的吸收达到解酒目的，并确证牛磺酸为 其中有效成分1 2 川。 1 2 2 解酒药剂的研究进展 以葛根为主要原料的产品更是不胜枚举，如解酒冲剂【3 0 1 、醉翁乐【3 l 】、解酒保肝口服液1 3 2 】、葛 花解酒口服液3 3 1 等。曹薇琳等1 3 4 】研制的保肝解酒毒饮( 主要成分为葛根、茯苓、枸杞子和茶) 可 明显地缩短醒酒时间，对酒精性及化学性肝脏损伤具有明显的治疗效果，提高酒精耐受力的有效 率为9 6 4 ，对明显缩短醒酒时间的确认率为7 8 ，可缩短醒酒时间有一定作用的确认率为9 2 。 4 白雪松、韩春姬、李克【3 5 1 以小鼠为研究对象探讨复方轮叶党参制剂的解酒作用，发现复方轮 叶党参制剂组小鼠从醉酒到醒酒时间明显缩短，从饮酒到醒酒( 耐受) 的时间也明显缩短，因此 复方轮叶党参具有解酒作用。 1 2 3 解酒保健食品的研究进展 徐庆、韦玉先等i 3 6 】以小鼠和家兔为动物模型，观察冰糖醋对灌胃小鼠的行为和生存情况及对 灌酒家兔血中乙醇含量的影响。结果表明：冰糖醋可明显延长模型小鼠翻正反射消失潜伏期和降 低模型小鼠的死亡率，也可降低模型家兔血中乙醇含量。 金静敏、贾少谦纠3 7 】通过观察丹葛解酒茶对大鼠酒精性肝损伤血清a l t ( 丙氨酸氨基转移 酶) 、a s t ( 天门冬氨酸氨基转移酶) 值的变化，验证其对大鼠酒性肝损伤的防治作用，结果表 明丹葛解酒茶可以通过降低血清a l t 、a s t 的含量从而有效地防治大鼠的酒精性肝损伤。 彭勃、苗明三等【3 8 - 3 9 】通过观察橄榄解酒饮对大鼠急性酒精性肝损伤肝组织病理形态的影响， 发现橄榄解酒饮组肝小叶结构清晰，肝窦基本恢复正常，肝细胞索排列整齐，肝细胞浊肿明显恢 复，炎细胞浸润和点状坏死明显减少，肝细胞内仅见散在的细小脂滴，可见明显的肝细胞再生。 表明橄榄解酒饮能明显减轻白酒所致的肝组织病理损伤，可促进肝细胞恢复。他们还通过研究发 现橄榄解酒饮能明显降低大、小鼠急性酒精性肝损伤的肝指数、血清及肝匀浆t c h 、t g 水平， 而起到保肝作用。 贺银风、崔丽、王新亮1 4 0 】研制的解酒乳酸发酵饮料是以酸乳为原料配以中草药具有明显的解 酒效果，但其中起主要作用的是葛根、葛花、枳棂子，并未对乳酸菌的解酒作用作进一步的研究。 陈超、钱京萍、罗春华【4 1j 通过小鼠醒酒实验对生态动力素( e d c ) 的醒酒作用进行研究，结 果发现e d c 对小鼠具有明显的抗醉醒酒作用，对白酒引起的急性肝损伤也有一定的保护作用， 在白酒中加入一定浓度的生态动力素，可以减轻酒精对肝脏的损伤作用。 1 3 本研究的目的和意义 芽孢杆菌( b a c i l l u s ) 是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌，多数为化能 异养菌，主要分布于土壤、植物体表面及水体中，由于它们能够产生对热、紫外线、电磁辐射和 某些化学药品有很强抗性的芽孢，因此能忍受多种不良环境【4 2 1 。芽孢杆菌中存在很多特殊功能 的菌株，在工业、农业、医学、军事和科学研究中有广泛的应用价值。 1 应用于酶制剂工业 淀粉酶的生产和应用处于整个酶制剂的首位，大多数的芽孢杆菌都能够产生胞外淀粉酶。2 0 世纪初，德国的b o i d e n 和e f f r o n t 先后从枯草芽孢杆菌培养液中分离出淀粉酶1 4 3 】。7 0 年代后期， 人们开始用巨大芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，多粘芽孢杆菌和蜡质芽孢杆菌等生产b 淀粉酶。后来 发现嗜热脂肪芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等能产生耐高温的q 淀粉酶。 蛋白酶可用于制革、丝绸工业、加酶洗涤剂的制造，多以地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和短 小芽孢杆菌等为生产菌【4 4 “5 1 。嗜热脂肪芽孢杆菌等嗜热细菌大多能产生耐高温且热稳定性强的碱 性蛋白酶，因此作为酶制剂的生产菌种是当前国内外研究的热点。 5 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 纤维素酶是一种多组分酶系，包括三类性质不同的酶：外切p 1 ，4 葡聚糖酶、内切t 3 - 1 ， 4 葡聚糖酶、1 3 葡萄糖苷酶。1 9 7 0 年，u n l i v e r 公司的研究人员首先发现嗜碱性芽孢杆菌产生 的碱性纤维素酶，作为洗涤剂的添加剂可以增强洗涤效果。田亚平等【4 6 】报道，嗜碱性芽孢杆菌产 生的纤维素酶，其去污效果与生产发酵工艺有关。近年的研究表明，生产碱性纤维素酶的微生物 大多数是属于芽孢杆菌，包括耐碱菌和嗜碱菌1 4 n ，如b a c i l l u ss p k 5 2 2 ，b a c i l l u ss p k 5 8 8 ，b a c i l l u s s p k 一5 8 0 ，b a c i l l u ss p k 一1 9 等。 2 应用于益生菌制剂、微生物肥料的生产 微生物肥料中所用的固氮菌种( 包括根瘤菌和自生固氮菌等) 由于不能产生芽孢，虽有较强 固氮能力，但抗逆性低，只能制成液体菌剂使用，且易受到污染变质或失水干燥导致失效。1 9 5 8 年，前苏联首次发现有固氮活性的芽孢杆菌【4 引，后来从土壤中发现和分离的有固氮作用的芽孢杆 菌越来越多。现在国际上公认的有较高固氮能力的芽孢杆菌有3 种，多粘芽孢杆菌( b a c i l l u s p o l y m y x a ) ，浸麻芽孢杆菌( 曰m a c e r a n s ) 和固氮芽孢杆菌( b a c i l l u sa z o t o f i x a n ) 1 4 9 5 0 1 。此外， 也有关于巨大芽孢杆菌与球形芽孢杆菌混合培养时具有固氮增效作用的报道1 5 1 l 。 1 9 8 9 年，美国食品与药物管理局( f d a ) 和饲料工业协会公布的可以直接喂养动物的微生物 中，芽孢杆菌有五种，分别是凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和地 衣芽孢杆菌f 5 2 1 。其中，地衣芽孢杆菌可使育肥猪的质量明显提高【5 3 】，枯草芽孢杆菌b s 9 5 4 粉剂作 为鸡饲料添加剂，对鸡的生长有促进作用【5 4 】。 3 用于微生物农药的生产 微生物农药是利用微生物本身或其代谢产物防治病、虫、杂草的制剂。1 9 0 5 年，在日本猝倒 病的家蚕体内发现苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ) ，其在芽孢形成的同时，产生一种高 毒力的蛋白质伴孢晶体，主要作用于鳞翅目、双翅目和翘翅目的幼虫，造成肠膜损伤而死亡。后 经试验发现它对包括植物寄生线虫在内的无脊椎动物的4 个门、节肢动物门的9 个目都具有生物 毒性【5 5 矧。在我国也有学者分离到对白菜软腐病【5 7 1 、小麦赤霉病【5 8 1 等有抑制作用的菌株。 4 广泛应用于医学领域 目前用于活菌制剂的芽孢杆菌主要有蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等。枯草 芽孢杆菌活菌剂作为口服液用于治疗肠炎、支气管炎等多种疾病，也用来预防和治疗烧伤创面的 感染，比铜绿假单孢菌更为有效i s 9 1 。利用地衣芽孢杆菌生产的“整肠生”可治疗由于各种原因引 起的肠道菌群失调别6 0 1 。利用蜡样芽孢杆菌生产的促菌生对婴儿浅部念珠菌感染有显著疗效【6 1 j 。 此外，芽孢杆菌在食品领域也有广泛应用，其菌体或发酵产物被制备成各种制剂添加在食品 当中【6 醐l 。 芽孢杆菌由于具有抗逆性强、易保存等特点，虽然已在各个领域被广泛应用，但是仍具有进 一步开发利用的潜力和价值。本研究旨在筛选出具有解酒能力的芽孢杆菌，并对其进行研究，从 而为开发益生菌解酒产品奠定基础。 - 6 中国农业大学硕士学位论文第二章解酒芽孢杆菌的分离筛选与初步鉴定 2 1 前言 第二章解酒芽孢杆菌的分离筛选与初步鉴定 酒是人类古老而又经久不衰的饮料1 6 卯，与人类生活有着密不可分的联系。但是过量饮酒不但 危害个人的身心健康，而且引起了一系列的社会问题。因此研究开发醒酒、解酒的药剂和保健食 品以减少酒精对人体和社会的危害成为国内外共同关注的课题1 6 6 1 。目前，国内外学者的研究主要 集中在对于动植物体内功能成分的研究，例如葛根素、大豆甙、大豆甙元、茶多酚以及动物胆汁 等【1 9 2 0 矧出3 5 6 7 1 。国外也有学者对丫羟基丁酸和糖精、蔗糖等化学物质的解酒作用进行了研究 陋6 9 1 。 芽孢杆菌( b a c i l l i ) 是一类数量众多且具有多样性的、需氧或兼性厌氧、杆状、革兰氏阳性 ( 或可变) 、在一定条件下能形成内生孢子的细菌。由于能够产生抗逆性强的芽孢，在自然界分 布广泛，因此与人类关系极为密切，在食品、农业、工业、医学、林业、环保乃至军事等诸多方 面均有重要用途。其中纳豆芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等已在食品工业中得到广泛 应用。而且，芽孢杆菌具有繁殖快、生长周期短、易保存等特点，在食品工业生产中具有广阔的 应用前景。本章旨在分离筛选出具有一定解酒能力的芽孢杆菌，为益生菌解酒产品的开发奠定基 础。 2 2 材料与方法 2 2 1 材料 2 2 1 1 分离材料 炒稻芽，苦参片，木通片，龙胆草，广桔核，荔枝核，炙槐角，金银花，透骨草，韭菜子， 白葱子，红豆蔻等中草药。 2 2 1 2 培养基( 无特殊说明均为蒸馏水配制) ( 1 ) l b 培养基：胰蛋白胨1 0 9 l ，酵母浸膏5 9 l ，n a c l1 0 9 l ，p h 7 0 ，1 2 1 蒸汽灭菌2 0 m i n 。 ( 2 ) 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 9 l ，蛋白胨1 0 9 l ，n a c i5 9 l ，p h 7 0 7 2 ，1 2 1 蒸汽 灭菌2 0 m i n 。 ( 3 ) 唯一碳源基础培养基：( n h 4 h s 0 42 0 9 l ，m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 l ，n a 2 h p 0 40 5 9 l ， c a c l 2 2 h 2 0o 1g l ，k 2 h p 0 40 5 9 l ，p h 7 0 7 2 ，121 蒸汽灭菌2 0 m i n 。 ( 4 ) 唯一氮源基础培养基：k h 2 p 0 41 3 6 9 l ，c a c l 2 2 h 2 00 0 0 5 9 l ，n a 2 h p 0 42 13 9 l ，葡萄 糖1 0 9 l ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 0 0 5 9 l ，p h 7 0 7 2 ，1 2 1 蒸汽灭菌2 0 m i n 。 ( 5 ) 筛选培养基( i ) ：k h 2 p 0 41 0 9 l ，m g s 0 40 3 9 l ，n a c l0 1 9 l ，f e c l 30 0 1 9 l ，f n n 4 h s 0 4 5 9 l ，琼脂2 0 9 l ，p h 7 0 ，1 7 1 蒸汽灭菌2 0 m i n ，无水乙醇经无菌过滤后加入到培养基当中， 添加量为2 ( r y ) 。 ( 6 ) 营养琼脂培养基：牛肉膏3 9 l ，蛋白胨1 0 9 l ，n a c i5 9 l ，琼脂1 5 - 2 0 9 l ，p h 7 0 7 2 ， 1 2 1 蒸汽灭菌2 0 m i n 。 ( 7 ) 肉汁胨培养基：牛肉浸膏3 9 l ，蛋白胨5 9 l ，p h 7 0 ，1 2 1 蒸汽灭菌2 0 m i n 。 ( 8 ) 菌种鉴定培养基 形态及培养特征鉴定试验( i i ) ：营养琼脂培养基。革兰氏染色时以大肠杆菌( g 。) 和金黄 色葡萄球菌( g + ) 作对照。 糖醇发酵试验( i i i ) ：( n h 4 ) 2 h p 0 4l g l ，m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 l ，k c l0 2 9 l ，酵母浸膏0 2 9 l ， 琼脂5 - 6 9 l ，糖或醇类1 0 9 l ，0 0 4 溴甲酚紫1 5 m l l ，p h 7 2 。将上述培养基分装试管，并将杜 兰管口朝下放入试管，11 5 c 蒸汽灭菌3 0 m i n 。 v - p 试验( i v ) ：蛋白胨5 9 9 x ，k 2 h p 0 45 9 l ，葡萄糖5 9 l ，p h 7 0 。将上述培养基分装试管， 1 2 1 蒸汽灭菌2 0 m i n 。 接触酶试验( v ) ：3 ( v v ) 过氧化氢溶液。 硝酸还原试验( v i ) ：肉汁胨培养基1 0 0 0 m l ，k n 0 3l g ，p h 7 0 - 7 6 ，将上述培养基分装试管， 1 2 1 1 2 蒸汽灭菌2 0 m i n 。 耐盐性试验( v i i ) ：n a c l 浓度分别为2 0 9 l 、5 0 9 l 、7 0 9 l 、l o o g l 的营养肉汤培养基，p h 7 0 - 7 2 ， 1 2 1 蒸汽灭菌2 0 m i n 。 石蕊牛奶试验( ) ：脱脂牛奶中加入2 5 石蕊水溶液，混合至颜色呈紫丁香花色为适度， 然后分装试管，11 5 蒸汽灭菌2 5 r a i n 。 柠檬酸盐利用试验( ) ：n a c l1 9 ，l ，m 0 4 7 t - 1 2 00 2 9 l ，n h , h 2 p 0 40 s g l ，柠檬酸钠 2 9 l ，将以上成分加热熔解，调p h 6 8 后加入指示剂0 0 4 酚红溶液2 0 m l l ，分装试管，1 2 1 蒸汽灭菌2 0 r a i n ，摆斜面。 明胶水解试验( x ) ：蛋白胨5 9 l ，明胶1 0 0 - 1 5 0 9 l ，p n 7 2 7 4 ，分装试管，11 5 c 蒸汽灭 菌2 0 m i n 。 酪素分解试验( x i ) ：干酪素4 9 l ，胰酶解酪蛋白o o s g l ，k i - 1 2 p 0 40 3 6 9 l ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 5 9 l ，z n c l 20 014 9 l ，n a 2 h p 0 4 7 h 2 01 0 7 9 l ，n a c io 16 9 l ，c a c l 20 0 0 2 9 l ，f e s 0 40 0 0 2 9 l ， 琼脂2 0 9 l ，p h 6 5 7 0 ，1 2 1 蒸汽灭菌2 0 m i n 。 淀粉水解试验( ) ：可溶性淀粉2 0 9 l ，k n 0 3l g l ，n a c l0 5 9 l ，k 2 h p 0 40 5 9 l ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 1 9 l ，琼脂2 0 9 l ，p h 7 0 7 2 ，1 2 1 蒸汽灭菌2 0 m i n 。 厌氧生长试验( x h i ) ：将牛肉膏蛋白胨培养基分装厌氧管，充氮除氧，1 2 1 蒸汽灭菌2 0 m i n 。 卵磷脂酶试验( x i v ) ：无菌条件下取卵黄加等量生理盐水摇匀，向融化到5 0 5 5 的肉汁 胨琼脂中加入5 0 m l l 上述悬液，混合均匀后倒入培养皿内，制成卵黄平板，备用。 唯一碳源利用试验( xv ) ：将以下2 1 种含碳化合物按照o 1 ( w v ) 的终浓度与唯一碳 源基础培养基混合，p h 7 0 - 7 2 ，1 2 1 蒸汽灭菌2 0 m i n 。含碳化合物：葡萄糖、d 果糖、麦芽糖、 蔗糖、棉籽糖、木糖、半乳糖、c l 哥l 糖、海藻糖、d 纤维二糖、d 甘露醇、d 山梨醇、淀粉、乙 酸钠、柠蒙酸三钠、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸。 唯一氮源利用试验( x v i ) ：将以下1 5 种含氮化合物按照o 1 ( w g ) 的终浓度与唯一氮 源基础培养基混合，p h 7 0 - 7 2 ，1 2 l 蒸汽灭菌2 0 r a i n 。含氮化合物：柠檬酸铵、硫酸铵、酒石 酸铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、钼酸铵、草酸铵、硝酸铵、亚硝酸钠、精氨酸、苯丙氨酸、酪 胺酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸。 8 2 2 1 3 主要试剂 a 乙醇标准液：精密吸取无水乙醇适量，加入去离子水中，配成不同浓度的乙醇标准液( 0 2 、 0 4 、0 6 、0 8 、1 o ，功。 b 重铬酸钾硫酸溶液：取重铬酸钾0 2 9 溶于1 0 m l 水中，加1 8 n 硫酸至1 0 0 m l 。 2 2 1 4 实验动物 昆明种小白鼠2 0 只，四周龄，雄性，体重1 8 2 2 9 ，二级( 清洁级) 动物，由北京大学医学 部实验动物中心提供。 2 2 1 5 饲料 普通鼠全价颗粒饲料i i 号，北京科澳协力饲料有限公司。 2 2 1 6 仪器设备 电热恒温培养箱湖北黄石医疗仪器厂 超净工作台 哈尔滨东联电子设备有限公司 恒温水浴锅北京医疗设备厂 高速离心机北京医用离心机厂 电热式压力蒸气消毒器上海博迅设备厂 7 5 2 分光光度计上海精密科学仪器厂 t g l 16 c 离心机上海安亭科学仪器厂 p h s 2 5 型p h 计 上海精科雷磁 2 2 1 7 模式菌株及参比指示菌 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i sc g m c c1 9 4 31 )购自中国普通微生物菌种保藏管理中心 地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s )中国农业大学食品微生物实验室保存菌种 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o bk 1 2 )中国农业大学生物学院馈赠 金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 中国农业大学食品微生物实验室保存菌种 2 2 2 方法 2 2 2 1 乙醇浓度的测定方法1 7 叫 向广口瓶中加入重铬酸钾硫酸溶液2 0 m l ，每个青霉素瓶中加入乙醇标准溶液或水0 2 m l ， 并将其放入广口瓶中，盖好广口瓶盖，并用封口膜密封。 将广口瓶置于5 0 6 0 c 的水域中2 h ，使乙醇充分挥发，并被重铬酸钾硫酸溶液氧化。 取出青霉素瓶，向广1 3 瓶中加入8 0 m l 蒸馏水，充分混匀后，于波长6 0 0 n m 处测定重铬酸钾 - 硫酸溶液的吸光值。以乙醇浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，制作乙醇标准曲线。 将待测样品的吸光值与标准曲线进行对照，即可得到样品中的乙醇浓度。 2 2 2 2 筛选方法 1 ) 初筛：将分离样品加适量无菌水浸泡，用振荡器振荡3 0 s ，静置过夜。然后置于8 0 c 水 浴中l o m i n ，经适当稀释后涂布于筛选培养基( i ) 平板，3 7 c 培养4 8 小时。挑取单菌落，经平 板划线分纯后保存于l b 斜面，备用。 2 ) 复筛：将初筛得到的菌株接种于l b 培养基，3 7 ( 2 培养1 2 小时，得到种子液。然后再将 9 种子液接种到l b 培养基( 接种量1 ，3 0 0 m l 摇瓶装液量5 0 m 1 ) ，3 7 。c 、1 4 0 r m i n 条件下振荡 培养4 8 小时。 向1 0 m l1 ( v v ) 的乙醇标准液当中加入1 0 m l 发酵液，于3 7 c 恒温培养箱中放置3 0 m i n ， 然后按照2 2 2 1 所述的方法，测定乙醇的残留量。 2 2 2 3 菌株的菌体菌落形态及生理生化鉴定1 7 1 j 糖醇发酵试验：将菌株接种到培养基i i i 上，3 7 。c 培养l d 、3 d 、5 d 后观察，若杜兰管底部有 气泡产生即为阳性反应。 v p 试验：将菌株接种到培养基上，3 7 c 培养2 4 h ，取出适量培养液与等量4 0 k o h 溶液 混合，再加入0 5 1 0 m g 肌酸，猛烈振荡，2 1 0 m i n 内有红色出现即为阳性反应。 接触酶试验：将菌株接种到培养基v 上，3 7 c 培养2 4 h ，用接种环挑取一环抹在滴有3 ( r v ) 过氧化氢溶液的玻片上，观察是否有气泡产生，产生气泡即为阳性反应。 硝酸还原试验：将菌株接种到培养基上，3 7 c 培养4 8 h ，向培养液中加入格利斯亚硝酸试 剂i 、i i 各一滴，若出现红色，即为阳性反应：若不出现红色，则向培养液中加入锌粉并加热， 再加入格利斯亚硝酸试剂i 、i i 各一滴，若出现红色，则证明硝酸盐仍存在，即为阴性反应，若 不出现红色，证明硝酸盐已被还原，即为阳性反应。 耐盐性试验：将菌株接种到培养基上，3 7 培养2 4 h ，观察生长情况，能够生长即为阳性 ( 以不含n a c i 的培养基为对照) 。 石蕊牛奶试验：将菌株接种到培养基上，3 7 培养2 4 h ，观察可能出现的各种现象( 还原： 石蕊自上而下退色；产酸：石蕊变红；产碱：石蕊变蓝；胨化：石蕊牛奶变得澄清透明；酸凝： 石蕊牛奶变红并凝固) 。 柠檬酸盐利用试验：将菌株接种到培养基上，3 7 ( 2 培养2 4 h ，观察培养基颜色，若培养基 呈红色即为阳性反应，若培养基呈黄色即为阴性反应。 明胶水解试验：将菌株接种到培养基x 上，2 0 培养4 8 h ，观察菌落生长处的培养基，有液 化现象的即为阳性反应。 酪素分解试验：将菌株接种到培养基上，3 7 c 培养2 4 h ，观察菌落周围是否有透明圈出现， 出现透明圈即为阳性反应 淀粉水解试验：将菌