（食品科学专业论文）采用PCRDGGE方法研究浙江玫瑰醋酿造过程中的微生物多样性.pdf

浙江t 商大学硕士学位论文 采用p c r d g g e 方法研究浙江玫瑰醋酿造 过程中的微生物多样性 摘要 浙江玫瑰醋是一种复杂微生物参与的传统发酵食品。利用 p c r d g g e 技术研究传统发酵食品中的微生物多样性，不仅能够获得 群落中优势种类信息，而且能够同时分析多个样品，从而获得发酵过 程中复杂的微生物群落演变规律。本文通过提取玫瑰醋样品中的基因 组d n a 作为模板，对细菌的1 6 sr d n av 3 区和真菌1 8 sr d n a 进行扩 增，再将p c r 产物用变性梯度凝胶电泳( d g g e ) 进行分析，通过对 d g g e 图谱的统计分析和1 6 sr d n a 序列分析研究浙江玫瑰醋中微生 物群落结构的组成和演变规律。 对玫瑰醋样品中基因组d n a 的提取方法进行了探索，通过比较 发现传统的c r a b 法比试剂盒法更适合食醋中基因组d n a 的提取，容 易得到高浓度的d n a ，较真实的反映了浙江玫瑰醋中的微生物群落 结构和组成。对p c r 扩增的引物和反应程序进行优化，结果表明：( 1 ) 带有“g c 发夹”结构的p c r 产物在d g g e 分析时能得到较好的分离效 果，而不带有“g c 发夹”的p c r 产物在d g g e 胶中由于具有相似的电泳 行为不能被分离；( 2 ) 降落p c r 与普通p c r 相比，前者的p c r 产物在数 量和特异性方面都较后者好。 浙江t 商大学硕士学位论文 利用d g g e 垂直胶确定了细菌和真菌d g g e 水平电泳的最佳变性 梯度，分别为3 5 - - 一5 5 和3 0 5 0 。利用时间进程法确定了d g g e 水平电泳的最佳电泳时间为4 h 。 对不同发酵时间的浙江玫瑰醋样品中的基因组d n a 进行p c r 扩 增，获得的p c r 产物进行d g g e 电泳分析，细菌和真菌在d g g e 中的 分散度都非常好，细菌d g g e 指纹图谱中有1 0 个明显的主要条带，真 菌d g g e 指纹图谱中有7 个较明显的主要条带。 将从玫瑰醋中分离纯化得到的细菌与不同发酵阶段混合菌群的 d g g e 指纹图谱进行条带匹配分析，发现条带a 与细菌a n 的条带发生 匹配，在d g g e 胶中具有相同的电泳行为，经1 6 sr d n a 序列分析鉴定 为巴氏醋杆菌。对d g g e 胶中的其它8 个条带进行回收，并通过序列 分析建立文库。再将获得的1 6 sr d n a 序列登陆n c b i 与已知序列进行 比对，得到6 个发酵过程中的优势细菌，其中醋酸菌2 种，分别是巴氏 醋杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌；乳酸菌5 种，分别是肠膜明串珠菌肠膜 亚种、罗伊氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌。 真菌条带的d n a 序列由于存在特殊结构无法进行分析，尚在鉴定中。 将1 6 sr d n a 的序列分析结果与d g g e 指纹图谱相结合，进一步 阐明了浙江玫瑰醋整个发酵阶段的微生物群落演变规律。整个发酵过 程微生物群落结构由复杂变为简单，并且发花阶段和发酵阶段的微生 物群落结构有较明显的差异。发花阶段鉴定到的细菌有肠膜明串珠菌 肠膜亚种、罗伊氏乳杆菌、干酪乳杆菌和巴氏醋杆菌4 种；发酵阶段 鉴定到的细菌有巴氏醋杆菌、氧化葡萄糖酸杆菌、罗伊氏乳杆菌、保 i l 浙江工商人学硕+ 学位论文 加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌。肠膜明串珠菌肠膜亚种只在发酵第9 天 和第1 1 天的样品中检测到。罗伊氏乳杆菌在发酵第1 3 天至4 9 天的 样品中检测到，且条带的亮度随发酵的进行逐渐减弱。干酪乳杆菌只 在发酵第1 3 天的样品中被检测到。嗜酸乳杆菌在发酵第1 8 天至3 3 天的样品中检测到较亮的条带，随后条带的亮度减弱甚至消失。氧化 葡萄糖酸杆菌在发酵第1 2 9 天后的样品中均检测到较亮的条带，说明 此菌种在发酵1 2 9 天后才迅速生长繁殖成为优势菌种。巴氏醋杆菌在 发花阶段快结束时才开始生长繁殖。罗伊氏乳杆菌对应的条带在第 4 9 天后的样品中均未检测到。而保加利亚乳杆菌和巴氏醋杆菌在所 有样品中均检测到较亮的条带，即在整个发酵过程中始终保持优势地 位。浙江玫瑰醋发酵成熟时细菌群落组成为保加利亚乳杆菌、巴氏醋 杆菌和葡萄糖酸杆菌。 关键词：浙江玫瑰醋；p c r ；变性梯度凝胶电泳( d g g e ) ；1 6 sr d n a 序列分析；微生物多样性 i i i 浙江工商大学硕士学位论文 a n a l y s i s0 fm i c r o b i a ld i v e r s i t yi nz h e j i n g r o s yr i c ev i n e g a rb yp c r d g g e d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ( d g g e ) i so n eo ft h em o s t c o m m o n l yu s e dm o l e c u l a rm e t h o d si na n a l y s i so fm i c r o b ed i v e r s i t i e s i t i sb a s e do nt h es e p a r a t i o no fp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) a m p l i c o n s o ft h es a m es i z eb u td i f f e r e n ts e q u e n c e s b a n d sf r o mm e m b e r so ft h e s a m es p e c i e ss h o w e dt h es a m em i g r a t i o nd i s t a n c ei nd e n a t u r i n gg e l ， h e n c es u p p o r t i n gt h ei d e n t i f i c a t i v ev a l u eo ft h em e t h o d d g g ea r en o w r o u t i n e l y u s e di n m a n ym i c r o b i o l o g i c a l l a b o r a t o r i e sw o r l d w i d ea s m o l e c u l a rt o o l st oc o m p a r et h ed i v e r s i t yo fm i c r o b i a lc o m m u n i t i e sa n dt o m o n i t o rp o p u l a t i o nd y n a m i c s t h ed y n a m i c sa n dd i v e r s i t yo ft h em i c r o b i a lc o m m u n i t yo fz h e j i a n g r o s yr i c ev i n e g a rw a ss t u d i e db yp c r d g g e t h et o t a ld n a o fb a c t e r i a i nz h e j i a n gr o s yr i c e v i n e g a rw a sd i r e c t l ye x t r a c t e dw i t h o u tc u l t u r e c r a bm e t h o da n dk i t sm e t h o dw e r ec o m p a r e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h ec t a bm e t h o dw a sb e t t e rt h e nt h a to fk i t s t h ev 3r e g i o n so f1 6 s v 浙江工商人学硕士学位论文 r i b o s o m a ld n aa n d18 sr i b o s o m a ld n aw e r et h e na m p l i f i e dw i t h u n i v e r s a lp r i m e r sf 3 5 7 - g c r 518a n df 1 4 2 7 - g c r 1616a n dt h es q u e n c e s u s e df o rd g g e a n a l y s i s t h ea d d i t i o no fa4 0b pg cc l a m pt oo n eo ft h e p c r p r i m e r s i n s u r e dt h a tt h e f r a g m e n t w o u l dr e m a i n p a r t i a l d o u b l e - s t r a n d ，a n dt h er e g i o ns c r e e n e dw a si nt h el o w e s tm e l t i n gd o m a i n d i f f e r e n td n a s a m p l e sf r o mt h eb e g i n n i n go ff e r m e n t a t i o np r o c e s st ot h e e n dw e r ea n a l y z e d i nt h ed g g ep r o f i l e s ，t h eb r i g h t e rb a n d sr e p r e s e n tt h ed o m i n a n t b a c t e r i a t h es e q u e n c e so ft h er e c l a i m e ds p e c i f i cb a n d sw e r eo b t a i n e d c o m p a r i s o no fv 3r e g i o n so f1 6 sr i b o s o m a ld n as e q u e n c es i m i l a r i t y r e v e a l e dt h a tt h e d o m i n a t i n g m i c r o b i a l s p e c i e s w e r ea c e t o b a c t e r p a s t e u r i a n u s ，l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i i s u b s p b u l g a r i c u s ， m e s e n t e r o i d e s ，l a c t o b a c i l l u sr e u t e r i ，l a c t o b a c i l l u sc a s e i ，l a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u sn c f ma n d f i n a l l y , p h y l o g e n e t i ct r e eo ft h e s eb a n d sw a s m a d e o fw h i c h ，a c e t o b a c t e r p a s t e u r i a n u sa n dl a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i i s u b s p b u l g a r i c uo c c u r r e da l o n gt h ew h o l ef e r m e n t a t i o np r o c e s s ，w h i l e g l u c o n o b a c t e ro x y d a n sw a sf i r s t l yi d e n t i f i e di nt h er o s ev i n e g a r ，j u s t o c c u r r e di nt h el a s t p h a s e a n d ad r a m a t i cs h i f t si nt h em i c r o b i a l c o m m u n i t ys t r u c t u r eb e t w e e nf a h u ap h a s ea n df e r m e n t a t i o np h a s ew a s i n d i c a t e d o n l yl b b u l g a r i c u s ，g o x y d a n sa n da p a s t e u r i a n u sd o m i n a t e d i nt h el a s tp h a s eo ft h ef e r m e n t a t i o n v i 浙江工商大学硕士学位论文 t h ed y n a m i cc h a n g e si nf u n g a lc o m m u n i t y d u r i n gt h ef e r m e n t a t i o n o fz h e j i a n gr o s yr i c ev i n e g a rw e r es h o w e di nt h ed g g ep r o f i l e s t h e p e r i o df r o md a y4t od a y3 8w a sc h a r a c t e r i z e db y4b a n d sw i t hh i g h i n t e n s i t y , a n dt h ef o l l o w i n gd a y ss h o w e dad e c r e a s ei nt h ei n t e n s i t yo f t h e s eb a n d s a l lf u n g a lb a n d sw a sd i s a p p e a r e di nt h el a s tp h a s eo ft h e f e r m e n t a t i o n d n a s e q u e n c eo ft h e s eb a n d sc o u l d n tb ed e t e c t e db e c a u s e o fs p e c i a lf r a g m e n t k e y w o r d s ：z h e j i a n gr o s y r i c e v i n e g a r ；d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e l e l e c t r o p h o r e s i s ( d g g e ) ；1 6 sr d n as e q u e n c i n ga n a l y s i s ；m i c r o b i a l d i v e r s i t y i 浙江工商大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得浙江工商大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的 材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 签名： 丛益遂日期：砂口年f 月，乙日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解浙江工商大学有关保留、使用学位论文 的规定：浙江工商大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内 容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：动国缸 导 日期：卅7 年 终多 u 】j 浙江t 商大学硕士学位论文 1 1 浙江玫瑰醋的概述 1 1 1 食醋的概述 第一章引言 酿造食醋为单独或混合使用各种含有淀粉、糖的物料或酒精，经微生物发酵 酿制而成的液体调味品。酿造食醋按发酵工艺分为两类：固态发酵食醋和液态发 酵食醋。固态发酵食醋是以粮食及其副产品为原料，采用固态醋醅发酵酿制而成 的食醋。液态发酵食醋是以粮食、糖类、果类或酒精为原料，采用液态醋醪发酵 酿制而成的食醋。 我国的名醋有山西老陈醋、镇江香醋、浙江玫瑰醋、四川保宁麸醋、福建红 曲老醋、天津独留老醋和河南彰德陈醋等【1 1 。这些醋具备各自独特的制作工艺和 特殊风味，享誉国内外。我国的传统食醋质量好，生产工艺有合乎科学的一面， 是我国人民智慧的结晶，民族的宝贵遗产，应该要继承和发杨。日本横井酿造工 业株式会社曾对我国食醋进行检测并与日本醋对比。我国食醋的各项质量指标均 高于日本米醋，其中氨基酸为日本米醋的1 0 倍，不挥发酸为日本米醋的1 5 , - - , 2 倍， 总酸比日本醋高，而刺激感较日本米醋小。 食醋所包含的成分，含量比较多的是糖分、钠、钙等。食醋有机酸种类繁多， 含量最高的是醋酸，醋的气味是由醋酸所产生的。食醋中还有多种还原糖，如： 葡萄糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、棉子糖、纤维二糖、甘油、山 梨醇、糊精等。醋中含有丰富的氨基酸，氨基酸和有机酸一样是醋的重要成分。 严格地讲，氨基酸也是一种有机酸，是蛋白质分解形成的化合物。氨基酸的种类 很多，目前已知的有二十余种。醋的味道鲜美、圆润、柔和，均是氨基酸的功力。 多种氨基酸混合产生醋的美味，和有机酸的酸味混合产生醋的芳香。此外醋中还 有磷酸、铜、钙等无机物质，葡萄糖、乳糖等糖分，以及酒精、酯等产生芳香的 成分。食醋中丰富的营养成分，使得食醋具有各种保健功能，如抗菌杀菌作用、 分解乳酸，消除疲劳、降血压和降血脂及抗氧化功能等。 浙江工商大学硕士学位论文 1 1 2 浙江玫瑰醋的简介及工艺特色 浙江玫瑰醋与镇江恒顺香醋、山西老陈醋、四川老法麸醋一起被称为中国四 大名醋，与浙江绍兴老酒齐名。中国医药大典记载，“醋产浙江杭绍二县为最 佳 ，指的就是浙江玫瑰醋。浙江玫瑰醋是以大米为原料，在浙江省地理环境下， 利用自然界的微生物或部份添加曲霉、酵母菌等微生物，经表面静置液态发酵法 酿造而成的，不添加任何色素、酸味剂、甜味剂，具有玫瑰红色的酿造食醋。该 食醋与普通食醋不同，它具有独特的玫瑰红色，有光泽，醋香纯正，酸味柔和绵 长，稍有甜味【2 】。 浙江玫瑰醋传统生产投料期从农历立夏开始至大暑，到立冬发酵成熟，糖化 期不少于1 2 天【3 1 。其主要生产工艺如下： 大米+ 浸泡洗净沥干蒸熟冷却搭窝发花( 糖 化过程) 加水进行酒精发酵和醋酸发酵成熟- 压榨煎醋贮存 包装 我省玫瑰米醋主要有杭州食品酿造总厂的玫瑰米醋、绍兴酿造厂的玫瑰米 醋、温州乌衣红曲玫瑰醋、宁波红醋等。浙江玫瑰米醋的生产工艺特色主要包括 以下几点：( 1 ) 采用特制液体表面发酵工艺；( 2 ) 浙江玫瑰醋的原料是大米；( 3 ) 玫 瑰醋发酵过程中的微生物来源主要是草盖；( 4 ) 酿造温度遵循前低、中高、后低 的自然发酵规律。浙江玫瑰醋的生产工艺是江南一带人民长期以来根据杭嘉湖地 区四季气候温差变化所创造出的一种符合自然微生物发酵规律的制醋方法。它一 般只能在传统投料期投料，而且生产周期长，陈酿期长。 1 1 3 浙江玫瑰醋的现状 草盖富集了食醋酿制所需的微牛物，如霉菌、酵母菌、醋酸菌。所含菌类多， 酶系全，代诩 和降解产物多，在酿醋过程中，不仅产生多种有机酸，并派生出许 多有益风味物质。经过生产前的草盖晾晒以后，草盖形成了相对稳定的微生物生 态，形成了浙江玫瑰醋j x l 格特异的传统酿造制品的微生物基础。草盖开放式富集 的大量环境微生物菌体，也带来很多问题： ( 1 ) 菌株来源复杂。来自草盖和自然环境中的野生菌株，生化性能表现不一， 2 浙江工商大学硕十学位论文 发酵过程受到环境的制约，使玫瑰醋质量很不稳定，而且增加了有害菌类污染的 可能。 ( 2 ) 采用作坊式生产，占地广，生产水平低下，劳动强度大，工艺控制大都 依靠员工的实际经验，出品率、质量指标极不稳定。产品品质易受环境、气候、 生产中主辅料、工艺实施的多变性及许多突发性的影响，产品的卫生状况、重现 性较差。 ( 3 ) 生产周期长，传统玫瑰醋的生产从四、五月份开始投料、到十一月份成 熟，很难满足市场需要。 浙江玫瑰醋是一种复杂微生物参与的传统发酵食品，要进行各方面改革，首 先要对浙江玫瑰醋的传统工艺和微生物来源及演化规律进行深入研究，这是首要 的环节，也是其它各项工作开展的前提条件。因此，我们迫切需要一种新的研究 手段对浙江玫瑰醋的微生物群落结构变化进行研究，并对其发酵过程中的优势菌 种进行改进，从而改善其生产工艺，缩短生产周期。 1 2 传统发酵食品的微生物多样性研究进展 1 2 1 传统发酵食品的特点 发酵食品是指在食品加工过程中有微生物或酶参与而形成的一类特殊食品。 世界传统发酵食品历史悠久，分布广泛，许多国家和地区都有当地特色的传统发 酵食品。如中国的酱油、腐乳和米醋，日本的纳豆，韩国的泡菜，意大利的色拉 米香肠，以及西方许多国家的面包、干酪和酸奶等。从发酵食品的制作过程可以 知道，由于原料经微生物的作用其质地得到改善，提高了营养价值以及贮存稳定 性，并使产品具有特殊的风味；所以，长期以来人们将食品原料发酵作为提高原 料贮存稳定性并提高经济价值的好方法。 传统发酵食品中的很大一部分都是由多种菌种混合发酵的，如同本的米酒、 豆酱、纳豆，欧洲的干酪以及中国的绝大部分传统发酵食品。混合发酵是在成分 复杂的发酵基质中，有多种微生物协同作用，完成多种生化反应。发酵产物种类 繁多，可进行多级转化，产物之间可以相互补充，相互化合，生产的产品丰富多 彩，风味醇厚柔和，宜于生产成分复杂，风味要求高的我国传统酒、醋、酱、鼓、 3 浙江工商人学硕士学位论文 酱油等。在发酵中有益微生物群体稳定占绝对优势，几乎不发生污染，发酵基质 甚至可以不用消毒。发酵容易掌握控制，对环境无特殊要求。如以谷物原料酿醋 为例：物料加曲后在常温下进行液态或固态发酵，霉菌分泌的水解液生成低聚糖 和可发酵性糖，把蛋白质、脂肪水解成肽类、氨基酸、脂肪酸和甘油。酵母菌把 可发酵性糖转化为酒精及c 0 2 ，同时伴生甘油、脂肪酸、琥珀酸和葡萄糖酸等。 糖化未彻底，低聚糖继续水解为可发酵性糖。随着酒精的生成，在以醋酸菌为主 的细菌作用下，醋酸及其它有机酸发酵开始进行。未被转化的葡萄糖继续转化为 酒精。细菌也能氧化淀粉、麦芽糖、葡萄糖生成有机酸。酸和醇结合酯化反应也 同步进行，发酵终了代谢产生的呈味生香物质多，成品醋酸而不涩、辛而不烈、 醇厚柔和可口。 我国传统发酵食品多属于调味品，但由于工业化程度不高，有的产品生产甚 至受季节限制，只有白酒等产品实现了工业化生产，其它产品如腐乳、豆豉、酱 油、食醋等，都基本都是作坊式生产或工业化程度很低。因此，生产工艺落后、 产品档次低是限制发酵食品行业发展的主要因素。由此可见，研究传统发酵食品 中的微生物体系，对于指导生产、提高产品质量和稳定性，以及整个传统食品行 业的长远发展是非常必要的，也是非常关键的。 1 2 2 传统发酵食品的微生物多样性概述 1 221 食醋的微生物多样性 我国食醋生产的传统工艺，大都为固态发酵法。食醋的发酵过程主要包括糖 化、酒精发酵和醋酸发酵这三个阶段，多种有益的真菌及细菌共同参与，并各自 在不同发酵阶段起主要作用，真菌主要有霉菌和酵母菌，细菌主要有乳酸菌和醋 酸菌。整个发酵阶段是发花阶段霉菌分泌的酶，以及酵母菌和醋酸菌相互作用的 结果。主要是醪中霉菌所分泌的淀粉酶、蛋白酶及肽酶等各种酶，将淀粉、蛋白 质分解成葡萄糖及氨基酸等，葡萄糖再经酵母发酵生成洒精及c 0 2 ，同时醋酸菌 分泌酒精氧化酶使酒精转化为醋酸，并产生各种醇类、有机类、脂类等呈味物质。 醋酸菌在整个发酵过程中起到了主要作用，对食醋的品质起到决定性的作用。发 酵成熟的食醋中的醋酸含量，普通醋为3 5 9 l o o m l 以上，优级醋为5 9 l o o m l 以上。 4 浙江工商大学硕士学位论文 我国传统食醋大都采用天然发酵，主要依靠来自环境中的细菌、霉菌及酵母 菌等有益菌共同参与发酵而成。我国有很多享誉国内外的传统名醋，发酵菌种的 差异决定了风味及品质上的不同。以山西老陈醋为例，醋醅样品经过分离、初筛、 复筛，对醋酸菌的种类进行研究【4 】，最后根据产酸量高低得到了5 株优势醋酸菌 ( a b 7 ，a f l 0 ，a f 5 ，a u l 3 ，a f 2 0 ) 。通过对这5 株优势菌株的个体形态、培养特征、 生理生化特性的研究，将其鉴定为醋酸杆菌属中的巴氏醋杆菌( a b 7 ) 、醋化醋杆 菌( a l l 0 ) 、液化醋杆菌( a f 5 ) 、汉氏醋杆菌( a u l 3 ) 和恶臭醋杆菌( a f 2 0 ) 。2 0 0 4 年又 应用传统微生物学的方法，对山西老陈醋大曲进行了微生态研究【5 j 。结果表明， 山西老陈醋大曲中心毛霉为主，有少量红曲霉，假丝酵母和汉逊酵母较多；大曲 边角以犁头霉和毛霉为主，假丝酵母、汉逊酵母、拟内孢霉、醋酸菌较多；大曲 表面毛霉、犁头霉为主，假丝酵母较多，醋酸菌在表面最多。研究还发现：大曲 由旱向外，微生物群体死亡率呈下降趋势，有害霉菌污染程度呈上升趋势，乳酸 菌、芽孢细菌呈下降趋势。 本实验室裘纪莹1 6 】等人曾利用传统的分离、纯化方法对浙江玫瑰米醋发酵过 程中的微生物区系进行了研究。经过筛选得到形态不同的霉菌4 3 株，其中2 株 属于根霉属，1 5 株属于曲霉属，2 株属于红曲霉属，8 株属于青霉属，2 株属于 镰刀霉属，3 株属于毛霉属，1 1 株未知：得到形态各异的酵母菌9 株，其中包含 布拉酵母菌、粘红酵母菌和马克斯克鲁维酵母菌等；得到细菌1 6 株，为醋酸菌 和耐酸性细菌。对其中6 株醋酸菌进行1 6 sr d n a 鉴定，为巴氏德醋杆菌。 2 0 0 6 年，h a m t a 等 7 1 对日本米醋中的微生物种类进行了研究。结果鉴定得到 真菌有酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 署f l 米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a e ) ，细菌有 乳酸菌和醋酸菌，其中乳酸菌4 种，分别为发酵乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sf e r m e n t a t i o n ) 、 乳酸球菌( l a c t o c o c c u sl a c t i s ) 、乳酸片球菌( p e d i o c o c c u sa c i d i l a c t i c i ) 及耐酸乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sa c e t o t o l e r a n s ) ；醋酸菌为巴斯德醋杆菌( a c e t o b a c t e r p a s t e r u r i a n u s ) ， 并分析了细菌及真菌群落结构的演变规律。 1 2 2 2 其它传统发酵食品的微生物多样性 我国传统发酵食品历史悠久，在现代食品行业中占有非常重要的地位。除了 食醋以外，酱油、酒( 黄酒和白酒) 、腐乳、泡菜等都是人们生活中不可或缺的食 5 浙江工商大学硕士学位论文 品。不同的原料、生产工艺和发酵微生物产生了截然不同的口感和风味。 中国是白酒生产大国，而白酒品质主要取决于所用曲的差异性。如中国的著 名大曲酒一茅台酒，其发酵所用的大曲由大麦、小麦等粮食原料保温培菌制得二 曲中的微生物由曲霉、红曲霉、根霉等霉菌，假丝酵母、汉逊酵母等酵母菌以及 乳酸菌、丁酸菌、耐高温芽抱杆菌等细菌；而西方多采用大麦芽作糖化剂，酵母 菌作发酵剂，如英国的麦芽威士忌，酿造是在麦芽中接人单一酿酒酵母或酿酒酵 母与过量的啤酒酵母混合物进行发酵。邓启宝等【8 j 为了弄清凤曲理化指标的变 化，特对其微生物酶系变化进行观察分析，研究了风曲微生物数量的消长变化 对风曲理化指标的影响，以便在风曲生产培养过程中，创造微生物生长最佳环境， 使风曲微生物数量的消长更加合理化、科学化，理化指标更趋规范化。蒋红军【9 】 通过微生物数量跟踪，分析了微生物变化与蛋白质分解的关系，并且比较系统地 阐述了制曲发酵过程中细菌、酵母菌、霉菌三大类菌群的演替、作用规律及各自 的特点。同时从酶角度阐述了细菌的演替、作用规律。 酱油是我国重要的调味品之一，其传统的生产工艺决定了复杂的微生物种 类。2 0 0 7 年谢小保等【1 0 】对高盐稀醪酱油发酵原油中微生物区系进行了研究。经 过b i o l o g 鉴定，细菌主要有下列各属：肠球菌属( e n t e r o c o c c u s ) ，葡萄球菌属 ( s t a p h y l o c o c c u s ) ，芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) ，微球菌属( m i c r o c o c c u s ) ，气球菌属 ( a e r o c o c c u s ) ，肠杆菌属( e n t e r o b a c t e r ) ，克雷伯氏菌属( 触b s i e l l a ) ，乳酸杆菌属 ( l a c t o b a c i l l u s ) ，泛菌属( p a n t o e a ) 等细菌。芽孢杆菌属主要有地衣芽孢杆菌 ( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 、枯草芽孢杆菌( b s u b t i l i s ) ；葡萄球菌属主要有腐生葡 萄球菌( s t a p h y l o c o c c u ss a p r o p h y t i c u s ) 、表皮葡萄球菌( s t a p h e p i d e r m i d i s ) 、木糖 葡萄球菌( s t a p h 5 ) ；肠杆菌属主要为阴沟肠杆菌( e n t e r o b a c t e r c l o a c a e ) ；肠球菌 属中主要有屎肠球菌( e n t e r o c o c c u sf a e c i u m ) 。酵母菌主要有：球拟酵母属 ( t o r u l o p s i s ) ，毕赤酵母属( p i c h 妇) ，丝孢酵母属( t r i c h o s p o r o n ) ，红酵母属 ( r h o d o t o r u l a ) ，假丝酵母属( c a n d i d a ) ，酵母属( s a c c h a r o m y c e s ) 。 1 2 3 分子生物学技术在微生物多样性研究中的应用 在d n a 分子技术出现之前，研究微生物多样性的传统方法是将微生物从环 境中分离、实验室培养和鉴定，人们对微生物的认识大多数是直接观察来获得部 6 浙江工商大学硕士学位论文 分信息。然而，微生物种类繁多，自然界中仅有极少数微生物得到鉴定，能够在 实验室培养的种类则更少，至多为1 。1 9 9 0 年，w a r d 等【u 1 利用对环境微生物的 1 6 s r r n a ) 芋列分析，揭示了环境中存在大量未能培养的微生物。此后，大量基于 1 6 s r r n a 的分子微生物学方法被发展应用于复杂的微生物生态研究，以获取更多 的微生物信息，推动了微生物生态学研究的进一步发。近年来，随着分子生物方 法的改进，直接从样品中提取总d n a 来检测微生物种类和数目的技术得到了较 大发展，这为微生物多样性的研究提供了一些有益的思路。现代分子生物学技术 在微生物多样性研究上的应用克服了微生物培养技术的限制，使得微生物学者可 以在基因水平上估计种的丰度、均度，查明种的变异情况等，从而可以更客观的 认识环境中微生物天然的生态状况【1 2 1 。目前，分子生态学技术在微生物多样性 方面的研究主要集中在以下几个方面： 1 2 3 1 微生物总d n a 制备及其遗传多样性的检测方法 近年来，从环境样品中提取和纯化微生物d n a 的方法不断得到发展，从而 可对环境样品d n a 进行p c r 扩增，推动了利用分子标记技术研究微生物多样性。 从环境样品中提取微生物总, d n a 有两种方法1 1 3 l ：( 1 ) 直接利用机械或化学方法破 碎样品中的微生物，释放样品中的总d n a ；( 2 ) 从样品中分离出微生物细胞，然 后再抽提d n a 。从总体上讲，前一种方法更能代表环境样品中微生物遗传多样 性的实际情况。目前用于遗传多样性检测的分子标记主要包括限制性片段长度多 态性( r f l p ) ，随机扩增多态性d n a ( r a p d ) ，d n a 扩增指纹分析( d n a ) 、扩增片段 长度多态眭( a f l p ) 、单链构象长度多态性( s s c p ) 和变性梯度凝胶电泳( d g g e ) 等 1 4 , 1 5 l 。其中应用较广的是分子标记r a p d 分子标记矛n d g g e 分析法。 1 2 3 21 6 sr r n a 基因序列的比较发现新的微生物 不同的微生物r r n a 基因序列在某些位点会以不同的几率发生变化，但是它 们又具有高度的保守性，形象地说，它可以作为生物进化的计时钟，它们的序列 相似程度可以反映出它们的系统发育关系( p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p ) 。1 9 8 6 年p a c e 等【1 6 j 首次利用r r n a 基因确定环境样品中的微生物，通过5 sr r n a 基因序列分析 来研究微生物生态和进化。但由于5 sr r n a 基因相对较小( 约1 2 0 个核甘酸) ，携带 7 浙江工商大学硕士学位论文 信息相对较少，因而揭示微生物群落多样性的能力有限。相比之下，随后开展的 1 6 sr r n a 基因序列( 丝h s o o 个核甘酸) 分析为微生物多样性研究提供了更多信息， 且效率更高。 目前，1 6 sr r n a 基因序列分析已广泛应用于微生物多样性的研究。1 6 sr r n a 基因序列分析主要基于已建立的微生物1 6 sr r n a 基因序列数据库，用以确定细 菌的系统发育关系，并使序列探针用于识别未知菌( u n c u l t u r e dm i c r o b e s ) 成为可能 1 7 1 9 】。利用1 6 sr r n a 基因序列研究微生物多样性可采用不同的策略。目前常用 的有以下几种【2 0 l ： 方法一：( 1 ) 从样品中分离总d n a ；( 2 ) p c r 扩增1 6 sr r n a 基因；( 3 ) 对p c r 扩 增产物进行变性梯度凝胶电泳( d g g e ) 或温度梯度凝胶电泳( t g g e ) 分析，直接观 察其多样性。 方法二：步骤( 1 ) 、( 2 ) 同方法一；( 3 ) 对扩增产物用限制性内切酶进行切割并电 泳，然后用标记探针杂交，从而进行r f l p 分析，用以揭示微生物的r f l p 多样性 ( p c r - r f l p ) 。 方法三：步骤1 同方法一；( 2 ) 建立d n a 文库；( 3 ) 用1 6 sr r n a 基因探针筛选 d n a 文库中的r d n a 克隆；( 4 ) 克隆的序列测定和比较，用以鉴定微生物序列的多 样性或利用己知的各物种的1 6 sr r n a 基因序列数据库鉴定未知菌的归属，从而 发现新种。 方法四：( 1 ) 从环境样品中分离微生物菌落；( 2 ) 对各菌落分离微生物总d n a ： ( 3 ) 以1 6 sr r n a 基因探针( 包括d o m a i n 、属或种等专一性探针) 进行杂交，常用于鉴 定未知菌或研究微生物的多样性。 无论采用何种方法，1 6 sr r n a 基因序列水平的多样性为微生物的系统发育 和未知菌的鉴定提供了全新的方法。 1 2 3 3 核酸分子杂交分析技术 核酸分子杂交技术是2 0 世纪7 0 年代发展起来的一种崭新的分子生物学技术。 它是基于d n a 分子碱基互补配对的原理。用特异性的c d n a 探针与待测样品的 d n a 或者r n a 形成杂交分子的过程。由于其高度特异性和灵敏性，近年来被广 泛应用与微生物多样性的研究中。 8 浙江工商大学硕士学位论文 用于微生物多样性研究的探针主要有双链d n a 、单链d n a 和r n a 以及寡核 昔酸探针等三类，可对有关微生物在特定环境中的存在与否、分布模式和丰度等 情况进行研究。包括【2 1 】：( 1 ) 对环境样品直接作原位杂交( i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ) ， 可获得未知的微生物多样性的大量信息，如微生物的形态特征和丰度以及在样品 上的空间分布和动态；( 2 ) 对微生物菌落作全细胞杂交( w h o l e c e l lh y b r i d i z a t i o n ) ， 可提供比用探针作s o u t h e r n 印迹杂交更直观的信息；( 3 ) 对环境中提取的d n a 作数 量印迹杂交( q u a n t i t a t i v ed o tb l o t ) ，可获得有关特定d n a 序列丰度的信息；( 4 ) 对 r d n a 的扩增产物或r r n a 的反转录产物作s o u t h e r n 杂交( s o u t h e r nh y b r i d i z a t i o n ) 。 1 2 3 4d n a 动力学的研究 样品中d n a 复杂性同样可用于微生物多样性的研究，尤其是对于土壤微生 物群落的研究。一般地，d n a 混合物的复杂性可用c o t1 2 值( 经热变性解链后， 5 0 的d n a 链复性为双链d n a j 行需的时间) 评估：c o t1 2 值越大，d n a 复性所需 时间就越长，相应的d n a 混合物就越复杂。因而提取环境样品中的总d n a ，测量 其c o t1 2 值，并与简单d n a ( 如质粒或单基因组) c o t1 2 值相比，可知该d n a 卞样品 的复杂程度。n a k a t s u 等1 2 2 】研究了土壤样品，通过提取样品的总d n a ，然后在高 压下将其剪切成平均为4 2 0 k b 的d n a 片段，测定热变性复性过程，得到c o t1 2 值， 结果显示该土样的基因多样性是一般分离法所得的基因多样性的2 0 0 多倍。1 9 9 7 年，r i t zk 等【2 3 l 也对土壤微生物及浮游细菌群落作了d n a 复性动力学研究，比较 了群落之间基因多样性的差异。 1 3 变性梯度凝胶电泳( d g g e ) 技术 1 3 1p c r d g g e 技术基本原理 变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r e dg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) 技术是由 f i s c h e r 矛n l e r m a n 于1 9 7 9 年最先提出的，用于检i ! f 1 0 d n a 突变的一种电泳技术。它 的分辨精度比琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳更高，可以检测到一个核苷酸水 平的差异。1 9 8 5 年，m u z y e r s 等人首次在d g g e 中使用“g c 夹板 和异源双链技 术，使该技术日臻完善【2 4 】。1 9 9 3 年，m u z y e r s 等首次将d g g e 技术应用于微生物 9 浙江t 商大学硕士学位论文 群落结构研究，并证实了这种技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和菌群 差异方面具有独特的优越性f 2 5 1 。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳 ( t e m p e r a t u r eg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，t g g e ) 。此后，该技术被广泛用于微 生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要 分子生物学方法之一。 1 0 t ) 0 5 0 1 0 dl 2 0 0 s - m n ，嘲 图1 1d n a 片段解链区域示意图 f i g 1 - 1m e l t i n gd o m a i no fd n af r a g m e n t 其原理是：双链d n a 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决 定于其分子大小和电荷。不同长度的d n a 片段能够被区分开，但同样长度的 d n a 片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。d g g e f f g g e 技术在一般 的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂( 尿素和甲酰胺) 梯度或是温度梯度，从 而能够把同样长度但序列不同的d n a 片段区分开来。一个特定的d n a 片段有 其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域( m e l t i n gd o m a i n ，m d ) 矛t l 解链行 为( m e l t i n gb e h a v i o r ) t 2 6 】。一个几百个碱基对的d n a 片段一般有几个解链区域， 每个解链区域有一段连续的碱基对组成( 图1 1 ) 。当温度逐渐升高( 或是变性剂浓 度逐渐增加) 达到其最低的解链区域温度时，该区域这一段连续的碱基对发生解 链。当温度再升高依次达到各其他解链区域温度时，这些区域也依次发生解链。 直到温度达到最高的解链区域温度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链 d n a 完全解链。因此，即使是大小相同，但碱基排列有差异的d n a 片段，在不 同浓度梯度的变性剂( 脲素和甲酰胺) 凝胶中电泳，根据部分解离的条件不同，其 1 0 浙江工商人学硕十学位论文 移动速度不同而得到分离。通过染色后可以在凝胶上呈现为分