基因工程的基本操作程序.ppt

复习,1.基因工程中基本工具有哪些？2.基本工具的作用和特点分别是什么？3.限制酶、DNA连接酶分别作用于DNA的什么部位？4.基因工程的基本步骤是什么？5.获得目的基因的方式有哪些？,目的基因,1质粒是基因工程最常用的运载体，它的主要特点是：()能自主复制不能自主复制结构很小蛋白质环状RNA环状DNA能“友好”地“借居”ABCD,C,2下列不是基因载体必须具备的条件的是()A、能自我复制B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNA,D,真核生物的基因结构,前体信使RNA,成熟的信使RNA,第二节基因工程的基本操作程序,（一）获得目的基因（二）构建基因表达载体形成重组DNA分子（三）将目的基因导入受体细胞（四）目的基因的检测与鉴定,基因工程的基本操作程序,用DNA合成仪人工合成,利用PCR技术扩增,已知序列：,从基因文库获得,未知序列：,（一）目的基因的获取：目的基因即我们所需要的基因。,基因组文库：含某种生物的全部基因部分基因文库：含某种生物的部分基因（如cDNA文库）,cDNA文库基因组文库,从基因文库中获取目的基因,鸟枪法：散弹射击法,构建基因组文库并获得目的基因：,基因组DNA文库的构建将总DNA经过酶解，分离不同长短的DNA片段。包含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库。,逆转录法,构建cDNA文库并获得目的基因,根据已知氨基酸序列直接合成DNA,化学合成人工合成,核苷酸序列已知，把将要合成的DNA序列输入到DNA合成仪，用化学方法直接人工合成,聚合酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction),KaryB.Mullis,PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。,PCR的反应体系模板：DNA原料：四种脱氧核苷酸；酶：Taq酶（TaqDNA聚合酶）嗜热细菌中分离得到引物：DNA片段Mg2+（维持酶活性所必需）PCR缓冲液：维持PH恒定，保护Taq酶,PCR反应过程可分为三步：变性、退火、延伸,1变性双链模板DNA解离为单链结构。（9095）,DNA双链,DNA单链,变性,2退火引物与模板互补成双链。（5560）(由于引物浓度高，序列短，所以易与模板结合。),PCR反应过程可分为三步：变性、退火、延伸,引物,PCR反应过程可分为三步：变性、退火、延伸,3延伸在Taq酶作用下，合成特异DNA序列。7075,延伸,变性,第二次循环,退火,第二次循环,延伸,第二次循环,PCR反应曲线,理论上，PCR反应产物呈指数增长，但这种增长形式在扩增25-30个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台。此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。,PCR仪程序设定,PCR的应用,PCR具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR技术在分子生物学、医学和案件侦破等领域得到广泛应用。,实例1：,1、下列获取目的基因的方法中需要模板链是（）A.从基因文库中获取目的基因B.利用PCR技术扩增目的基因C.反转录法D.通过DNA合成仪利用化学方法人工合成,（二）基因表达载体的构建形成重组DNA分子,切割目的基因和质粒的限制酶是同一种限制酶吗？,同一种,目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，使目的基因表达和发挥作用。,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。,常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌、动植物细胞等,将目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,主要借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,导入方式：,（三）将重组DNA分子导入受体细胞,导入微生物细胞,将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1)获得目的基因和质粒载体；2)形成重组质粒；3)制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4)培养大肠杆菌，让重组质粒形成大量拷贝；5)筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞。,导入植物细胞：土壤农杆菌转化法,土壤农杆菌：具有趋化性（酚），感染双子叶植物和裸子植物,基因枪法：单子叶植物常用的一种基因转化方法，但成本较高。,花粉管通道法：十分简便经济的方法。我国的转基因抗虫棉就是用此方法获得。,将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序：,重组DNA提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵发育新性状动物,转基因动物,1.筛选含有目的基因的受体细胞,通过检测标记基因的有无，来判断目的基因是否导入受体细胞。,（1）抗药性筛选法：,菌株为某种抗生素缺陷型，而质粒上带有该抗性基因（如抗氨苄青霉素，抗卡拉霉素等）。如何筛选出含有目的基因的受体细胞？,（这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。）,（四）目的基因的检测与鉴定,pBR322质粒结构,标记基因,进行筛选,限制性内切酶,识别序列,外源基因连接,（2）DNA分子杂交检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,首先取出转基因生物的基因组DNA用含目的基因的DNA片段（单链）用放射性同位素等作标记,以此做探针使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中,过程:,利用DNA分子杂交筛选含有目的基因的细菌克隆,检测方法：,DNA分子杂交技术,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,2.检测目的基因的表达,检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质,目的基因成功表达的标志体现特定性状,检测性状,（3）鉴定（个体生物学水平）：,（1）检测目的基因是否转录出了mRNA,（2）检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法:,分子杂交,方法:,抗原抗体杂交,过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA,回答问题：,1、基因工程的别名：,2、操作环境：,3、操作对象：,4、操作水平：,5、基本过程：,6、结果：,基