（水生生物学专业论文）莱茵衣藻海藻糖水解酶基因treh在ecoli中表达及功能鉴定.pdf

莱菌在藻中海藻糖水解酶的雉嘣t r e h 冉e c o l i 中表达及功能签定 摘要 海藻糖被认为是生物体抵御胁迫环境的应激代谢产物，对细胞膜、蛋白质和核酸 等生物大分子有卓越的保护作用，能明显提高生物的抗逆能力。海藻糖的保护机理和 生物代谢途径一直是研究的热点。我们最近首次在衣藻中检测到了海藻糖的存在。本 实验从衣藻中克隆到海藻糖水解酶同源基因( t r e h a l a s eg e n e ，以下简称t r e h ) 的e d n a 序列，并将该基因在大肠杆菌中诱导表达，对其重组蛋白产物的酶活鉴定证实其具有 海藻糖水解酶活性。本研究的结果填补了衣藻在海藻糖研究方面的空白。 本论文的主要内容及结果如下： 1 提取衣藻r n a 反转录成e d n a ，利用p c r 技术克隆得到衣藻的t r e h ，通过限制 性内切酶位点屁冰i 和b a n f fi 将其连接到克隆载体p u t l 9 上，得到载体p u c t r e h ， 测序得到t r e h 的c d n h 序列。 2 生物信息学分析表明衣藻t r e h 与水稻、拟南芥、大豆的海藻糖水解酶具有较 高的同源性。 3 利用上述双酶切位点构建了大肠杆菌表达载体p e t 3 2 a - t r e h 4 用口叮g 在大肠杆菌中成功诱导表达衣藻t r e h ，该基因的重组蛋白在大肠杆菌 中主要以包涵体的形式存在。 5 收集目的蛋白包涵体，经过变性和复性处理得到有功能的t t e h 蛋白。但样品 中存在杂蛋白干扰。 6 进步利用表达载体p e t 3 2 a 上带有的h i s t a g 标签对复性的目的蛋白用镍柱 进行二次纯化，去除杂蛋白。再对得到的纯t r e h 蛋白进行透析，酶活鉴定表明其具 有海藻糖水解酶活性，比活力达到8 0 4 u r a gp r o t e i n 。 7 实验证明咪唑会导致t r e h 的酶活性完全被抑制，必须通过透析去除后才能使 蛋白恢复活性。而o 0 5 r a me d t a 和l m m 的m g ：+ 对其活性无影响。 综上所述，本实验成功从衣藻中克隆到预测的海藻糖水解酶基因t r e h ，其在大肠 杆菌中表达的产物被证实具有海藻糖水解酶活性。 关键词；衣藻；海藻糖：海藻糖水解酶：重组蛋白：包涵体；咪唑 上海师范大学硕士毕业论文摘要 a b s t r a c t t r e h a l o s ei sa l li n d u c i b l ec o m p o n e n ti nt h eo r g a n i s m s i tp l a y sg r e a tr o l ei l lp r o t e c t i o n a n ds t a b i l i z a t i o no fb i o l o g i c a ls t r u c t u r e ss u c ha sc e l lm e m b r a n e ，p r o t e i na n dn u c l e i ca c i d u n d e rv a r i e ss t r e s sc o n d i t i o na n ds i g n i f i c a n t l ye r l h a n c eo r g a n i s m sr e s i s t a n c e ，t h es t u d yo f t r e h a l o s ea n di t sb i o l o g i c a lm e t a b o l i s ma l w a y sa l t r a c t sm a n yi n t e r e s t s r e c e n t l yt r e h a l o s e h a sb e e nd e t e c t e di nc h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i if u rt h ef a s tt i m e i nt h i sp a p e r , w ec l o n e d ap u t a t i v et r e h a l a s eg e n e ( t r e h le d n af r a g m e n tf r o mcr e i n h a r d t i ia n de x p r e s st h i s p u t a t i v eg e n ei nec o l l w ep r o v e dt h a tt h ep u r i f i e dr e c o m b i n a n tp r o t e i nd ob e h a v e sa s t r e h a l o s eh y d r o l y s i sf u n c t i o ni nv i t r o t h i sr e s u l t f i l l e du pt h eb l a n ko ft r e h a l o s e m e t a b o l i s ms t u d yi ner e i n h a r d t i l t h em a i nc o n t e n t sa n dr e s u l t so f t h i se x p e r i m e n ta r ea sf o l l o w s ： 1 e x t r a c t e dt o t a lr n af r o mcr e i n h a r d t i ia n dr e v e r s et r a n s c r i p t e di ti n t oe d n a u s e d s p e c i f i cp r i m e r st oa m p l i f yt h ep u t a t i v et r e hg e n ef r o mt h ee d n aw i t hp c r m e t h o d c l o n e dt h et r e hi n t ov e c t o rp u c l 9w i t hr e s t r i c t i o ne n z y m ec u t t i n gs i t e so fe c o ria n d b a m hit oe o n s t l x t c tt h ev e c t o rp u c t r e hf o rs e q u e n c i n g9 f t h i sg e n e 2 b i o i n f o r m a t i ca n a l y s i ss h o w e dt h a tt r e ho fcr e i n h a r d t i ii sh i 曲t yh o m o l o g o u st ot h a t o fo r y z as a t i v a , a r a b i d o p s i st h a l i a n aa n dg l y c i n em a x 3 c o n s t r u c t e da ne x p r e s s i n gv e c t o rp e t 3 2 a - t r e hf u re x p r e s s i o ni nec o l i 4 u s e di p t gt os u c e s s f u l l yi n d u c et r e ht oe x p r e s si nec o l i t h er e c o m b i n a n tt r e hp r o t e i n e x i s t sa si n c l u s i o nb o d i e si i lec o l i 5 a n 盱d e n a t u r e da n dr e f o l d e dt h ei n c l u s i o nb o d i e s ，t h er e f o l d e dp r o t e i ns h o w e dl o w a c t i v i t y o f t r e h a l o s e h y d r o l y s i s m a y b e d u e t o t h e e x i s t o f o t h e r p r o t e i n s i n i n c l u s i o n b o d i e s 6 f u r t h e rp u r i f i e dt h er e f o l d e dp r o t e i nt h r o u g hn i + c o l u m na c c o r d i n gt ot h ei l i s t a g s t r u c t u r ei nv e c t o rp e t 3 2 a a f t e rs e c o n d a r yr o u n do fd i a l y s i s ，t h ep u r ep r o t e i ns h o w e d s i g n i f i c a n tt r e h a l o s eh y d r o l y s i sa c t i v i t y , 8 0 4 u m g 7 i nt h i se x p e r i m e n t ，i m i d a z o l ei nt h eb i n d i n g w a s h i n ga n de l u t i o nb u f f e ro fn i + c o l u m n s y s t e mc o u l dt o t a l l yi n h i b i tt r e ha c t i v i t y w l l i l e0 0 5 m me d t aa n dl r n mm 矿+ d i dn o t e f f e c te n z y m ea c t i v i t y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep u t a t i v et r e hc l o n e df r o mcr e i n h a r d t i id ob e h a v e 嬲 i 莱茵农藻中海藻糖水解酶的基因t m h 在e c o l i 中表达及功能签定 t r e h a l o s eh y d r o l y s i sa c t i v i t yi nv i t r o k e yw o r d s ：c h l a m y d o m o n a sr e i n g a r d t i i t r e h m o m ：t r e h a l a s e ：r e c o m b i n a n tp r o t e i n ； i n c l u s i o nb o d y ：i m i d a z o l e 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构 已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡 献均已在论文中做了明确的声明并表示了谢意。 作者签名：日期 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以 公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论 文。保密的论文在解密后遵守此规定。 作者签名：导师签名： 日期： 莱茵友藻中海藻糖水解酶的草因t m h 在e c o l i 中表达及功能鉴定 1 引言 海藻糖是在1 8 3 2 年n h w i g g e r s 首先从黑麦的麦角菌中提取出的。二十多年后， b e r t h e l o t 在一种叫l a i n u s 的甲虫茧中发现了同样的物质，由于这些茧的英文是 臼e h a l a ( 茧蜜) ，于是b e r t h e l o t 就将这种糖命名为海藻糖( t r e h a l o s e ) ( s i n g e re ta 1 ， 1 9 9 8 ) 。后来发现它广泛存在于藻类、细菌、真菌、昆虫以及无脊推动物等生物体内， 近年来还发现人体的肾脏也存在海藻糖( e l b e i ne ta ，2 0 0 3 ：张厚亮，2 0 0 3 ) 。含有 海藻糖的许多生物具有在脱水条件下仍能存活多年的特性，例如活性干酵母具有很长 的货架寿命( m o z h a e ve ta 1 ，1 9 8 8 ) ；链霉菌孢子和大肠杆菌具有很强的抵抗干旱和 渗透胁迫能力( c r o w e ，1 9 8 4 ) ；还有一种被称为“复苏植物”的沙漠植物( s e l a g i n e l l a l e p i d o p h y l l a ) ，当失水9 9 后仍能在复水后复活( a d a m se l a l ，1 9 9 0 ) 。研究表明， 在高温、高渗透压、重金属及有毒试剂等不利条件下，这些抗逆性强的生物体会合成 并积累海藻糖( b e l le t a l ，1 9 9 2 ) 。海藻糖还被证实是酶、蛋白质、核酸、生物膜质 等生物大分子甚至移植器官的有效的保护剂( m a d i n & c r o w e ，1 9 7 5 ) 。因此，海藻糖 被认为是生物体抵御胁迫环境的应激代谢产物，被誉为“生命之糖”( s c h i r a l d ie l a l ， 2 0 0 2 ) 。自海藻糖被发现以来，已经对其物理、化学性质、生理功能、作用机理和代 谢途径及其在医药、食品中的应用进行了较为深人的研究。近年来，对其在分子水平 的研究也逐渐兴起，许多相关基因已相继被克隆和分析( 谢传晓等，2 0 0 3 ) 。 本文是就衣藻( c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i i ) 中可能的海藻糖水解酶基因( t r e h a l a s e g e n e ，以下简称t r e h ) 进行了克隆并将其在大肠杆菌 ec o l i ) 中进行诱导表达并对 重组蛋白进行了功能鉴定，确认了在该基因的海藻糖水解酶功能。 1 1 海藻糖的分子结构和理化性质 海藻糖( 洳d g l u c o p y r a n o s y l 1 8 即为较纯的r n a 。 2 2 2 2 衣藻总r n a 反转录成c 0 n a 将制备好的衣藻总r n a 溶液按以下比例配成2 0 u l 的反转录反应体系 模板r n a 溶液 l u g 5xr e v e r s et r a n s e r i p t a s eb u f f e r4 u l d n t pm i x t u r e ( 1 0 r a m )2 l l l r n a s ei n h i b i t o r2 0 u o l i g o ( d t ) l sp r i m e r5 0 p m o l a m vr e v e r s e t r a n s c r i p t a s e 1 0 u 1 7 上海师范大学硕士学位论文 材料与方法 总体积用d e p c 水定容至2 0 u l ，混匀后于4 2 c 水浴中保温l 小时，冰水中冷却2 分钟后即可进行p c r 反应。 2 2 2 3 以衣藻e d n a 为模板扩增t r e h 基因 选用前引物( p 1 ) ，5 - c g g a t c c a t g a c a c g t c g t c c t c c t c - 3 ，及后引物( p 2 ) ， 5 c g a a t t c t c a g t g c a c g c c a c a g c t g - 3 反应体系： 组分体积终浓度 1 0 p 纷b u f f e r ( m 9 2 + f r e e )5 此 lu d n t p m i x t u r e ( 各2 5r a m ) 4 此0 2 m m m g c l 2 ( 2 5ram)4“l 2 0m m p r i m a l ( 1 0u m ) 1 5p l 0 2 1 0 “m p r i m e r 2 ( 1 0p 旧l 5 肛l o 2 1 0p m t e m p l a t e l l l 7 ) ，室温放 置l m i n ；1 2 0 0 0r r a i n 离心1m i n ，离心管中液体即为回收的d n a 片段，可立即使用 或2 0 备用。 藁茵农藻中海藻糖水解酶的堆恻t r e h 舀：e c o l i 中表达及功能搭定 2 2 3 4d n a 序列的测定 将所提取纯化的质粒d n a 交由上海联合基因公司测序。 2 2 4d n a 序列的生物信息学分析 2 2 4 1将克隆所得的衣藻t r e h 基因序列在衣藻网上进行序列性质对比 网址为h t t p ：w w w c h l a m y o r g c h l a m y d b h t m l ，进行在线数据分析。 2 2 4 2 蛋白质一级结构预测 在h t t p ：g e n e s m i t e d u g e n s c a n h t m l ，将测序的d n a 序列的结果输入对应的上 传格中，此网站可以自动进行一级结构的预测。并对预测的氨基酸序列进行脯氨酸和 半胱氨酸的含量进行分析，半胱氨酸可能形成二硫键，而脯氨酸的含量越高，所形成 的蛋白需要折叠的可能性就越高，以此可以初步得知此基因所表达的蛋白的一些基本 性质。 2 2 4 3 蛋白质二级结构预测 蛋白质的二级结构预测都是基于多重序列对齐分析和神经网络算法的基础上，在 美国哥伦比亚大学的p r e d i c t p r o t e i n 服务器( p h d ) 做二级结构预测分析，网址： ( h t t p ：w w w e m b l h e i d e l b e r g d e p r e d i c t p r o t e i r d ) 。 2 2 5 目的基因在c o l i 中的诱导表达及功能鉴定 2 2 5 1 i p t g 诱导目的基因的表达 挑取转化了正确表达质粒的ec o l i 单克隆，在含有相应抗生素的l b 液体培养基 中培养过夜。当o d 6 0 0 达到0 7 左右时即可以1 的接种量接入新鲜的含有相应抗生素 的新鲜培养基中进行二活。当o d 6 0 0 达到o 4 时即可加入终浓度为l m m o l l 的i p t g 进行诱导，3 7 c 下2 5 0 r p m 振荡培养，分别在o h ，2 h ，4 h ，6 h ，8 h ，1 0 h 取出诱导的ec o l i 培养物在40 c 下保存，待下一步处理。 2 2 5 2 a o l i 可溶性蛋白与不可溶蛋白的提取、分离 将上述收集的e c o l i 培养物在4 c 下4 0 0 0 r p m 离心5 分钟，收集菌体。用 r e f o l d i n gk i t ( n o v a g e n ) 中的1 w a s hb u f f e r 清洗细胞两次，每次在4 下 1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，弃上清；用原培养物1 1 0 体积的1 w a s hb u f f e r 重悬菌 体，加入1 0 0 p g m l 的溶菌酶在3 0 c v 酶解1 5 分钟后迅速置于冰上。以1 0 秒超 声、1 0 秒间隔的频率在冰上超声5 个循环后在4 c 下1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，上 2 l 上海师范大学硕十学位论文 材料与方法 清液为可溶性的蛋白，沉淀为不可溶性的蛋白，分别准备进行s d s p a g e 检测。 2 2 5 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳s d s - p a g e 胶的制备 根据产家说明书安装玻璃板和电泳仪。 确定所需凝胶溶液的体积，配制s d s - p a g e 胶。配方如下： 将配制好的1 2 的分离胶加入玻璃板间，留出灌制积层胶所需的空间( 梳子的齿 长再加l c m ) ，并在胶的上方加入去离子水h 2 0 ；待分离胶凝固后3 0 m i n 。吸出上层的 水，加入配制好的5 的浓缩胶，并将样品梳插入浓缩胶中，浓缩胶凝固后3 0 r a i n ，拔 出梳子，用蒸馏水把加样孔充分冲洗干净，然后加满电泳液。 进行s d s p a g e 电泳：每孔加入约2 0 i _ t l 蛋白样品，接通电泳仪的电源开始电泳。 刚开始电泳时在浓缩胶中的电压为8 0 v ，溴酚蓝进入分离胶中时电压调到1 2 0 v ，溴酚蓝 电泳到离胶底2 m m 处即停止电泳。从电泳胶装置上御下玻璃板，放在纸巾上，用刮勺 拗开玻璃板。紧靠最左边的第一孔胶下部切去一角以标注凝胶的方位；至此，凝胶被固 定，并用考马斯亮蓝染色。 2 2 5 4 包涵体的溶解 根据r e f o l d i n gk i t ( n o v a g e n ) 提供的试剂配制1 0 2 0 m g m l 的s o l u b l i z a f i o nb u f f e r ( 5 0 m ls o l u b l i z a t i o nb u f f e r 中含有：5 m l1 0 x i bs o l u b i l i z a t i o nb u f f e r + 4 9 5 m l d d h 2 0 + o 5 m ln 1 a u r o y l s a r c o s i n + 5 0 u ld t t ) 。上述离心后的蛋白沉淀测定重量后，加入适量 s o l u b l i z a t i o nb u f f e r 后用枪头将沉淀充分溶解，室温放置1 5 分钟。室温下1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，上清即可准备透析。 2 2 5 5 变性蛋白的透析 透析袋的预处理 莱茵衣藻中海藻糖水解酶的基因t r e h 在e c o l i 中表达及功能鉴定 所有操作必须带无粉尘的乳胶手套操作。将透析袋剪成1 0 c m 的大小，放入含有 2 的n a h c 0 3 和i m me d t a ( p h 8 0 ) 的溶液中沸煮1 0 分钟。冷却片刻后用双蒸水漂洗 干净。再放入含有l m me d t a ( p h 8 o ) 的溶液中沸煮l o 分钟，冷却后放入4 c 冰箱保 存。再使用前必须用预冷的双蒸水漂洗干净后才能加入蛋白样品。 透析的抄作步骤 按上述变性蛋白的体积：透析液体积= l ：5 0 的比例配制所需体积的1x d i a l y s i s b u f f e r ( 直接从r e f o l d i n g k i t ( n o v a g e n ) q 1 的5 0 d i a l y s i s b u f f e r 稀释成所需的量) 。 将变性的蛋白加入到处理好的透析袋中，放入5 0 倍体积的含有o 1 m md d t 的 d i a l y s i sb u f f e r 中，4 c 下透析至少3 个小时后将d i a l y s i sb u f f e r 倾倒干净。加入新鲜的 不含d t t 的5 0 倍体积的d i a l y s i sb u f f e r 再次在4 c 下透析至少3 个小时用以除去残留 的d t t 。 换新鲜的5 0 倍体积的d i a l y s i sb u f f e r ，同时加入可以促进二级结构形成的氧化还 原对( 本实验用l m mr e d u c e d g l u t a t h i o n e 和o 2 r a m o x i d i z e d g l u t a t h i o n e ) ，在4 c 下透 析过夜。透析完成后，透析袋中即为复性好的蛋白，可以直接用于b r a d f o r d 蛋白定量 及酶活的测定。 2 2 5 6 过镍柱浓缩纯化复性的目的蛋白 镍柱蛋白纯化试剂配制： 母液： 1 0 xs t o c ks o l u t i o n a1 0 0 m l n a h 2 p 0 42 7 6 9 ( 2 0 m m ) n a c l 2 9 2 9 9 ( 5 m ) 定溶至1 0 0 m l d d h 2 0 , p h 无需求，室温保存 1 0 xs t o c ks o l u t i o nb1 0 0 m l n a 2 h p 0 42 8 4 9 ( 2 0 r a m ) n a c l 2 9 2 9 9 ( 5 m ) 定溶至1 0 0 m l d d h 2 0 ，p h 无需求，室温保存 上海师范大学硕士学位论文 材料与方法 5 xn a t i v ep u r i f i c a t i o nb u f f e r 18 0 m l n a i - 1 2 p 0 4 n a c l 7 9( 2 5 0 m m ) 2 9 2 9 ( 2 5 m ) 定溶至1 8 0 m l d d h 2 0 ，p h = 8 0 ( n a o h 调) ，室温保存 i m i d a z o l e ( 3 m ) 1 0 0 m l i m i d a z o l e 2 0 6 9 ( 3 m ) 1 0 s t o c ks o l u t i o na 8 7 7 m l 1 0 xs t o c ks o l u t i o nb1 2 3 m l 定溶至1 0 0 m l d d h 2 0 ，p h = 6 0 ( h c i 调) ，室温保存 工作液： ( 1 ) n a t i v ep u r i f i c a t i o nb u f f e r1 8 0 m l d d h 2 0 8 0 m l 5 xn a t i v ep u r i f i c a t i o nb u f f e r2 0 m l p h = 8 0 室温保存 n a t i v eb i n d i n gb u f f e r w i t h o u ti m i d a z o l e ：l n a t i v ep u r i f i c a t i o nb u f f e r w i t l li m i d a z o l e ：1 n a t i v ep u r i f i c a t i o nb u f f e r i m i d a z o l e ( 3 m ，p h o ) n a t i v e t 峪hb u f i e 1 n a t i v ep u r i f i c a t i o nb u f f e r l m i d a z o l e ( 3 mp h = 6 n a t i v ee 1 u t i o nb u f f e 1 n a t i v ep u r i f i c a t i o nb u f f e r i m i d a z o l e ( 3 mp h = 6 0 1 2 4 3 0 m l 3 0 m l ，p h = 8 0 1 0 0 1 j 1 5 0 m l 5 0 m l 3 3 5 9 l ，调p h = 8 0 1 3 7 5 m l 1 2 5 m l ，调p h 5 8 0 莱茵农蒹中海藻糖水解酶的基因t r e h 在e c o l i 中表达及功能罄定 镍柱纯化步骤 ( 1 ) 准备n i + - n t ac o l u n m ： 清洗n i + - n t ac o l u m n 并干燥后，用c a p 堵住下端，用枪吸取1 5 m lr e s i n 至镍柱 中，于4 c 下静止5 - 1 0 m i n 使自然沉降，用枪吸去上清。加入2 m ld d h 2 0 ，拨几下， 重悬，于4 1 2 下静止5 - 1 0 m i n 使自然沉降，吸去上清，重复用d d i - i ：o 清洗1 次。加入 2 m ln a t i v eb i n d i n gb u f f e r ，拨几下，重悬，于4 下静止5 - 1 0 r a i n 使自然沉降，吸去 上清( 重复1 次) 。 ( 2 ) 过柱纯化 在准备好的镍柱中加入5 - - 6 m l 处理好的样品( 透析后的蛋白) 。充分混匀3 0 - - - 6 0 m i n ， 保持悬浮状态，使柱中的凝胶一直处于悬浮状态。静置沉降，吸净上清( 上清4 c 保存， 留做s d s p a g e 分析) ，在柱中加入3 - - 4 m ln a t i v ew a s hb u f f e r ，静置沉降以洗去杂蛋 白，吸净上清( 上清4 c 保存，留做s d s p a g e 分析) 。再用n a t i v e w a s h b u f f e r 反复 洗2 3 次或更多( 视s d s - p a g e 的结果可做相应调整) 。最后加入l m ln a t i v ee l u t i o n b u f f e r ，重悬2 - 3 m i n ，打开c a p 将与镍结合的蛋白从镍柱上洗脱下来，放入另一新 试管中于4 。c 保存。洗脱下来的即为所需的带有h i s t a g 的重组蛋白。 ( 3 ) 镍柱再生 将c a p 重新装回到镍柱下端后加入5 m l5 0 r a m 的e d t a 将凝胶上的镍离子洗脱下 来，两次重复。再加入5 m l0 5 m 的n a o h 平衡，两次重复。用5 m l 的枷2 0 清洗凝 胶，两次重复。加入5 m l5 m g m l 的n i c l 2 溶液，让凝胶与薪鲜的镍离子结合。再用5 m l 的d d h 2 0 清洗再生的凝胶，两次重复。最后加入2 0 的乙醇溶液后即可室温保存待下 一次使用。 2 2 6 诱导表达的蛋白酶活性的测定 2 2 6 1 酶活的测定原理 根据海藻糖水解酶的活性特点，它以海藻糖为底物将一分子的海藻糖分解为两分 子的葡萄糖，所以检测海藻糖水解酶的活性可以通过检测反应体系中释放出的葡萄糖 的量即可。葡萄糖的量可以用葡萄糖氧化法测定。 2 。2 6 ，2 葡萄糖氧化法试剂的配制 配制1 d n s a ( 3 ，5 - 水杨酸) 溶液：将5 9 d n s a 溶解于1 0 0 m l2 m 的n a o h 中。 同时将1 5 0 9 酒石酸钠钾溶解于2 5 0 m l 水中。将配好的酒石酸钠钾溶液缓慢地倒入配 2 5 上海师范大学硕士学位论文材料与方法 制好的d n s a 中并持续搅拌。将溶液定容至5 0 0 m l 。 2 2 6 3 葡萄糖溶液标准曲线的测定 用2 5 r a mm e s 溶液( p h7 1 ) 配制l m m 、1 5 m m 、2 5 m m 和6 r a m 的梯度浓度的 葡萄糖标准溶液，用双蒸水补齐至l r a l 后分别加入l m l 的i d n s a 溶液，1 0 0 沸煮 5 分钟，再分别用双蒸水将溶液补足至5 m l ，冷却到室温后测定o d 5 2 0 的值。绘制葡萄 糖浓度与o d 5 2 0 值之间得标准曲线，由此得到一个线性方程( 图2 1 ) ，用于计算样品 中葡萄糖的含量。 一0 0 5 5 6 9 9 9 0l 一一一一1 一一 一 0 。 2468 葡萄精浓度( ) 图2 一l 葡萄稽的标准曲线 f i 9 2 1s t a n d a r dc u 鹏o f r e l a t i o n s h i pb e t w e e ag l u c o s ec o n c e n t r a t i o na n d5 2 0 n ma b s o r p t i o nv a l u e 2 2 6 4 海藻糖水解酶反应时间与酶活的关系 用o 4 u 的海藻糖水解酶标准品( s i g m a ) 与5 0 u l2 0 0 r a m 的海藻糖标准品( s i g m a ) ( 用2 5 m m 的i v i e s 溶液配置，p h 7 1 ) 分别于3 7 反应3 0 、6 0 、9 0 和1 2 0 分钟后测定 酶解反应，立即沸煮5 分钟终止反应，1 2 0 0 0 r p m 室温下离心1 0 分钟，将上清移入一 个干净且干燥的玻璃试管检测所产生的葡萄糖的量，以此得到海藻糖水解酶水解反应 的最佳时间。如图2 2 ，从曲线可以看出反应9 0 分钟内产生的葡萄糖量与反应时间成 线性关系，所以初步确定将海藻糖水解酶的酶解反应定为6 0 分钟。 f i 9 2 - 2r e l a t i o n s h i pb e 铆ng l u c o s ec o n c e n t r a t i o na n dt r e h a l a s ed i g e s t i o nt i m e 2 6 i l 5 一 。口。 莱茵农彝中海藻糖水解酶的楚因t r e h 在e , c o l i 中表达及功能鉴定 2 2 6 5 酶活测定方法 在测定纯化后的蛋白的水解活性时，取4 0 0 k t g 蛋白样品加入5 0 i t l 的海藻糖标准 液( 2 5 m mv i e s 溶液配制( p h7 1 ) ) ，在3 7 c 下反应6 0 分钟，立即沸煮5 分钟，1 2 0 0 0 r p m 室温下离心1 0 分钟，将上清移入一个干净且干燥的玻璃试管中用双蒸水补足至l m l ， 按2 2 6 3 的方法检测并计算生成的葡萄糖的量，再根据所用的蛋白量即可计算出酶的 比活力。 2 2 6 6 酶活单位的定义 一分钟内将1 t t m o 海藻糖水解生成2 9 m o l 的葡萄糖的酶量定义为一个酶活单位 ( 1 u ) 。而酶的比活力单位定义为每毫克蛋白的酶活( u m g p r o t e i n ) 。 2 2 7 衣藻总蛋白提取和海藻糖水解酶活性的测定 2 2 7 1 衣藻生长曲线的测定 在三角瓶中培养cr e i n h a r d t i is t r a i n 8 4 9 。每1 2 小时取样，分别测定样品的o d 7 5 0 的值及叶绿素含量( 0 d 及o d 6 , 5 ) 。 细胞生长的o d 7 5 0 值检测 据文献报道，o d 7 5 0 与莱茵衣藻的细胞数正相关，因此可以o d 7 5 0 值表示衣藻的 生长情况。将对数生长后期的衣藻以1 的比例接种到新鲜的t a p 液体培养液中。使 每种藻细胞的初始浓度基本一致，培养时转速为1 3 0r p m ，温度2 4 2 5 。c ，光强3 0 - 1 0 0 p m o lm - 2 s 。从接种起每隔1 2h 取藻细胞悬浮液，用7 5 4 分光光度计测定o d 7 5 0 。 衣藻叶绿素含量的测定 取l m l 藻液，低速离心收集藻细胞，加入同体积的8 0 丙酮溶液，用移液器吹吸 均匀，室温避光放置2 0 分钟后( 0 - i 以放入2 0 c 冰箱保存以备同时测定o d 值，减少 误差) ，4 c 下1 2 0 0 0r p m 离心t 0m i n ，取上清，测定o d 6 6 3 及o d 6 4 s 值。根据下歹 j 公 式计算出叶绿素a ，叶绿素b 及总叶绿素的含量，单位是m g l 。 c h l a = 1 2 7 a 6 6 3 - 2 6 9 a 6 4 5 c h l b = 2 2 9 a 6 4 5 4 ，6 8 a 鳓 c h l = c h l a + c h l b = 2 0 ，2 a 6 4 5 + 8 0 2 a 2 2 7 2海藻糖水解酶提取缓冲液的配制 根据表中韵成分配截缓冲液，4 v 避光保存； 上海师范大学硕士学位论文材料与方法 g l y c e r o l 5 h e p e s 2 0 m m ( p h = 7 5 1 e d t a 1 m m ( p h = 7 5 ) m g c i 2 5 m m d t tl m m p r o t e a s ei n h i b i t o r s ： b e n z a i i l i d i i l e5 m m ( 加入其中的一种即可有 a m i n o - n - c a p r i o i ca c i d 1 0 m m 效抑制蛋白酶的活性)p m s fl m l v l s o d i u n lb i s u l f a t e1 0 m m 2 2 7 3 衣藻粗蛋白的提取 将4 l 的cr e i n h a r d t i is t r a i n 8 4 9 培养至对数生长期中期，分别用5 0 m ld o f f 管低速 离心收集藻体后用o 5 m l 上述海藻糖抽提缓冲液溶解后移入1 s m l 的d o f f 管中。每管 加入2 9 lb - 巯基乙醇至于冰上，迅速丢入液氮中放置3 分钟。从液氮罐中取出后置于 冰上至融化，再反复冻融两次。将所得到的融解液在4 c 下1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟， 收集上清液将其移入新的干净且干燥的高速离心管中。 利用蛋白质在不同的盐浓度下会析出的原理，在收集的蛋白提取液中加入4 c 预 冷的饱和硫酸铵溶液使终浓度达到3 0 ，放置于冰上1 2 小时，在4 c 下1 7 0 0 0 r p m 高 速离心3 0 分钟，上清液移入另一支干净且干燥的高速离心管中，再加入适量饱和硫 酸铵溶液，使终浓度达到3 5 ，继续放于冰上1 2 小时后高速离心，再取上清并加入 饱和硫酸铵使终浓度为4 0 0 , 6 ，如此类同，依次使硫酸铵终浓度4 5 和5 0 。上述每次 的沉淀用l m l 新鲜的海藻糖提取缓冲液溶解后置于冰上保存，用于检测海藻糖水解酶 活性。 2 2 7 4 衣藻粗蛋白的脱盐处理 用不同浓度硫酸铵分步沉淀的衣藻粗蛋白在检测其水解酶活性前，还须用脱盐柱 ( h i t r a pd e s a l t i n g ，a m e r s h a m ) 对其进行脱盐处理。 首先用2 5 m l 新鲜的海藻糖水解酶提取缓冲液将脱盐柱中原有的保护液完全替代。 再用5 m l 的注射器将1 5 m t 的衣藻蛋白粗提液缓慢注入脱盐柱中，再注入2 m l 新鲜的 海藻糖水解酶抽提缓冲液同时收集过柱后的脱盐溶液，于冰上保存，用于酶活的测定。 每一个样品过柱后必须用1 5 m l 新鲜的海藻糖水解酶提取缓冲液完全清洗脱盐柱后才 莱菌农藻中海藻糖水解酶的基因t r e h 在e c o l i 中表达及功能鉴定 能再次加入第二个样品。当全部样品都经过脱盐处理后，脱盐柱用5 0 m l 的2 0 乙醇 溶液完全替换后可于4 长期保存。 2 2 7 5 脱盐后的粗蛋白的酶活测定 根据2 2 6 5 所叙述的方法将4 0 0 1 1 9 粗蛋白液与海藻糖底物反应6 0 分钟，计算各 粗蛋白中的海藻糖水解酶的酶活。 2 2 7 6 可溶性蛋白的标准曲线 根据b r a d f o r d 法，测定可溶性蛋白的含量。首先分别配置浓度分别为0 、0 2 、0 3 、 0 6 、o 9 m g 的b s a ( 牛血清蛋白) 标准溶液与b r a d f o r d 染液( b i o r a d ) ，室温反应1 5 分钟后分别测定其o d 5 9 5 的值。根据所得到的数值制作标准曲线计算线性关系式( 图 3 4 ) 。从图中可以看出蛋白的浓度与o d 5 9 5 的值在0 o 9 m g 蛋白的范围内呈线性相关， 因此可以根据得到的线性方程及样品的o d 5 9 5 的值计算出样品中可溶性蛋白的量。 n20 40 60 8 标准b s a 浓度( 嗨) 图2 - 3b r a d f o r d 法测定可溶性蛋白的标准曲线 f i 萨- 3s t a n d a r dc u r v ef o rs o l u b l ep r o t e i nc o n c e n t r a t i o nu s i n gb r a d f o r dm e t h o d e m m m m n 仉仉仉 吣需o o 上海师范大学硕士毕业论文 结果与分析 3 结果与分析 3 1 衣藻的同步化培养 3 1 1 同步化培养条件 根据文献报道，在暗培养前7 小时将进入对数生长期后期的衣藻进行接种，此后 1 2 h 暗培养1 2 h 光照培养，可以获得同步生长的衣藻培养体( h a r r i s ，1 9 8 9 ) 。本实验通 过光学显微镜检测证实此方法可以获得同步生长的衣藻培养体系( 图3 一1 ) 。 图3 - 1 衣藻在1 2 h 暗培养1 2 h 光照下培养第三天达到同步化生长 f i g 3 - 1c r e n h a r d 娃i a c h l e v e ds y n c h r o n o u s l y g r o w t h a f t e r 3 d a y s o f l 2 h o u r l i g h t ：1 2 h o u r d a r k c y c l e 3 1 2 衣藻生长曲线的测定 根据材料与方法中的叙述，将对数生长期后期的衣藻8 4 9 以l 的接种量接种至 新鲜的液体培养基中，在5 0 p m o l m - 2 s 1 、光照周期1 2 h 1 2 h 、温度2 5 - - + 1 、水平摇床 转速1 3 0 r p m ，条件下对衣藻8 4 9 进行同步化并测定生长曲线，结果如图3 - 2 。从图中 可以看出，衣藻8 4 9 从第三天起进入对数生长期，