（植物学专业论文）喜树中喜树碱积累规律及组织培养的初步研究.pdf

喜树中喜树碱积累规律及组织培养的初步研究 摘要：喜树( c a m p t o t h e c aa c u m i n a t ad e c n e ) 为蓝果树科( n y s s a c e a e ) 落叶乔 木，全株含抗肿瘤活性成分一喜树碱。本文以喜树为材料，就以下方面进行了 研究：通过组织培养技术，成功地对其进行了喜树愈伤组织的诱导与继代，为以 后的悬浮培养做了基础性工作；比较分析了我国十三个省区喜树果实中喜树碱 ( c p t ) 和l o 一羟基喜树碱( h c p t ) 含量变化规律，为选择喜树优势种源提供 了依据；研究了喜树幼枝发育过程中各组织结构变化特别是分泌结构的变化，确 定c p t 在营养器官中的积累部位和分布规律，为提高c p t 的产量和喜树优良品 系的选育提供了科学依据。本实验的主要结果如下： 1 选取喜树备部分作为外植体进行愈伤组织的诱导，以芽、幼叶、幼茎为佳， 尤以幼茎最佳。选取了b d s ，m s 两种基本培养基对外植体进行诱导，发现基本 培养基对愈伤组织诱导率的影响不显著，但对其生长的影响较为显著，b d s 基 本培养基更有利于愈伤组织的生长。将n a a 、2 ，4 d 、6 - b a 、k t 等生长调节物 质分别附加在b d s 基本培养基中进行单因子实验，愈伤组织白色、干燥、致密。 选取n a a 、2 , 4 一d 、6 - b a 、k t 等4 种生长调节物质以不同组合及浓度配比附加 在b d s 基本培养摹中，结果表明，激素组合比单激素更能有效地诱导出愈伤组 织，其中以b d s + 2 , 4 一d1 0 m g l 十k t 0 6 m g l ，b d s + 2 ，4 一d1 5r a g l + k t 0 6 m g l ，b d s + 2 ，4 - d 2 0 m g l + k t 0 6 m g l 的组合诱导效果最好，愈伤组织湿润、疏 松，呈淡黄色。不同组合因子对愈伤组织继代培养的效应结果表明，b d s + 2 , 4 d o 5 m g l + k t 0 6 m g l 是最佳的继代配方，其次为b d s + b a 2 0 m e d l + n a a 0 2 m g l ，b d s + n a a 3 0 m g l + k t 0 6 m g l ，愈伤组织湿润、疏松，长势良好。 2 高效液相色谱法测定了采自于我国十三个省区喜树果实中喜树碱和1 0 羟 基喜树碱的含量，发现福建的喜树果实中喜树碱含量最高，贵州的喜树果实中喜 树碱含量最低，且差异极显著( p o 0 1 ) 。四川的喜树果实中1 0 - - 羟基喜树碱含 量最高，贵州的喜树果实中l o 一羟基喜树碱含量最低，且差异极显著( p 0 0 1 ) 。 分析同一省份( 浙江) 不同地区( 杭州、金华、磐安) 的喜树果实中喜树碱及 1 0 羟基喜树碱含量发现，三者含量差异不显著。比较分析新鲜喜树果实与放置 一年喜树果实中喜树碱及1 0 - - 羟基喜树碱含量，一些产地的含量有差异，一些 没有差异。分析喜树果实( 果皮和种子) 中喜树碱和1 0 - - 羟基喜树碱的含量， 发现喜树碱主要存在于喜树种子中，而1 0 - - 羟基喜树碱在喜树果皮和种子中的 含量相当。 3 对喜树幼枝发育过程中各组织结构变化的观察和喜树碱含量的分析，以及 荧光显微技术对喜树碱的定位研究，结果表明，幼茎和幼叶表面的单细胞腺毛和幼 茎及幼叶内部由1 2 层细胞包围而成的分泌道是喜树碱的主要积累部位，且 随着茎和叶的逐渐发育成熟，分泌道的密度也逐渐降低，最后完全消失。通过对 幼茎中各节间横切面分泌道密度的统计和喜树碱含量的分析，发现分泌道密度与 喜树碱含量呈正相关，分泌道的密度越大，喜树碱的含量越高，两者成线性相关。 关键词：喜树喜树碱1 0 一羟基喜树碱幼茎果实组织培养 高效液相色谱法荧光显微技术 s t u d i e so na c c u m u l a t i o no fc a m p t o t h e c i na n dt i s s u e c u l t u r ei nc a m p t o t h e c aa c u m i n a t ad e c n e a b s t r a c t ：c a m p t o t h e c i n ( c p t ) i sa ni m p o r t a n ta n t i t u m o rc o m p o n e n te x t r a c t e d f r o mc a m p t o t h e c aa c u m i n a t ad e c n e ( n y s s a c e a e ) ，w h i c hd i s t r i b u t e di nt h es o u t ho f c h i n a i no r d e rt or e c o g n i z et h ec h a r a c t e r i s t i co fc p ta c c u m u l a t i o ni nt h ep l a n t ， r e s e a r c h e s i n v o l v i n g t i s s u ec u l t u r e ，d e t e r m i n a t i o no fc p tc o n c e n t r a t i o na n d a c c u m u l a n o n 1 0 c a l i z a t i o no fc p th a v eb e e nc a r d e do u t i nt h et i s s u ec u l t u r es t u d y i n g ，6t y p e so fe x p l a n t sw e r es e l e c t e d ，b u d ，y o u n gl e a f a n dy o u n gs t e mw e r eo p t i m a l ，y o u n gs t e mw a st h eb e s to ft h e m m e a n w h i l e ，t h e i n f l u e n c eo fb a s a lc u l t u r em e d i u m ( b d s ，m s ) a n dh o r m o n e ( n a a ，2 ，4 - d6 - b a ，k d o nt h ec a l l u si n d u c t i o na n ds u b c u l t u r ew e r es t u d i e d t h er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h e r e w e r en os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eo nt h ei n d u c t i o nr a t i o ，b u tb d si m p r o v et h eg r o w t ho f c a l l u s a n dt h eu s i n gh o r m o n ei nt i s s u ec u l t u r ew i mc o m b i n a t o r i a lw a yi sb e t t e rt h a n t h a to fs i n g l e b d s + 2 ，4 d 1 0m g l + k t 0 6m e i ：, b d s + 2 ，4 一d 1 5m g l + k t 0 6 m 【g l ，b d s + 2 ，4 一d 2 0m g l + k t 0 6m g lw e r ee f f e c t i v ef o ri n d u c t i o n o t h e r w i s e b d s + 2 ，4 - d 0 5 m g l + k t 0 6 m g l ，b d s + b a 2 0 m g l + n a a 0 2 m g l ，a n db ds+ n a a3 0m g l + k t0 6m g lw e r eo p t i m a lf o rs u b c u l t u r ei na l lc o m b i n a t o r i a l f o r m u l a e s e c o n dp a r t ，t h ec p ta n dh c p tc o n c e n t r a t i o ni n1 5 s a m p l e sf r o ms o u t ho f c h i n aw e r ed e t e r m i n e db yh p l c t h er e s u l ts h o w e dt h a tc p tc o n c e n t r a t i o ni n 仔u i t f r o mf u j i a np r o v i n c ew a st h eh i g h e s t ，a n dw h i c hf r o mo u i z h o up r o v i n c ew a st h e l o w e s ti na 1 1s a m p l e s t h e r ew a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nc p tc o n c e n t r a t i o nb e t w e e n t h e mr p o 0 1 ) i ta l s of o u n dt h es a m er e s u l ti nh c p t h c p tc o n c e n t r a t i o ni nf r u i t f r o ms i c h u a nw a st h eh i g h e s t ，a n dw a st h el o w e s tf r o mg u i z h o ui na l l s a m p l e s c o m p a r i n gt h ec p ta n dh c p tc o n c e n t r a t i o ni n3s a m p l e sf r o md i f f e r e n ta r e a ( h a n g z h o u 、j i n h n a 、p a n a n ) i nz h e j i a n g ，i ts h o w e dt h a tt h e r ew a sn od i f f e r e n c e a m o n gt h e m t h ec p ta n dh c p ti nf r u i to ff r e s ha n ds t o r e d1y e a rf r o md i f f e r e n t a r e a sw e r ec o m p a r e d ，t h ed i f f e r e n c ew e r ei no rn o ta m o n gt h e s es a m p l e s c o m p a r i n g t h ec p ta n dh c p tc o n c e n t r a t i o ni nf r u i t ( p e r i c a r pa n ds e e d ) ，i ts h o w e dt h a tm o s to f c p tw a sd i s t r i b u t e di ns e e d ，a n dh c p tw e r ed i s t r i b u t e da v e r a g e l yi np e r i c a r pa n d s e e d t h ed e v e l o p m e n to fy o u n gs t e m sa n dl e a v e sw e r ei n v e s t i g a t e du s i n go p t i c a l ， f l u o r e s c e n c ea n ds c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p ya n dt h ec a m p t o t h e c i nc o n t e n ti n c a m p t o t h e c aa c u m i n a t aw a sa n a l y z e db yh p l c s e c r e t o r ys t r u c t u r e ，e s p e c i a l l y s e c r e t o r yc a n a l sw e r ef o u n d al i n e a rr e l a t i o n s h i p = 0 9 2 5 7 ) w a sf o u n db e t w e e n c p tc o n t e n ta n ds e c r e t o r yc a n a l d e n s i t yo fs t e m t h es e c r e t i o ni nc a n a l sa n d g l a n d u l a rt r i c h o m e ss h o w e di n t e n s eb l u ea u t o f l u o r e s c e n c eu n d e r3 6 0 n mu vl i g h t t h er e s u l t ss h o w e dt h a t c a m p t o t h e c i n w a sp r i m a r i l ya c c u m u l a t e di n g l a n d u l a r t r i c h o m e sa n ds e c r e t o r yc a n a l so fs t e m sa n dl e a v e s k e yw o r d ：c a m p t o t h e c aa c u m i n a t ad e c n e ，c a m p t o t h e c i n ，10 一o h c a m p t o t h e c i n ， y o u n gs t e m ，f r u i t s ，t i s s u ec u l t u r e ，h p l c ，f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y 缩略表 b d sd u n s t a na n ds h o r tb d s 培养基 m e d i u m m s m u r a s h i g e a n d s k o o gm s 培养基 m e d i u n l 6 - b a 6 - b o r t z y la m i n op u r i n e6 一苄氨基嘌呤 2 ，4 一d 2 , 4 一d i c h l o p h e n o x y a c e t i c2 ，4 一二氯苯氧乙酸 a c i d k t 6 - f u r f u r y l a m i n o p u r i n e6 一糠氨基嘌呤 n a a n a p h t h a l e n e a c e t i ca c i dc 1 一萘乙酸 c p t c a m p t o t h e c i n喜树碱 h c p t 1 0 一o h c a m p t o t h e c i n1 0 一羟基喜树碱 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间论 文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交 论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存和汇编本学位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文 章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：主j 6 e 羟指导教师签名：j 弛 阳阵石月f 日肿石月阳 独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：璐 签字日期：时年彳月f 日 第一章前言 喜树( c a m p t o t h e c aa c u m i n a t ad e c n e ) ，山茱萸目( c o m a l e s ) 蓝果树科 ( n y s s a c e a e ) 喜树属( c a m p t o t h e c ad e c n e ) 植物，落升阔叶乔木，我国特有树 种，分布于我国长江流域及西南各省0 1 。喜温暖气候，不耐严寒，根、果及树皮、 树枝、叶均可入药。含有抗肿瘤作用的生物碱：喜树碱、喜树次碱及1 0 - - 羟基 喜树碱、甲氧基喜树碱等【2 1 。1 9 6 6 年美国的m o n r o ee w a i l 等入首次从喜树中分 离出喜树碱( c a m p t o t h e c i n ，c p t ) 1 3 ，这是一个很特殊的生物碱，它不能与酸成 盐，不溶于酸，也难溶于一般有机溶剂；经肿瘤实验证明这种吲哚类生物碱具有 抗癌活性 4 1 ，从而引起人们的广泛关注。早期的药理实验表明喜树碱对多种恶性 肿瘤均有显著的抑制作用，但由于较明显的骨髓抑制、白细胞减少、对泌尿道刺 激所导致尿频、血尿等副作用，以及制成水溶性的钠盐后其抗癌活性降低等原因， 未能实现临床应用口“】。上世纪8 0 年代后期的研究发现，喜树碱能通过抑制拓扑 异构酶i ( t o p o i s o m e r a s ei ) 来发挥细胞毒性的独特抗癌机理。引发了喜树碱抗 癌研究的新热潮。喜树碱及其衍生物是迄今为止发现的唯一一类专门通过抑制拓 扑异构酶i 发挥细胞毒性的天然植物活性成分f 4 】。s t e w a r t i ”，p a n t a z i s 8 1 ，d e p t a l a 9 1 ， c o h e n t o 等研究发现c p t 的抗癌机理同时表现在两个方面，一是对d n a 复制的 抑制：二是对r n a 合成的抑制。p r i e l 1 1 】，l i t 味1 3 1 等研究发现c p t 对病毒的抑制 作用同时表现在两个方面，一是在病毒感染早期阻断其复制，二是在慢性感染细 胞中抑制病毒的表达。从喜树碱衍生物中筛选与喜树碱具有相同抗癌机理且高效 低毒的新化合物，已成为获得新型抗癌抗病毒药物的方法之。 自1 9 8 5 年以来，尤其是进入9 0 年代后，美国、日本、加拿大和英国等国家 积极投入大量的人力、物力进行喜树研究和喜树碱的开发，使喜树成为继红豆杉 之后第二个重要的木本抗癌药用植物，成为世界性热门研究课题。 l 喜树活性成分的研究 1 1 喜树碱及其衍生物的分离发现 喜树体内化学成分十分复杂，但具有生物活性的主要成分是生物碱。w a l l 等1 9 6 6 年首次从喜树皮中分离出一种新生物碱，将其定名为c a m p t o t h e c i n ( c p t ) ，其分子式为c 2 0 h 1 6 0 4 n 2 ，熔点为2 6 4 2 6 7 【3 1 ，结构式如图1 。它是 个含吡咯异喹啉环的五环内酯生物碱。天然喜树碱为左旋，分子中惟一的手性中 心c 2 0 为s 型。它具有明显的抑制肿瘤作用。 图1 喜树碱结构图 f i g 1m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fc a m p t o t h e c i n 喜树碱( c a m p t o t h e c i n ) ；r = h ； l o 一羟基喜树碱( 1 0 o h c a m p t o t h e c i n ) ：r = o h 此后逐步从喜树中分离出了1 0 一羟基喜树碱( 1 0 h y d r o x y c a m p t o t h e c i n ， 1 0 o h c p t ) ，分子式为c 2 0 h 1 6 0 5 n 2 ，熔点为1 6 8 1 7 0 ；甲氧基喜树碱 ( m e t h o x y c a m p l o t h e c i n ) 分子式为c 2 i h 2 8 0 5 n 2 ，熔点为2 5 4 - - 2 5 5 c 【3 】；1 0 - - 甲氧 基喜树碱( 1 0 一m e t h o x y c a m p t o t h e c i ) 、1 1 一甲氧基喜树碱( 1 1 一m e t h o x y e a m p t o t h e c i n ) 1 6 , 1 4 ；1 9 8 2 年又从果中分离出1 1 一羟基喜树碱( 1 1 - h y d r o x y c a m p t o t h e c i n ) 、喜树 次碱( c 9 h 1 1 0 n ) 1 1 5 和脱氧喜树碱( c 2 0 h 1 6 0 3 n 2 ) 熔点为2 5 8 2 7 4 【6 , 1 4 , 1 6 。 至此，已从喜树中分离出2 0 多种化学成分，其中c p t 及其衍生物有8 种， 它们的共同点是拥有5 个环。 1 2 喜树碱及其衍生物在喜树体内的分布 喜树各器官中喜树碱的含量存在着较大差异，不同学者的研究结果也不一 致，这可能是由于采样时间、部位、分析方法等引起的差异。过去一直认为果实 中c p t 含量最高，次为根皮、树根及树皮，而树枝含量较低1 7 】，多在o 0 1 0 0 4 之间【1 8 】。1 年生枝c p t 含量为o 0 4 2 ( 干重) 1 1 9 1 ，根含量为o 0 5 1 ，木质原 料含量为o 0 5 1 2 0 1 ，但没有指明是否包括根部。近年来的研究结果表明组织越幼 嫩，c p t 的含量越高；枝( 叶) 龄越小，含量越高：皮部较木质含量高。这将导 致原料生产的重大变革，可以通过工厂化生产大量的幼嫩枝稍，为提取c p t 提 供大量、高c p t 含量的原料。从生长点到第八片叶组成的叶尖的c p t 平均含量 达o 1 9 ，是整个地上部分植物材料平均含量0 0 4 4 的4 倍【2 1 】。嫩叶中c p t 含 量高达0 4 ，是种子中含量的1 5 倍，树皮中含量的2 5 倍，随着叶片的逐步长 大、成熟，c p t 的含量剧烈下降m 】。器官中c p t 含量从高到低的变化依次是枝 顶端的1 3 片叶、种子、根皮、和6 片叶和茎尖、枝皮、茎皮、木质部i 矧。 1 2 1 喜树碱在喜树中的积累规律 c p t 在喜树不同器官中的含量不同，但不同组织和器官之间在c p t 含量上 存在着一定的相关关系。如果侧枝中c p t 含量较高，茎中c p t 含量也较高。存 在这种正相关关系的还有根和茎、根和枝之间；但叶片与其它器官、树皮和木质 部间的正相关没有达到显著水平；在同一生长季节内，幼嫩组织与老组织间在 c p t 含量之间相关关系不显著【1 9 】。枝龄不同，其中c p t 含量也不相同。4 年生 以前的幼树，枝龄与c p t 含量呈负相关，即当年生枝包括2 级、3 级与4 级侧枝 中c p t 含量较2 年生、3 年生枝的含量高。4 年生之后，不同年龄的枝条在c p t 含量上差别不大【2 1 l 。叶片在枝条上着生的位置不同，c p t 含量差异也十分显著。 从枝条的生长点到枝基部，叶片中c p t 的含量急剧下降，第1 片叶中c p t 的含 量为0 2 7 ( 干重) ，分别为第3 、5 、7 、9 和第1 l 片叶的1 5 、2 6 、4 3 、5 2 、 和6 3 倍。树龄不同叶片中c p t 含量亦不同，随着树龄的增大叶片中c p t 的含 量迅速下降，2 年生树上的叶片中c p t 的含量是3 年生树上叶片含量的2 倍、是 4 年生的1 6 倍1 2 l j 。 1 2 2 环境因子及自身因素对喜树体内喜树碱含量的影响 1 2 2 1 环境因子对喜树体内喜树碱含量的影响 目前环境因子对喜树中c p t 含量影响的研究较少，不同程度的渍水和遮荫 对幼苗不同器官中c p t 含量的影响完全不同。与全光照对比，重度遮荫( 2 7 光照) 可导致叶片中c p t 含量的提高，对茎中c p t 含量没有影响，可以导致侧 根c p t 含量下降，轻度遮荫( 6 7 光照) 反而使c p t 在侧根中积累；渍水胁迫 对叶片和茎中c p t 含量没有影响但可增加c p t 在侧根中的积累 2 3 1 。王洋等还在 人工控制条件下观察了光强对喜树幼苗叶片喜树碱含量的影响。喜树幼苗叶片的 喜树碱含量随着遮荫程度的增加( 光照强度降低) 而增加，但严重遮荫的( 光强 为全光照的2 0 ) 在处理后期( 7 5 d ) 喜树碱含量降低。叶片的喜树碱含量( 喜 树碱含量与叶片生物量乘积) 在处理初期( 3 0 d ) 随光强减弱而缓慢地略有增加， 处理后期( 4 5 d 以后) 随光强的减弱而有明显增加，但光强低于全光照的6 0 以 后喜树碱产量迅速下降。喜树碱的增加可能是喜树幼苗通过次生代谢过程对不良 环境( 遮荫) 的一种适应性反应【2 4 1 。戴绍军等通过用黄色、红色、蓝色3 种滤光 膜对温室栽培的喜树幼苗进行遮光处理，研究了不同光照环境下喜树幼苗叶片生 物量、叶绿素含量、光合作用和喜树碱含量的差异，发现通过滤光膜遮光促进喜 树碱在幼苗叶片中的积累，提高了叶片喜树碱产量【2 5 。 从4 月到1 0 月，叶片中c p t 含量随着季节的变化而直线下降，下降速率达 1 l 。枝条中c p t 的含量亦是如此，但下降速率明显小于叶片2 ”，这从另一方 面反映出环境因素对喜树中c p t 含量的影响。短期干早胁迫可使叶内喜树碱的 含量明显提高，在生产中可由此提高喜树碱的产量 2 6 1 。增施氮磷钾复合肥可促进 喜树苗的生长，但高生长率并没有出现伴随的喜树碱含量的升高，甚至出现下降 印2 “a 喜树碱为含氮化合物，一般认为增旌氮肥可以提高色氨酸的含量，进而 增加喜树碱合成所需要的可能前体。更精确的无机及有机氮肥试验目前正在进 行，以确定氮对喜树生长、喜树碱含量及其之间关系的影响。 1 2 2 2 自身因素对喜树体内喜树碱含量的影响 在喜树种子萌发过程中，胚乳中喜树碱含量始终最高，但呈降低趋势；种皮 中喜树碱含量较低，呈波动型上升；子叶和胚轴中喜树碱含量变化不明显。种子 萌发后，随着幼苗的发育，子叶中喜树碱含量逐渐升高，出现最大值后迅速下降， 胚轴、根和真叶中喜树碱含量持续降低，幼苗发育到一定时间后趋于稳定【2 9 l 。 1 2 3 采后贮藏与处理方法对原料中喜树碱含量影响 贮藏不当能造成果实中c p t 的损失。新采集的果实与贮藏1 年以上果实相 比，前者c p t 含量比后者高1 倍以上 3 0 1 。干燥方法对原料中c p t 的含量也有显 著影响。在气干、烘干和冷冻干燥3 种处理方法中，经冷冻干燥的原料中c p t 含量高，气干与烘干之间的差异不显著。以叶片为例，与冷冻干燥相比，气干和 烘干可造成叶片中2 7 的c p t 损失 2 ”。这可能是由于液氮冷冻能迅速终止原料 中的各种生理生化活动，使组织中的化学成分得以保存，而气干或烘干则会引起 4 组织中的物质向其它形式转化。 1 2 4 含有喜树碱及其类似物的其它植物 由于c p t 及其类似物的独特抗癌活性，加之喜树中c p t 的含量较低，且喜 树基本上分布在中国，人们希望能发现含量高的新资源。到目前为止已从几个不 同的科中找到含c p t 和甲氧基喜树碱的植物。分别是夹竹桃科( a p o c y n a c e a e ) 狗牙花属的海木狗牙花( e r v a t a m i ah e y n e a n at c o o k e ) 【3 1 3 2 1 ，茶茱萸科 ( 1 c a c i n a c e a e ) 假柴龙树属臭假柴龙树( 臭马比木) ( n o t h a p o d y t e s f o e t i d a ) 3 3 】， 马钱科( l o g a n i a c e a e ) 的m o s t u e a 矗埘胛d 咖以及茜草科( r u b i a c e a e ) 蛇根草属的 硬毛蛇根草( o p h i o r r h i z am u n g o sl ) 【3 5 3 6 l 等。 1 3 喜树碱及其衍生物的提取、分离与测定 c p t 及其衍生物的提取与分离主要是利用这些物质不溶于水而溶于乙醇、氯 仿等有机溶剂等方面的特性，通过渗漉使其溶于这些溶剂中，此后回收溶剂、结 晶即可得到最终产品。 1 3 1 渗漉提取与分离 渗漉是常用的提取方法。首先是将经过粉碎的原料用乙醇或石油醚渗漉，然 后渗漉液减压浓缩，再用氯仿提取，蒸干氯仿即得c p t 的粗提物。粗提物用甲 醇一氯仂( 1 ：1v v ) 混合液溶解后，在水浴上进行回流，此后回收甲醇一氯仿 混合液至结晶析出为止，将结晶滤出，干燥即可得c p t 精制品口7 1 。 1 3 2 柱层析提取与分离 柱层析法的基本过程是先用氯仿提取，再向提取液中加工业乙醇，后用乙酸 乙酯提取经常压浓缩，即得提取液。然后将提取液进行柱层析，洗脱液为含2 、 4 甲醇的氯仿，含2 甲醇溶剂部分析出为c p t ，含4 甲醇部分析出的淡黄色 棱柱状晶体，为1 0 o h c p t ，得率为十万分之一1 3 8 1 。 1 3 3 树脂吸附提取 将喜树果粉用8 0 乙醇在室温下浸泡2 4 h ，用a b 8 树脂对喜树进行吸附， 2 t c ，l m o l l 盐离子浓度p h 为8 的水相为最佳上柱吸附条件；解吸附剂为p h 等于3 的氯仿一乙醇混合溶剂1 3 9 。 1 3 4 碱法提取 精密称取干燥喜树果粉( 6 0 目) 5 9 置于1 0 0 m l 锥形瓶中加入适量n a o h 溶 液，恒温水浴中提取一定时间，离心后倾出提取液。再加入相同体积的n a o h 溶 液在相同的条件下提取，共提取3 次，合并提取液。滴加盐酸调节至p h 值为5 - 6 ， 8 0 0 0 r m i n 的条件下离心8 r a i n , 取上清液移入5 0 0 m l 容量瓶中。以蒸馏水洗涤剩 余沉淀，离心后与上清液合并，以蒸馏水稀释至刻度。取样分析喜树碱浓度，并 计算喜树碱提取率【4 0 】。 1 3 5 超声提取 精密称取喜树叶粉4 9 于1 0 0 m l 容量瓶，加入9 0 m l ，6 1 的乙醇，5 0 。c 下超 声提取1 0 m i n ，冷却至室温，稀释至刻度。取l m l 提取液，1 2 5 0 0 9 离心1 0 m i n ， 吸取上清液分析喜树碱浓度【4 ”。 1 3 6 喜树碱含量的测定方法 c p t 含量的测定方法有分光光度计法【4 2 、荧光法、红外法、高效液相色谱 法( h p l c ) 0 3 删4 种。高效液相色谱法先进、方便、准确，它是目前大家公认 的c p t 及类似物分析及含量测定法。 1 4 喜树碱及其衍生物的人工合成与药物开发 1 4 1 喜树碱及其类似物的人工合成 自c p t 被证实具有抗肿瘤活性以来，便开始了c p t 及其类似物人工合成的 研究工作。美国北卡州( n o r t hc a r l o l i a n a ) 三角研究所( k i t ) ，以w a l l 博士为 首的研究组，近3 0 年来一直从事c p t 及其类似物的合成、结构与活性等方面的 研究，对c p t 的开发研究起着重要的作用一5 1 。早在7 0 年代初期，s t o r k 和t a n g 根据c p t 具有五元环的结构特点，分别以毗咯烷酮和比环烷酮酸为原料，先通 过经典的f r i e d l a n d e r 缩合反应建立a 、b 环，然后在现成的d 环位置上连接构 造e 环的适当碳原子，经环合、氧化两步，制得( ) 喜树碱。w a n i 等对喜树 a 、c 、d 、e 环的结构进行了初步修饰，提出e 环的d 羟基内酯部分是保持抗 肿瘤活性的必需结构【4 ”。这样以吡啶酮为原料先合成d 、e 环，得到重要的三环 衍生物，再与n 一( o - 氨基苄叉基) p 一甲苯胺进行f r i e d l a n d e r 的缩合反应，生成 2 0 支氧c p t ，再进一步氧化成c p t 。关于c p t 及其类似物的合成方面的综述文 章较多h 7 “8 “9 瑚硎翊，这里就不再详细叙述。在喜树碱的化学结构中，a 、b 环的平面性是抑制d n a 拓扑异构酶i 的重要因素，e 内酯环是活性的必需基团 川，c t 位上的空间要求也直接影响内在活性1 4 9 】。因此在合成上不仅要考虑引入 6 的取代基，同时要考虑环系与取代基之间的关系，并注意取代基的性质。这种结 构与治疗效果之间的关系有待今后进一步研究。 1 4 2 药物开发 7 0 年代初用c p t 进行人体胃肠癌的实验性治疗，对部分病人的症状有所缓 解。但由于其缓解期短，易复发，并有严重的毒性和副作用如恶心、呕吐，以及 制成水溶性的钠盐后抗癌活性降低等原因，使试验受阻，c p t 的研究由此进入低 潮阶段【5 2 。1 9 8 5 年，y h h s i a n g 等州发现c p t 能使哺乳动物细胞中的d n a 迅速 地片段化，认为c p t 能阻断拓扑异构酶i ( t o p oi ) 的合成。t o p oi 是一种与 细胞分裂密切相关的酶，能使超螺旋d n a 解旋，在d n a 复制、转录、重组以 及染色体凝集等方面有重要的作用，阻断这种酶的产生即可阻止癌细胞的生长， 说明c p t 的作用靶是t o p oi 而不是拓扑异构酶i i ( t o p oi i ) ，这正是c p t 的抗癌 机理。这一发现掀起了喜树与c p t 研究的新高潮。美国、日本、加拿大和英国 等国家积极投入大量的人力、物力进行喜树研究和c p t 的开发，试图研制出毒 副作用小或没有毒性的合成或半合成具有抗癌活性的c p t 类似物或衍生物，以 及这些衍生物的衍生物，已经取得了一定的进展。美国r i t 的研究人员将其分为 三代【5z ：第一代为喜树中天然的8 种c p t 类似物；目前正在研究和有限制地临 床应用的为第二代，主要有依莲络特肯( t o p o t e c a ni r i n o t e c a n ，c p t - 1 1 ) ， 9 - n i t r o c a m p t o t h e c i n ( 9 n c ) ，9 - a r n i n o c a m p t o t h e c i n ( 9 a c ) 和g g 2 1 1 ( g 1 1 4 7 2 1 l c ) 几种；第三代拓扑特肯( t o p o t e c a n ，t p t ) 。国内外对c p t 及其类似物的药理作 用进行了大量的研究，结果表明这类药物具有抗肿瘤、抗病毒和治疗皮肤病三方 面的作用，并且其中一些c p t 类似物或衍生物没有明显的毒副作用。现已得到 美国f a d 的认可，c p t - 1 1 用于治疗结肠癌和直肠癌，t p t 用于治疗复发性卵巢 癌晡3 1 。最近美国超基因公司( s u p e rg e n ) 又从喜树中获得种抗癌有效成分 r f s 一2 0 0 0 ，用它治疗胰腺癌，能使存活率提高一倍，且口服副作用很小，该公司 认为此药将全面超过紫杉醇 5 4 1 。 1 5 喜树碱及其类似物的应用 1 5 1 喜树碱及其类似物的医疗作用研究 国内外对c p t 及其类似物的药理作用进行了大量的研究，结果表明这类药 物具有抗肿瘤、抗病毒( 可能的治疗艾滋病能力) 和治疗皮肤病3 方面的作用。 1 5 1 1 抗肿瘤 c p t 及其类似物抗恶性肿瘤研究从7 0 年代开始，虽然中间有所停顿，仍取 得了巨大的成就( 刘寿山主编：中药文献研究1 9 6 2 1 9 7 4 ) 。国内外众多学者对 c p t 及其类似物的抗肿瘤活性及作用机制、药代动力学、临床应用、与其它抗肿 瘤药物的联合使用、毒性反应和使用方法都进行了大量研究，这里不再详细论述。 1 5 1 2 喜树碱及其类似物与h i v ，艾滋病( a i d s ) 作为t o p oi 抑制剂的c p t 及其类似物的研究已经完成或即将完成，科学家 们的注意力已逐步转向这些物质的抗病毒性能，特别是与h i v 有关的艾滋病领 域【55 1 。以色列b e n - g u r i o n 大学的p r i e l 和其同事发现d n a 拓扑异构酶i 在h i v 复制中非常活跃5 6 1 ，低剂量的c p t 能阻断被感染细胞( 急性和慢性) h i v - i 的 复制1 5 ”。c p t 类药物不仅对h i v - i 有效，而且对其它与艾滋病有关的病毒也有 效5 钔。美国史克公司研究者认为t o p o t e c a n 和其它用来抗h i v 病毒的c p t 类似 物的毒性太大，但试验表明抗h i v 所需的剂量要小于治疗癌症所需的剂量1 5 8 】。 1 5 1 3 治疗其它疾病 喜树碱的二甲基亚砜溶液治疗银屑病( p s o r i a s i s ) ，疗效快、使用方便5 9 ，60 l ， 且无副作用。针剂治疗的有效率达7 5 7 ，但有些有头晕、膀胱炎等副作用。临 床应用表明，c p t 有希望成为种抑制青光眼滤过手术后瘢痕形成的药物【6 1 1 。 1 5 2 其它作用 c p t 被认为是种光化学活性成分。浓度为l 1 0 4 m o l l 的c p t 溶液能阻 碍烟草和玉米的生长，但对大豆和高粱生长没有表现出影响【2 0 1 。 2 喜树组织培养的研究 近年来，利用植物细胞培养技术生产次生代谢物质在很多药用植物上都取得 了成功翻。随着人们对喜树碱抗癌药物需求的增加，单纯靠从喜树中提取喜树碱 已不能满足人们的需要，利用植物细胞培养的方法产生喜树碱是个有益的新探 讨。 2 1 固体培养 日本的s a k a t o i s 3 嘲等于1 9 7 4 年报道了喜树愈伤组织和悬浮培养细胞的生长 情况以及从悬浮培养细胞中分离和鉴定c p t 的方法。美国的h e l m u t w i e d e r t f e t l l 6 5 1 ，韩国的s c ，n g 等人 6 6 1 主要集中在喜树愈伤组织和悬浮细脆培养方 面，试图从愈伤组织和悬浮细胞中提取喜树碱，并取得了一定的进展。1 9 9 2 年 a r i o n 【6 7 1 又试验了不同培养基上喜树愈伤组织诱导和细胞悬浮培养的情况。我国 赵洁等6 8 1 通过试验得出喜树叶片在离体培养过程中，光质、温度与2 , 4 一d 浓度对 其脱分化率有显著影响，适宜的光质为蓝光和黄光，最适宜的叶片脱分化温度为 2 5 * ( 2 ，2 m g l 为2 , 4 d 最佳浓度。我国何梦玲 6 9 】等以喜树幼嫩叶片为材料，在诱 导愈伤组织培养的过程中发现，不同光质对生长有不同效应，绿光对愈伤组织生 长有促进作用，而蓝光则有抑制作用。我国张冬艳【7 0 】等的研究表明，以s h 为基 本培养基，附加高浓度的n a a 和i b a 对愈伤组织中c p t 的积累有促进作用， 2 , 4 一d 对c p t 的积累有抑制作用。刘文哲研究发现【7 ”以喜树碱高含量的幼叶为 材料，进行了愈伤组织的诱导和培养，并通过优良细胞系的筛选，使愈伤组织中 喜树碱的含量提高到o 0 2 。在对喜树细胞培养的研究中，都存在一个问题，喜 树碱的含量极低，只有十万分之几的水平并且在报道过的对喜树愈伤组织的诱导 的研究中，还没有较系统、较全面的研究报道。在喜树快速繁殖方面，1 9 9 6 年 a s h o k 7 2 1 等成功地通过顶芽培养，实现了喜树的克隆繁殖，认为最适生芽培养基 中的植物激素只能是b a ，最适生根培养基中的植物激素是i b a 。2 0 0 4 年吕立堂 等以喜树茎尖作为外植体，培养在附加不同激素的培养基上，结果以b 5 培养基附 加6 - b a 0 2 m g l + b a 0 0 5 m g l + a s ( a f e n i n es u l f a t e ，1 0 m g l ) 对丛生芽的诱导与增 值效果最佳，而附加b a 0 5 m g l + k t 0 1 m g l + a s l o m g l 的生根效果最佳。试管苗 移栽到珍珠岩一土壤( 3 ：7 ) 的基质中生长良好，成活率高达9 6 【7 3 】。 2 2 悬浮培养 2 2 1 悬浮培养技术 悬浮培养的第1 步是诱导愈伤组织，以茎作为外植体时，诱导愈伤组织的最 佳培养基为m s 培养基，加2 , 4 一d o 1 m g l ，激动素( k t ) o 1 m g l ，n a a 0 1 m g l 。 悬浮培养则以m s 培养基加上k t 3 m g l ，2 , 4 d o 1 m g l 和g a 3 0 0 5 m g l 为宜。 培养基中最佳碳源为3 蔗糖，3 的葡萄糖和可溶性淀粉也有相近的效果。外 植体大小是决定悬浮培养细胞开始生长的关键因子，但提高接种细胞量，并不一 定能提高最终的产量，接种量以2 m g m l ( 以细胞干重计) 为佳2 1 。分别使用 o 11 5 m m o l l 的色氨酸和苯丙氨酸可促进细胞生长，0 0 5 的酶水解酪蛋白较其 它的氨基酸混合物如胨、酵母