（微生物学专业论文）纤维质糖化液生产生物油脂发酵体系研究.pdf

河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 文题目 纤维质糖化液生产生物油脂发酵体系研 究 学位 级别 导师 姓名 硕士研究生 学生 姓名 学位论文 是否保密 王艳颖 i 掌翌l 微生物学吴坤宋安东 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 特此声明。 研究生签名：王拖粮 日期：功衫年月1 ，6e l 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离 开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单 位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农 业大学所有，否则，承担相应的法律责任。 篡嚣鬣彰导蠕习 研究生签名：王耗揿导师签名：妒碜矽学院领导签年匀建1 日期：诽6 月坫日日期：孵年莎月形日日期：o 弓年占月却日 致谢 本文是在吴坤教授和宋安东副教授的悉心指导下完成的，从论文的选题论证 到试验方案和论文撰写，两位导师都给予了全程关键性的指导，并在论文质量和 进度上提出了严格的要求。衷心感谢吴坤教授在整个论文工作期间给予的谆谆教 导和热情关怀。衷心感谢宋安东副教授给予在试验设计，论文撰写，文章投稿， 为人处事等方面的悉心指导和无私关怀。导师们深厚的学术造诣、敏锐的思维、 宽阔的科学视野和踏实的工作作风，将使我终生受益。论文完成之际，衷心祝愿 两位恩师身体健康、工作顺利、合家欢乐、一生平安! 特别感谢生命科学院领导，院办，团委对我工作、学习的关心和大力帮助。 非常感谢微生物学系贾新成老师、陈红歌老师、邱立友老师、张世敏老师、 刘亮伟老师、王凤芹老师、徐淑霞老师、谢慧老师及微生物实验室赵柏叶老师等， 在我学习和试验当中给予的热心帮助和大力支持。 感谢王慧琴、史小丽、王菲、黄惠敏、冯云、袁丽洁、田建军、裴广庆、陈 伟、李岳桦、张东升、阮森林、张晓强、冯峰、褚长彬等同窗在学习和试验中给 予的无私帮助和大力支持，和你们一起度过难忘的三年研究生美好时光，一路走 来和你们相遇是我终生享用不尽的财富。 感谢师弟师妹楚乐然、薛仁军、刘玉博、高芳、张沙沙、张玲玲、王磊、刘 杰、冯娟、张雷鸣、宋晓峰、张黎明等，做本科毕业设计的李彦毅在试验上给予 我的真诚帮助和全力支持，没有你们的无私帮助，我的论文不可能如此顺利完成。 最后要感谢我的父母，是您们的默默无闻的有力支持我才能走到现在，同时 还要感谢我的姐姐哥哥是你们的支持我才能完成学业。感谢我的朋友韩高峰给我 的鼓励和支持。 王艳颖 2 0 0 8 年6 月 河南农业大学硕士学位论文 纤维质糖化液生产生物油脂发酵体系研究 摘要 生物柴油作为一种重要的生物质能源已引起世人重视，其生产和应用已成为缓解能源危 机的重要组成部分，但是制约生物柴油产业化的瓶颈问题主要是原料供应。本文对纤维质原 料生产生物油脂发酵体系进行了研究，主要包括纤维质糖化液生产生物油脂发酵体系优化和 纤维质糖化液脱毒两个方面，以提高发酵效果，因此具有重要理论和实际意义。 对发酵性丝孢酵母2 1 3 6 8 的纤维质糖化液发酵体系进行优化，通过摇瓶培养试验，发 现最佳优化发酵体系是：外加碳源4 葡萄糖，质量比3 ：l 的酵母粉+ ( n h 4 ) 2 s o 。复合氮源， c n 比8 0 ：1 ，p h6 0 ，1 0 的接种量，加入金属离子和0 2 的橄榄油，封口膜封口。在此 条件下，菌体生物量达到2 1 。3 9 l ，菌体含油率达到4 6 4 ，油脂浓度达9 9 9 l ，糖油转化 率达到1 2 3 。 通过纤维质糖化液脱毒试验表明，适合纤维质糖化液脱毒的最优方法是活性炭加入量为 1 o v a ，乙醛加入量为4 0 0 m g l ，黄孢菌加入量为1 0 m l l 。此时，菌体生物量为2 1 2 9 l ， 菌体含油率为5 0 9 ，油脂浓度为1 0 8 9 r l ，糖油转化率为1 3 ，5 。 对本试验所获得的生物油脂的成分及含量进行了分析，其主要成分为：十四碳酸甲酯、 十六碳酸甲酯、十七碳烯酸甲酯、( 亚) 油酸甲酯、二十碳酸甲酯、二十二碳酸( 烯酸) 甲酯、 二十四碳酸甲酯。这也正是生物柴油的主要成分，基本满足了生物柴油原料的供应要求。与 菜籽油脂肪酸和桐油脂肪酸成分比较，发现利用纤维质为原料制备的生物油脂中c 1 6 c 1 8 所占比例较高，且资源丰富、价格廉价，可以作为生物柴油产业化生产的原料供应。 关键词：生物油脂；纤维质原料；糖化液；发酵条件；脱毒 河南农业大学硕士学位论文纤维质糖化液生产生物油脂发酵体系研究 1 文献综述 1 1 世界能源开发利用 1 1 1 世界能源现状 能源是国民经济重要的基础产业，是人类生产和生活必需的基本物质保障。未来科技、 经济和社会发展的竞争将是能源的竞争。目前，世界化石能源资源的有限性和开发利用过程 中引起的环境问题，严重制约着可持续发展【l 】。据世界能源委员会( w e c ) 和国际应用系统分 析研究所o l a s a ) 分析，虽然全球化石燃料最终可采储量至少还可供人类使用l o o a ，但开采 成本较低的储量将在2 l 世纪后期耗尽【2 j ，天然气也仅供开采6 0 a ，严重的危机向人类提出了 严厉的警告。因此，无论是从环境还是资源角度看，必须加速发展可再生能源，而生物质能 是可再生能源的重要组成部分。生物质能是通过光合作用将太阳光的物理能转化为化学能贮 存在生物体内的能量。从全球范围看，目前生物质能是仅次于石油、煤炭和天然气的第4 大能源。生物质资源通常包括以下几个方面：一是木材及森林工业废弃物；二是农业废弃物、 草根纤维等；三是水生植物；四是油料植物；五是城市和工业有机废弃物；六是动物粪便1 3 】。 1 1 2 生物柴油产生和性质 1 1 2 1 生物柴油的产生 生物柴油( b i o d i e s c l ) ，即脂肪酸甲酯，是一种含氧清洁燃料。它是由甲醇或乙醇等醇类 物质与天然植物油或动物脂肪中主要成分甘油三酸酯发生酯交换反应，将甘油基断裂为三个 长链脂肪酸甲酯。生物柴油的主要成分是软脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸等长链饱和与不饱 和脂肪酸同甲醇或乙醇所形成的酯类化合物【4 】。1 8 9 5 年德国热机工程师d r r u d o l f d i e s e l ( 1 8 5 8 1 9 1 3 ) 在发明发动机时并没有计划用石油作燃料1 5 l 。1 9 0 0 年，巴黎博览会上第一 次展示的发动机是用花生油作燃料的。1 9 8 3 年美国人g r a h a mq u i c k t 6 】首先将亚麻油和棉籽油 酸甲酯用于柴油机，并将经过酯交换得到的脂肪酸单酯定义为生物柴油( b i o d i e s e l ) t ，可以 单独使用，也可以与传统柴油混合使用。 1 1 2 2 生物柴油的性质 生物柴油是环境友好型绿色燃料，与普通柴油相比，具有以下优点：它是一种可再生 能源，可缓解目前对石油的依赖；使用生物柴油所产生的尾气中有毒有机物、c 0 2 及c o 的排放量仅为普通柴油的1 1 0 ，同时它含硫量低，能大大减少s 0 2 和硫化物的污染问题； 生物柴油的燃点是普通柴油的两倍，因此使用、处理、运输和储藏都极其安全；生物柴 油可生物降解，对土壤和水的污染较小，有利于环境保护1 8 - 9 1 。但是生物柴油具有黏度大的 2 河南农业大学硕士学位论文纤维质糖化液生产生物油脂发酵体系研究 特点，其黏度是普通柴油的2 倍；低温流动性差，试验表明，b 2 0 可使柴油的冷凝点和浊点 升高1 3 ；易氧化和稳定性差，由于生物柴油中含有不饱和双键，使之于石油柴油更容易 氧化；腐蚀性大等缺点。 1 1 3 生物柴油产业化工艺技术 生物柴油是菜籽油、大豆油、回收烹饪油、植物油以及油料作物、农业废弃物等为原料 加工而成，其主要成分是软脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸等长链饱和与不饱和脂肪酸同甲醇 或乙醇所形成的酯类化合物。生物柴油的生产目前主要采用化学法、脂肪酶法。工业化生产 多采用化学法，化学法依据所用催化剂的不同，可以分为两类：碱催化生产法和酸催化生产 法。 碱催化生产法一般用氢氧化钾作催化剂。首先，预热后的原料油与甲醇和氢氧化钾的混 合物进入酯交换反应器反应，为提高原料油转化率，将初次酯交换的反应产物再进入第二反 应器继续反应；然后，二次酯交换反应后的产物进入甲醇蒸馏器，蒸馏所得的甲醇回流循环 使用，蒸馏甲醇后的反应产物进入水洗器，使所制得的生物柴油与甘油、氢氧化钾和甲醇相 分离；分离出的生物柴油进入蒸馏器，脱除水分和甲醇，得到高纯度( 9 9 6 ) 的生物柴油产 品。而水洗器底部流出的混合物，包括氢氧化钾、甘油、水分和甲醇则进入中和器，除去氢 氧化钾后再进入甘油净化器，净化得到所需纯度的甘油副产品【10 1 。如果原料油中游离脂肪 酸的含量较高( 高于o 5 ) 时，为防止游离脂肪酸影响碱催化酯交换反应进行，需要通过酯 化反应将脂肪酸转化为脂肪酸甲酯。 酸催化生产法一般用硫酸作催化剂，由于酯交换所需的甲醇与原料油的摩尔比较高 ( 1 0 0 ：1 ) ，酸催化生产工艺也需要两个连续运行的酯交换反应器。原料油经过酯交换反应， 再蒸馏回收甲醇后，先进行催化剂的中和，以减少下游操作单元中设备的材料费用。其他的 操作单元如水洗、净化等基本上与碱催化生产法相同。 其中前者应用较为广泛。原因是碱性催化剂反应速度比较快，而且不会腐蚀设备。目前 国外应用比较多的催化剂是均相碱性催化剂，如氢氧化钠、氢氧化钾和甲醇钠，其中又属甲 醇钠应用最广泛，所占份额约为6 0 。法国石油研究院开发出e s t e r t i p h 工艺生产生物柴油。 e s t e r f i p h 工艺用尖晶石结构的固体碱作催化剂，采用多相催化反应来制备生物柴油。 与传统以氢氧化钠或甲醇钠为催化剂的液相反应相比，新工艺中不使用酸碱中和步骤和洗涤 步骤，废水和废渣排放较少。同时，副产品甘油纯度很高，超过9 8 。加拿大多伦多大学 开发出b i o x 工艺。该工艺在酯交换反应中引入了惰性助溶剂，使油酯和甲醇成为一相，从 而大大加快了反应速度。同时该工艺包含了酸催化和碱催化两个过程，可以处理高酸值的动 植物油，油脂中游离脂肪酸含量可以高达3 0 。 酶法催化合成生物柴油，对原料品质没有特别要求。酶法不仅可以催化精炼的动植物油。 同时也可以催化酸值较高且有一定水分含量的餐饮废油转化成生物柴油。酶法反应具有条件 3 河南农业大学硕士学位论文纤维质糖化液生产生物油脂发酵体系研究 温和，副产品分离工艺较为简单，废水少，设备要求低等优点，日益受到人们的重视1 1 1 | 。 脂肪酶按催化特异性可以分为三类，第一类脂肪酶对甘油酯上的酰基的位置没有选择性，可 以水解甘油三酯中的所有酰基，得到脂肪酸和甘油。第二类脂肪酶水解甘油三酯中的l 、3 位酰基，得到脂肪酸、甘油二酯( 1 ，2 甘油二酯和2 ，3 一甘油二酯) 和单甘酯( 2 单甘酯) 。第三 类脂肪酶对脂肪酸种类和链长有特异性。用脂肪酶催化甘油三酯和甲醇酯交换合成生物柴 油，一般都是在非水相体系中反应。在非水相体系中，酶的活力高、甘油三酯的转化效率高。 最简单的非水相体系是无溶剂体系，即直接把酶加到底物甲醇和甘油三酯中催化酯交换反 应。这种反应体系工艺简单，产物容易分离，成本相对较低。但是由于甲醇在甘油三酯中的 溶解度有限，当甲醇和甘油三酯摩尔比超过1 ：1 ( 即甲醇和脂肪酸摩尔比l ：3 ) 时，一部分不 能溶解在油中的细小甲醇微滴会造成脂肪酶( 绝大多数微生物脂肪酶) 不可逆失活。为了防止 脂肪酶在甲醇中的不可逆失活，可以分3 次添加反应所需要的甲醇，每次添加反应所需要量 的1 3 。当向体系中添加有机溶剂【l 训( 如正己烷等) 或水时，脂肪酶对甲醇的耐受能力有一定 程度的提高，但是并不能提高反应的总转化率。也可以用乙酸甲酯替代甲醇作为酶法催化酯 交换的底物，即使乙酸甲酯和油的摩尔比为1 2 ：1 ，也不会造成脂肪酶( c a n d i d a a n t a r c t i c a ) 的 失活，甘油三酯的转化率可达9 2 【1 3 】。华南理工大学【1 4 】等采用3 4 级固定床反应器进行连续 转酯反应，分批( 3 4 次) 流加甲醇，减小甲醇对脂肪酶的毒害，提高生物柴油得率，同时在线 分离副产物甘油，减少甘油对反应体系的副作用。高静【1 5 】等用纺织品吸附法固定化假丝酵 母脂肪酶c a n d i d i as e9 9 1 2 5 ，然后在石油醚体系中催化废油脂( f f a 达4 6 5 7 ) 合成生物柴 油，发现转化率在7 0 以上。最近，日本m i z u s a w a 化工公司就计划利用粘土负载的脂肪酶作 催化剂，以工业废动植物油为原料生产生物柴油，同时可获得维生索b 2 。日本久保大学和 k a n s a i 化工公司联合研究r h i z o p u o r y z a e 全细胞生物质负载酶催化剂也有望投入工业应用。 生物柴油的制备工序如图1 1 。 降低酸值 l 油脂t - 5 预处理i 干燥除水 网 i一 催化剂 图1 1 生物柴油制备主流程图 f i g 1 - l b i o o i lp r u d u c e sm a i nf l o wc h a t 4 河南农业大学硕士学位论文纤维质糖化液生产生物油脂发酵体系研究 如图1 1 ，原料油或废油脂经预处理除去杂质和游离酸，并脱除水分，然后在催化剂的 作用下与甲醇发生酯交换反应。反应结束后进行分层，上层为粗制甲酯，下层为甘油。粗甲 酯经精制即得脂肪酸甲酯。 图l - 2 甘油回收及废水处理流程图 f i g i 2g l y c e r o lc a l l b a c ka n dw a s t ew a t e rd i s p o s a lf l o wc h a t 如图1 2 ，在下层的甘油中加入酸以中和残余的催化剂，并蒸馏回收甲醇，便得到粗甘 油，粗甘油再经蒸馏就能获得纯甘油。从反应过程产生的废水中除去甲醇和催化剂，就可得 到未反应的油，该油也可作为燃料油。 生物柴油生产过程中产生的大量副产物甘油，每生产1 0 t 生物柴油就可以联产1 t 甘油， 这导致世界甘油供应量持续过剩，价格下滑，已经严重影响到了生物柴油产业在经济上的生 存能力。因此，对副产物甘油进行更加充分地利用，提高其附加值，可以使生物柴油的生产 成本降低，这已经成为降低生物柴油成本的一条有效途径7 1 。徐友海刘飞【1 9 1 分别用不 同方法把甘油发酵成l ，3 一丙二醇，并对其体系进行了构建。p e r o s a l 2 0 1 和d a s a r i l 2 1 】分别用不 同的催化剂在高温高压下将甘油转化为l ，3 一丙二醇。据报趔2 2 j ，法国s o l v a y 公司采用e p i c e r o l 新工艺以甘油为关键原料生产环氧氯丙烷。蒋建兴【2 3 】等也对利用甘油生产环氧氯丙烷进行 了研究，环氧氯丙烷还可进一步生产环氧树脂、纸张增强剂和其他产品。b e r t r a n d 2 4 - 2 5 1 首先 发现用醋酸杆菌发酵甘油制得二羟基丙酮。l e e 2 6 】等人研究出用产丁二酸厌氧螺旋酵母发酵 甘油生产丁二酸的新途径。k o l l e r l 2 7 l 等人对耐高渗透微生物发酵水解乳清甘油来生产聚羟基 脂肪酸酯进行了研究。k a r i n e n t 2 8 】等人研究了在催化条件下，利用异丁烯醚化甘油，使甘油 生成了5 种醚，另外的副反应是异丁烯经反应生成了c 1 6 c 1 8 的碳氢化合物。c a r m i n e s 和 g a w o r s k i 也详细将甘油作为烟草成分的毒理学性质进行了研究【2 9 1 。 1 2 生物柴油原料类型 植物油、动物油、废弃油脂或微生物油脂都可以经转化而形成脂肪酸甲酯或乙酯，即生 物柴油。 5 河南农业大学硕士学位论文 纤维质糖化液生产生物油脂发酵体系研究 1 2 1 动物油脂 生产生物柴油的动物油脂包括猪油、牛油、羊油和鱼油等。猪油主要富含棕榈酸( 2 6 ) ， 油酸( 4 4 ) 、亚油酸( 1 l ) 和棕榈油酸( 5 ) 。因此，适合生物柴油的生产。其中美国和日本 已用之投产。高质量牛脂的脂肪酸分布是肉豆蔻酸( 1 8 ) ，棕榈酸( 1 7 3 7 ) ，硬脂酸( 6 0 ) 和油酸( 2 6 5 0 ) ，还包括其它不饱和酸。目前全球最大牛油脂生物柴油工厂在巴 西投产。位于加拿大n o v as c o t i a 的o c e a nn u t r i t i o no p e r a t i o n 公司利用海洋鱼类脂肪自产自 用生物柴油，而畜牧业发达的澳大利亚和新西兰利用牛羊肉食品加工中产生的动物脂肪副料 进行生物柴油生产( b i o d i e s e la s s o c i a t i o no f c a n a d a ，2 0 0 4 ) 3 0 】。 1 2 2 植物油脂 用于生产生物柴油的植物有大豆、油菜、棉花、蓖麻等油料作物，油粽、黄连木、麻疯 树、乌桕树、文冠果树等油料林木果实。大豆与我国的主要粮食作物如水稻、玉米等争地， 因此扩大面积的潜力有限，其种子含油量1 6 1 8 ，美国应用基因工程技术改良大豆使其 含油量提高到2 0 。利用大豆加工生物柴油后还可联产动物高蛋白饲料，因而美国等许多国 家都选用大豆作原料生产生物柴油。巴西和阿根廷是世界第二和第三大豆生产大国，目前， 这两国生物柴油基本处于发展时期，因此还未见两国大豆使用在生物柴油上的报道。油菜主 要有白菜型油菜、芥菜型油菜和甘蓝型油菜三大类，其中甘蓝型油菜种子含油量较高，一般 在4 0 左右，高的达5 0 以上。油菜由于仅利用耕地的冬闲季节生长，基本上不消耗地力， 不影响主要粮食作物生产，不与主要粮食作物争地，因此是非常具有发展潜力的作物2 0 0 4 年欧盟国家以双低油菜籽为原料生产生物柴油约1 6 0 万t ，占同期生物柴油生产总量的8 0 。 预计到2 0 1 0 年，欧盟国家将以双低油菜籽生产生物柴油3 4 0 万t 以上。麻疯树是大戟科麻疯树 属，落叶灌木或小乔木，可用于荒山造林，不占耕地，耕作栽培成本低，种子含油量为3 5 - 4 0 ，种仁的含油量高达5 0 6 0 。由于其种子含油率高，且流动性好，其中含有油酸、 亚油酸、棕榈油酸等不饱和脂肪酸，它与柴油、汽油、酒精的掺合性很好，可以很好地用于 生物柴油的原料供应【3 1 1 。四川大学对麻枫树进行了多年研究并得出重要成果，而且建立了 新型麻枫树车用生物柴油生产技术和麻枫树车用生物柴油企业标准。另外，据有关部门的测 试，麻枫树生物柴油的各项指标接近甚至超过o # 柴油标准。麻枫树生物柴油的专利也已被 受理。 1 2 3 废弃油脂 生产生物柴油的废弃油脂主要包括餐饮废油、地沟油、炒菜和炸食品过程产生的煎炸废 油等。动植物油脂经高温烹饪煎炸，饱和脂肪酸越来越多，但8 5 成分以上仍为棕榈酸、 硬脂酸、油酸和亚油酸，尽管存在黏度大、挥发性差、与空气混合效果不好、易发生热聚合 6 河南农业大学硕士学位论文纤维质糖化液生产生物油脂发酵体系研究 等问题，但经过酯交换能够完全满足柴油代用理想品所具备的性能。以废油脂为原料生产生 物柴油，可大大减少废油脂的现存量，减少燃料对化石资源的依赖和环境污染，同时可降低 生物柴油原料的成本。李积华【3 2 】等以“地沟油”为原料、王延耀【3 3 】等以废食用油为原料， 用n a o h 催化制备生物柴油，其产率都在9 0 以上。p e d r of e l i z a r d o 【3 4 j 等以废煎炸油( w f o s ) 和甲醇为原料制备的生物柴油完全符合e n l 4 2 1 4 标准。目前日本利用废弃食用油生产生物 柴油的能力已达到4 0 1 0 4 d a 。 1 2 4 生物油脂 生物油脂即微生物油脂，又称单细胞油脂，是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一 定的条件下，利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源，在菌体内产生的大量油脂 和另一些有商品价值的脂质【3 5 1 。到目前为止，研究较多的是酵母、霉菌和藻类，能够产生 油脂的细菌则较少。利用微生物生产油脂有许多优点，微生物细胞增殖快，生产周期短，生 长所需的原料丰富，价格便宜，同时不受季节、气候变化的限制，能连续大规模生产，生产 成本低【3 6 1 。因此，微生物油脂具有巨大的应用潜力和开发价值。罗玉平等【3 7 1 分离到一株高 产棕榈油酸的酵母，总脂棕榈油酸含量高达5 0 1 4 ，中科院大连化物所实验室筛选出的4 株产油酵母能同时转化葡萄糖、木糖和阿拉伯糖为油脂，菌体含油量超过其干质量的 5 5 【3 8 j 。2 0 0 3 年施安辉、周波通过对粘红酵母g r l 5 1 3 生产油脂最佳小型工艺发酵条件的 探讨发现，最终油脂产量可达菌体干重的6 7 2 t ”】。国内6 0 年代就有过用霉菌和酵母生产 油脂的报导，但研究较多的是在9 0 年代，其研究重点集中在开发微生物功能性油脂方面。 日本在开发生物油脂方面居领先地位，早在1 9 7 6 年日本铃木修等人发现从真菌的头孢霉中 提取的油脂含y 一亚麻酸较多。与此同时，研究者在微生物产油和微生物细胞中提取油脂的 工艺等方面取得了突破性进展。最新文献报道在氮源缺陷型培养基中，深黄被孢霉油脂产量 高达1 8 1 9 m t 删。微藻中不但油脂含量可观，而且直接从微藻中提取得到的油脂成分与植 物油相似，不仅可以替代石油作为生物柴油直接应用于工业上，还可以作为植物油的替代品 【4 2 l 。2 0 0 2 年，c h i a r ab i g o g n o 等人在日本m t t a t e y a m a 分离得到一株微藻 ( p a r i e t o c h l o r i s i n c i s a ) ，不但富含有药用价值的长链不饱和脂肪酸( 主要是a r a c h i d o n i ca c i d ，2 0 ： 4 u 6 ) ，而且甘油三酯( t a g ) 的含量也相当可观，在对数生长期是占总脂肪酸的4 3 ，在稳 定生长期占7 7 1 4 3 1 。2 0 0 4 年清华大学缪晓玲博士，通过异养转化细胞工程技术可以获得脂 类含量高达细胞干重5 5 的异养藻细胞【4 4 1 。有一种称为a r t h r o b a c t e r a r l 9 的细菌，当生长 在高葡萄糖含量的基质中时，能大量积累脂类，主要是不饱和的甘油三酯【45 | ，但是由于细 菌油脂产生于细胞外膜上，提取困难，故产油细菌无工业意义。 1 3 生物油脂发酵技术 在欧洲，生物柴油的主要原料是油菜籽，在印度主要用麻疯树籽，美国是大豆【4 “7 1 ，原 7 河南农业大学硕士学位论文纤维质糖化液生产生物油脂发酵体系研究 料费用占生物柴油总成本的6 0 7 0 ，因此原材料的选择十分重要【4 8 1 。 由于部分植物油脂与主要粮食作物争地，产量不高；动物油脂尚不能满足人类食用需要。 长期生产生物柴油不切实际，并且价格偏高：廉价的废弃油脂来源不稳定且成分复杂，而利 用生物油脂制备生物柴油具有许多优点：微生物细胞增殖快，生产周期短；微生物生长所需 的原料丰富，价格便宜；能连续大规模生产，生产成本低；不受季节、气候变化的限制。 1 3 1 生物油脂原料 食品工业的废弃物，如淀粉厂的废水、糖厂的废糖蜜、乳品厂的乳清等都是产油微生物 的原料，但数量有限，成分复杂，微生物生长不好，产脂不高；甘薯、木薯、菊芋等粗放种 植的高糖植物或高淀粉类物质，也可以作为生物油脂发酵的原料，由于与主要的粮食作物争 地，发展潜力有限。有研究表明，微生物能高效利用半纤维素和纤维素水解得到的所有碳水 化合物产生油脂，和当前乙醇发酵工艺相比具有明显的原材料资源优势，对解决生物质经济 公认的世界难题之一“全糖转化利用”很有价值【4 9 1 。国外学者也曾报道产油生物转化五碳 糖为油脂的例子【5 0 】。全世界每年产农作物秸秆约1 0 0 0 2 0 0 0 亿t ，我国每年达7 亿t 以上， 是生物转化生物油脂潜在而丰富的原料。 1 3 2 纤维质原料生产生物油脂关键技术 1 3 2 1 影响生物油脂发酵因素 生物油脂发酵产油大体分两个阶段，即菌体增殖期和油脂积累删5 1 】。发酵的前期为细 胞增殖期，这个时期生物要消耗培养基中丰富的碳、氮源以保持菌体旺盛的代谢和增殖过程。 当培养基中碳源充足而某些营养成分( 特别是氮源) 缺乏时，菌体细胞分裂速度锐减，代谢活 动转为以消耗碳源并合成和积累油脂为主，这个时期称为油脂积累期。在油脂积累期，生物 基本上不再进行细胞繁殖而是将过量的碳水化合物转化为脂类。 影响生物合成生物油脂因素有很多。首先是菌种，不同生物其合成油脂数量及油脂脂肪 酸组成均不相同。如表1 1 1 52 | 。 表1 1不同菌种在同样培养条件下的油脂含量 t a b 1 1o i lc o n t e n ta tt h es a m ec u l t u r i n gc o n d i t i o nw i t hd i f f e r e n tf u n g u s e s 8 河南农业大学硕士学位论文 纤维质糖化液生产生物油脂发酵体系研究 糖浓度和c n 对油脂积累影响较大。一般情况下，培养基中含氮量越高，则细胞中蛋 白质含量越高；且氮含量越高，油脂积累量越高【5 3 。5 4 1 。不同油脂积累菌种最佳c n 比不同， 在实际生产中要根据不同产油菌株，合理调节好菌体细胞增殖期和油脂积累期的培养基中 c n 比，以获取理想真菌油脂。一般来说，培养初期供给大量氮源使生物迅速增殖，以获取 大量菌体细胞，后期改为含糖量多的培养条件以使油脂积累，这样可从蛋白质合成初期百分 之几油脂含量提高到后期百分之几十油脂含量。刘淑君【55 】等研究发现，c n 比为6 l ：l 时， 油脂产量和得率最高。 温度能影响生物合成生物油脂的组成、含量，生物合成油脂最适温度大多在2 5 左右。 因为生物菌体内生物合成酶在高温条件下部分失活，减弱物质合成反应速度；在不适宜温度 下，生物繁殖速度也受到影响，生物个体总数减少，从而减少油脂产量【5 6 】。 培养时间的长短对生物油脂的产量也有影响。当培养时间不足时，生物菌体总数达不到 最大量，影响了油脂产量，培养时间过长时，生物个体发生变形、自溶，使已形成的油脂进 入培养基质中而难于收集，同样影响了油脂产量。在实际生产中应根据不同菌种、同一菌种 的不同生产阶段，提供适宜于菌体细胞增殖和油脂积累的不同条件，从而获得较高的油脂生 成量。 不同的生物合成油脂的最适宜p h 值也不同，酵母为3 5 6 0 ，霉菌为中性至偏碱性，构 巢曲霉( a s p e r g i l l u sn i d u l a n s ) 在p h 值2 8 - 7 4 培养时，随着p h 值的上升，油酸含量增加。而 培养油脂酵母的培养基最初p h 值越接近中性，稳定期细胞油脂含量越高。藻类一般适宜中 性或微碱性培养。 无机盐类对各个菌种影响不同。c a r r i d o 等曾对a s p u n i o l u l a n s 进行研究，发现调整n a + k + 、m 9 2 + 、s o 。2 。、p 0 4 3 等离子含量比，使油脂含量从2 5 一2 6 提高到5 1 。磷含量对藻类 积累油脂有利【5 7 】。一般讲，在比生长最适浓度稍高的盐浓度下油脂会积累，但太高时就被 阻止。 一般来说，对于许多硅藻和裸藻，低光照强度能增加脂肪酸形成和积累；但对于绿藻类、 红藻类、紫球藻类光照强度效果则相反。 油脂是由基质的糖类还原而成，当生物产生油脂时，必须供给大量氧气，不饱和脂肪酸 的生物合成也需要大量氧气。 其他添加物对油脂积累也有影响：在培养基中添加乙醇、乙酸盐、乙醛等脂肪酸合成的 中间产物或能形成中间产物的c 2 化合物可增加油脂含量，有些菌株还要求b 族维生素。添 加e d t a 可抑制糖和盐类复合物的形成，减少同化性糖的损失，并增加油脂的含量。 1 3 2 2 纤维质糖化液中发酵抑制物 植物秸杆主要是由纤维素、半纤维素及木质素组成的，利用植物秸杆生产生化产品是当 今生物化工领域研究人员面临的主要研究任务之一【5 8 1 。为使木质纤维素产生糖，通常采用 9 河南农业大学硕士学位论文纤维质糖化液生产生物油脂发酵体系研究 理化结合的方法，在高温、高压和催化剂稀酸的作用下水解木质纤维素，在水解过程中，虽 然含有葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等可发酵的混合糖，但由于反应条件剧烈，还会含有许多对 发酵微生物有毒性作用的抑制物，称之为发酵抑制物，这些发酵抑制物浓度随水解反应条件 的剧烈程度和木质纤维素的种类不同而不同，包括木糖降解产物糠醛、纤维素脱乙酰基生成 乙酸【5 9 1 、木糖氧化生成木糖酸、木质素降解生成酚类化合物等。其主要生成物是甲酸、乙 酸、糠醛、羟甲基糠醛、糖醛酸、己糖酸等。酚类化合物能够破坏酵母菌细胞的完整性，影 响酵母菌细胞膜上的选择性通道和酶的活性中心，导致其细胞生长和糖的吸收都会减慢【6 0 】。 依据f e l i p e 等研究，乙酸浓度在l g l 时，能够改善木糖木糖醇的转化，当乙酸浓度超过3 9 l 时，对发酵就有抑制作用。另有资料表明，在培养基中只含有1 0 9 r e 的乙酸而没有其它抑制 物时，乙酸能够刺激乙醇的生产，0 1 9 l 的糠醛就会对微生物造成抑制作用【6 1 1 。 同时，水解液中富含的多种金属离子与阴离子对发酵也存在不可忽视的作用。当培养基 中的铜、镍、铬和铁离子的浓度分别不高于4 m g l 、5 m g l 、l o o m g l 和1 5 0 m g l 时，酵母 菌活性只稍微减少，当镍离子浓度在l o o m g l 时，酵母菌的产率将减少6 0 。 有研究发现低浓度的乙酸( r b ，对菌体生物量影响的主次顺序为a c b ；油脂含量的最优组合是a 2 8 3 c 2 ， 比较各因素的极差大小为r c r a r b ，对菌体生物量影响的主次顺序为c a b 。 由于两个指标单独分析出来的最优条件不一致，需要根据因素对两个指标影响的主次顺 序，综合考虑，确定出最优组合。 对于a 因素，其对生物量的影响排第一位，此时取a 2 为最好；对菌体含油率的影响排 第二位，此时取a 2 为最好，由于对两因素都处于同一水平，因此a 取a 2 。 对于b 因素，其对生物量的影响排第三位，为次要因素，此时取b l 较好；对菌体含油 率的影响排第三位，也是次要因素，此时取b 3 较好。对于生物量而言，取b l 比取b 3 提高 了2 6 4 ，对于菌体含油率降低了2 7 5 。取b 3 时，生物量比取b l 时降低了2 0 9 ，但菌 体含油率提高了3 7 8 。综合考虑，取b 3 比取b l 生物量降低了5 5 ，但菌体含油率确提 高了1 0 3 。综合考虑，b 取b 3 。 对于c 因素，同理分析，c 取c 2 。 经过分析，本试验的最优组合是a 2 8 3 c 2 。即活性炭加入量为1 0 9 l ，乙醛加入量为 4 0 0 m g l ，黄孢菌加入量为1 0 m l l 。由于a 2 8 3 c 2 组合不在试验之内，所以补加验证试验 a 2 8 3 c 2 组合。此时，菌体生物量为2 1 2 9 r l ，菌体含油率为5 0 9 ，油脂浓度为1 0 8 9 l ，糖 油转化率为1 3 5 。 3 3 本章小结 为了提高纤维质糖化液的发酵能力，通过对糖化液单一因素脱毒和正交试验，得出适合 纤维质糖化液脱毒的最优条件是：活性炭加入量为1 0 9 l ，乙醛加入量为4 0 0 m g l ，黄孢菌 加入量为1 0 m l l 。此时，菌体生物量为2 1 2 9 l ，菌体含油率为5 0 9 ，油脂浓度为1 0 8 e , l ， 糖油转化率为1 3 5 。如果产油率按投入的固形物的量计算，此时产油率是7 9 。 2 5 河南农业大学硕士学位论文 纤维质糖化液生产生物油脂发酵体系研究 4 生物油脂组分测定和性质分析 为了知道生物油脂是否适合生物柴油制备，有必要对其制备的生物柴油的组分和性质进 行测定分析。 4 1 材料和方法 4 1 1 1 发酵性丝孢酵母油脂( 本试验所抽提的油脂样品) 油脂样品1 ：培养基中加橄榄油制备的生物油脂； 油脂样品2 ：培养基中c n 为3 ：l 制备的生物油脂； 油脂样品3 ：转速为1 5 0 r m i n 制备的生物油脂； 油脂样品4 ：培养基只是纤维质水解液制备的生物油脂； 油脂样品5 ：培养基中加酵母粉+ 州h 4 ) 2 s 0 4 制备的生物油脂； 油脂样品6 ：培养基中加金属离子制备的生物油脂； 油脂样品7 ：培养基中只加4 葡糖糖制备的生物油脂。 4 1 2 方法 4 1 2 1 生物柴油的制备方法【7 3 】 称3 滴原料油与5 0 m l 容量瓶中，加入3 m l 乙醚正己烷( 2 + 1 ) 混合溶剂；摇动，使油样全 部溶解；加入4 m l 甲醇，3 m l l m o l l 的k o h c h 3 0 h 溶液，摇匀；在4 0 ( 2 水浴中放置2 5 m i n ， 取出，加蒸馏水至刻度；静止分层，取上清液，用无水硫酸钠干燥。 4 1 2 2 生物油脂酸价测定【7 4 1 油脂的酸度( 值) 是指中和单位质量油脂中的酸性物质所需碱的量。柴油的酸度对发动机 的工作状况影响很大，酸度( 值) 大的柴油会使发动机内积炭增加，造成活塞磨损，使喷嘴结 焦，影响雾化和燃烧性能；还会引起柴油的乳化现象。酸度和酸值是衡量油品腐蚀性和使用 性能的重要依据。脂肪酸甲酯的酸价值在0 5 左右，远低于优质柴油的酸价值5 ，生物柴油酸 价值为3 以内。 称取均匀试样3 5 9 注入锥形瓶中，加入乙醚乙醇( 2 ：1 ) 混合溶液5 0 m l ，摇动使试样溶 解，再加三滴酚酞指示剂，用0 i m o l l n a o h 滴定至出现微红色在3 0 s 内不消失，记下消耗的 碱液毫升数。 2 6 河南农业大学硕士学位论文纤维质糖化液生产生物油脂发酵体系研究 酸价( m g k o h g 油) = v n 5 6 1 w ( v - 滴定消耗的碱液毫升数，n l l ；n a o h 溶液浓度；w - 试样重量，g ；5 6 1 一k o h 毫克当量) 4 1 2 3 生物油脂碘值测定【7 4 1 油脂的碘值为每1 0 0 9 油脂吸收碘的克数。碘值的高低反映油脂的不饱和程度，碘值越 高则不饱和程度越大。通过碘值的测定，可以计算出油脂中混合脂肪酸的平均双键数，而不 饱和键的多少又与生物柴油的燃烧性能、运动黏度、冷滤点等有关，因此碘值可以在一定条 件下判断生物柴油的性质。然而，低不饱和度的生物柴油，其碘值低，十六烷值高，但低温 性能差，而高不饱和度的生物柴油，则碘值高，十六烷值低，但低温性能优异。这样，碘值、 十六烷值和低温性能就存在相互矛盾的关系。生物柴油碘值一般在9 0 1 3 0 之间。 称取油脂样品0 4 0 5 9 ，加入5 0 0 m l 碘量瓶中，加入9 5 乙醇溶液1 0 m l ，精确加入 0 2 m o l l 碘的乙醇溶液2 5 m l ，加蒸馏水2 0 0 m l ，盖紧瓶塞后激烈震荡，使混合均匀并形成乳 浊液，静止5 m i n ，然后用0 1 m o l l n a 2 s 2 0 3 标准溶液滴定至淡黄色后，加l 淀粉溶液2 m l ， 继续滴定至蓝色恰好消失为终点。在同样条件下作空白实验。 碘值= ( v o v ) x c 1 2 6 9 m ( v o - 空白消耗n a 2 s 2 0 3 标准溶液体积m l ；v - 试样消耗n a 2 s 2 0 3 标准溶液体积m l ：c - n a z s 2 0 3 标准溶 液浓度m o l l ：m 油脂试样的质量g ；1 2 6 9 碘的原子量) 4 1 2 4 生物油脂过氧化值测定【7 5 】 过氧化值是指1 0 0 9 油脂，在一定条件下所能游离出k i 中碘的克数。过氧化值是油脂 中过氧化物含量多少的表征，是油脂在贮存或被利用是否发生酸败的反映。氧化稳定性是生 物柴油的重要质量参数之一。生物柴油过氧化值因原料不同，过氧化值也不同，原料为废弃 油脂的生物柴油过氧化值偏高些，一般不超过7 5 。 在装有称好试样的锥形瓶中加入1 0 m l 氯仿溶解试样，加入1 5 m l 乙酸和i m l k i 饱和溶 液，迅速盖好瓶盖，混合溶液1 m i n ，在1 5 2 5 避光静置5 r a i n ，加入约7 5 m l 蒸馏水，以0 5 淀粉溶液为指示剂，用硫代硫酸钠标准溶液滴定析出的碘。滴定过程要用力震荡。同样条 件下作空白实验。 过氧化值( m o l k g ) = 10 0 0 c ( v v o ) m ( v 用于测定的硫代硫酸钠标准溶液体积m l ；v 。用于空白的硫代硫酸钠标准溶液体积m l ；c 硫代 硫酸钠标准溶液浓度m o l l ；m 试样质量g ) 4 1 2 2 气相色谱，质谱分析条件 色谱：色谱柱t r 5 m s 毛细管柱，3 0 m o 2 5 m m 0 2 5 u r n ；载气：高纯氦气，柱流量： 河南农业大学硕士学位论文纤维质糖化液生产生物油脂发酵体系研究 1 m u m i n ；进样口：2 8 0 c ，分流比：1 0 0 ；程序升温：初温1 0 0 ( 3 ，升温速率1 5 。c m i n ， 终温2 5 0 ，保持1 0 m i n ； 质谱：离子源：e i 轰击源；电子能量：7 0 e v ；离子源温度：2 5 0 ；传输线温度：2 5 0 ；电子倍增电压：1 1 3 5 k v ；扫描质量范围：3 3 - 4 3 0 a m u ；采样速率：5 次s e c 4 1 3 仪器 美国热电公司t r a n c eg c ，u l t r a ，d s qi i 型气质连用仪；x c a i b u r 工作站；n i s t 0 5 版数 据库。 4 2 结果与分析 4 2 1 油脂g c m s 分析 对生物油脂甲酯化成分进行g c m s 分析，由于七号图谱特征明显，以七号油脂为代表 进行分析，其气相色谱分析结果如图4 1 所示，适合生产生物柴油的c 1 6 一c 1 8 质谱分析结果 如图4 2 ，7 号生物油脂组分分析如表4 1 。其余生物油脂气相色谱分析如图4 3 。 024681 01 21 41 61 82 02 22 42 6 t i m e ( r a i n ) 图4 1七号生物油脂气相色谱分析 f i g 4 - lt h ec h r o m a t o g r a p h yo f n o 7b i o o i l 2 8 m s 0 7 河南农业大学硕士学位论文 纤维质糖化液生产生物油脂发酵体系研究 ，。 df k 也t l jj l o 2 5 一i - 。智 lt 扎h 1 0 8 2 _ io 嚆4 事i j l jn 一门一”i 。4 - 1 1 0 4 j ：1 i k 刖。爿h 一 ujt 卜 1 1 8 0 ：；：吡 1 2 1 3 一l j i i 爿 j h i l t ju 叱小 1 0 4 1 。增 茧d * g 一 州k 托以。卜ju -曲硼柚i柚柚 1 0 9 l 1 1 6 l 扣iil 1 i l h 一 1 1 8 6 1 川l l 止 图4 - 27 号生物油脂c 1 6 - c 1 8 质谱图 1 2 3 0 f i g 4 - 2 t h em a s ss p e c t r u mo fcl6 一c18o f n o 7b i o - o i l 河南农业大学硕士学位论文纤维质糖化液生产生物油脂发酵体系研究 从表4 1 可以看出，本实验所制备的脂肪酸甲酯中的脂肪酸主要成分是c 1 6 一c 1 8 ，其中 c 1 6 c 1 8 峰面积百分比为8 7 6 ，质量百分比为8 4 3 9 ，峰面积百分比与生物柴油转化百 分比成正比关系。而c 1 6 c 1 8 区域正是优质生物柴油的主要成分，无论峰面积百分比还是 质量百分比都充分说明了纤维质原料可以作为生产生物柴油的原料供应。 ：f 一。j 。2 0 1 号油脂仁谱图4 ” 3 1 1 呻 d 一 1 1 一一 a246o 21 o 2 0 0 3 号油脂色谱图 l5 l 。 一。 一一 一 024 “1 d2 0 0 2 号油脂色谱图 k 帅 j o 一一斗 。h 一”p 。1 0 4 号油脂色谱图 ” 河南农业大学硕士学位论文 纤维质糖化液生产生物油脂发酵体系研究 l 1 ! j o 。 。，1 。 o24a5 o1 21 5”芷 0 5 号油脂色谱图 ： _ 一 0，j a 0 6 号油脂色谱图 图4 - 3l 、2 、3 、4 、5 、6 号生物油脂色谱图 f i g 4 3 t h ec h r o m a t o