（预防兽医学专业论文）果蝇嗅觉基因的筛选、鉴定及其功能的研究.pdf

1 - ? _ 一 中文摘要 中文摘要 果蝇嗅觉基因的筛选、鉴定及其功能的研究 果蝇嗅觉系统的特点及相应技术的独特结合，使果蝇成为研究嗅觉的理想 模式系统。本文采用s g i & i g a l 4 u a s 基因筛选系统对改变果蝇嗅觉发育的基 因进行了大规模筛选，并对分离到的a k a p 2 0 0 进行了功能鉴定，旨在通过对果 蝇嗅觉系统的异位表达筛选，揭示作用于嗅觉神经的基因，为研究其功能提供 大量有意义的资源。在果蝇s 2 细胞上对通过调节基因筛选获得的n r g 基因功能 进行了研究，并对n r g 和h m k 基因相互作用的分子机制进行了探索。主要内容 包括： 1 本文首次利用s g l 81 - g a l 4 u a s 基因筛选系统对果蝇嗅觉基因进行了筛 选和鉴定：结果表明，所采用的方法可以快速、有效地分离到果蝇嗅觉相关基 因；从1 5 1 5 株果蝇p g s 品系分离到8 6 株突变体，其中4 0 株有明显表型，从 中鉴定了2 3 个基因，这些基因在o r n 强迫表达时可以损坏果蝇嗅叶的固有结 构；在筛选中发现的一些调节嗅觉图谱发育的基因可以编码新蛋白或编码参与 轴突生长和细胞骨架重塑的蛋白；为了便于研究，根据基因的功能和所编码蛋 白的特点，我们对分离到的基因进行了分类，即参与轴突引导和突触产生、调 节转录、调节细胞骨架和功能未确定或未知的基因；并通过对嗅觉感觉器的检 测发现，除了调节转录的基因外，其他基因对触觉器的数量和分布影响不明 显。 2 首次分析了a k a p 2 0 0 基因对果蝇嗅觉发育的影响，发现超量表达 a k a p 2 0 0 可以使嗅小球发生融合，然而缺失a k a p 2 0 0 可导致嗅小球的形态改变 或出现异常的嗅小球，而且会影响o r n 的正确定位过程。 3 构建了果蝇n r g 基因细胞内片段真核表达载体：根据n r g 脚基因的d n a 序列设计合成了一对特异性引物，扩增出了含有整个n r g t 即基因细胞内片段的 序列，通过序列鉴定后，应用w a 克隆和亚克隆成功地构建了s 2 细胞表达载体 p r m h a 3 一n r 9 7 眈c 仃，为研究n r g 。基因细胞内片段功能打下了基础。 4 利用果蝇s 2 细胞对n r g 蛋白的特性进行了研究：应用阳性脂质体转染 法，将不同的n r g 蛋白形式转染到果蝇s 2 细胞并成功地获得了表达，优化的转 周伟光四川农业大学博士论文2 0 0 6 年6 月 染条件为d n a 和脂质体的比例为2 ：1 5 ( 1 a g “1 ) ，转染时间3 6 h ，0 7 m m c u s 0 4 诱导2 0 h ，在优化的条件下最高转染效率可以达到2 0 ；细胞集合和定 量分析试验显示，n r g i 册和n r g a p l 表达可以快速诱导细胞集合反应而n r g 卯 c d 的表达不参与细胞的吸附反应；n r g 脚和 ，r 9 6 的细胞集合在前2 h 内最明显 并与对照和n r g i ”- c d 的差异极显著( p o 0 5 ) 。 关键词：果蝇嗅觉基因筛选嗅觉图谱s 2 细胞d s r n a i i i 1 - ， f i _ 1 f _ a b s t r a e t a b s t r a c t as c r e e nf o rg e n e sa l t e r i n gt h eo l f a c t o r ym a pi nd r o s o p h i l a a n ds t u d i e so nt h e i rf u n c t i o n s p h d c a n d i d a t e ：z h o uw e i g u a n g d i r e c t e db y ：p r o f e s s o rc h e n ga n c h u n p r o f e s s o rw a n gm m g s h u d r h u e yh i n g s i c h u a na g r i c u l t u r a lu m v e r s t t y ，s t c h u a n , y a a r t , 6 2 5 0 1 4 t h ef r u i tf l yd r o s o p h d am e l a n o g a s t e ri sa na t t r a c t i v em o d e ls y s t e mf o rs t u d y i n g o l f a c n o n , d u ot ot h eu n i q u ec o m b i n a t i o no ft h eo r g a n i s m sf e a t u r e sa n dt e c h n i q u e s a v a i l a b l ef o ru s ew i t hd r o s o p h i l ai no r d e rt or e v e a lg e n e se f f e c to nd r o s o p h d ao l f a c t o r y n e r v es y s t e ma n dt op r o v i d es i g n i f i c a n tr e s o u r c e sf o rs t u d y i n gt 1 1 e i rf u n c t a o n s w e i n i t i a t e dag e n e t i cs c r e e nf o rg e n e sa l t e n n gt h eo l f a c t o r ym a pi nd r o s o p h d ab ym e a n so f s g l 8 1 一g a l 4 u a ss y s t e m ，a n dc h a r a c t e r i z e da k a p 2 0 0g e n e , i s o l a t e di n t h i ss t u d y w e a n a l y z e dn r gg e n ei s o l a t e db yam o & f i e rs c l e e ni ns 2d r o s o p h d ac e l la n di n v e s t i g a t e d t h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fi n t e r a c t i o nn r gw i t hl t m kt h em a i nc o n t e x t sa r eb r i e f l y d e s e n b e db e l o w 1 w el m t t a t e dag e n e t i cs c r e e nf o rd r o s o p h d ao l f a c t o r yg e n e sb ym e a n so fs g l 8 ，一 g a l 4 u a ss y s t e m ：t h er e s u l tv a l i d a t e so u rs c r e e na sa nm p l d ，e f f e c t i v ea p p r o a c hf o r r e c o v e n n gg e n e sc o n t r o l l i n gg l o m e r u l a rm a pp a t t e r n i n g ；f r o mam l s e x p r e s s l o ns c r e e n o f1 , 5 1 5p g s l i n e s ，w ei d e n t i f i e d2 3g e n e st h a t ，w h e nf o r e l b l ye x p r e s s e di nt h e o l f a c t o r yr e c e p t o rn e u r o n s ，d i s r u p t e dt h es t e r e o t y p e da n a t o m yo ft h ed r o s o p h i l a a n t e n n a ll o b e s ；t h e s eg e n e s ，w h i c hh a v en o tb e e ns h o w np r e v i o u s l yt oc o n t r o l o l f a c t o r ym a pd e v e l o p m e n t ，e n c o d en o v e lp r o t e m sa sw e l la sp r o t e i n sw i t hk n o w n r o l e si na x o n a lo u t g r o w t ha n dc y t o s k e l e t a lr e m o d e h n g t ob e g a nt ou n d e r s m n dt h e e f f e c t so f t h ep i g s e l e m e n t so nt h ed e v e l o p m e n to f t h ea l s ，w ec l a s s i f i e dt h eh n e s b yt h en a t u r eo ft h eg e n e sa f f e c t e da n dt h e i ri n f l u e n c eo ne x t e r n a ls e n s d l a d e v e l o p m e n t ：g e n e si n v o l v e di na x o ng u i d a n c ea n ds y u a p t o g e n e s l s ，g e n e si n v o l v e d i nt r a n s c r i p t i o n ；g e n e si n v o l v e di nc y t o s k e l e t o nr e m o d e h n g ；g e n e so fu n d e f i n e d l i i t f t 1 0i 噘 周伟光四川农业大学博士论文2 0 0 6 年6 月 f o n c t l o n si na n t e n n al o b e b ye x a m m m gt h es t a t u so ft h eo l f a c t o r ys e n s d l ai nt h e p g s e x p r e s s i n ga n i m a l s ，w ef o u n dt h a tb e s i d e st h eg e n e si n v o l v e di nt r a n s c r i p t i o n ， o t h e r si s o l a t e di nt h i ss t u d yc o u l dh a r d l ya l t e rt h en u m b e ra n dd i s t r i b u t i o no ft h e o l f a c t o r ys e n s l l l a 2 w ea n a l y z e da k a p 2 0 0 ，w h i c he n c o d e sap r o t e a nk a n a s ea - b i n d i n gp r o t e m ，a n d o v e r e x p r e s s l o no f a k a p 2 0 0r e s u l t e di nf u s i o no f t h eg l o m e r u l i ，w h i l ei t sl o s sr e s u l t e d i nm i s s h a p e na n de e t o p l cg l o m e r u h ；o u rf i n d i n g sa l s om d i c a t e dt h a ta k a p 2 0 0i s n e c e s s a r yf o rt h ep r e c i s et a r g e t i n go fo l f a c t o r ya x o n sa sw e l la st h es c u l p t i n go f a x o n a la n dd e n d r i t i cp r o c e s s e sd u r i n gg l o m e r u l a rd e v e l o p m e n t 3 c o n s t r u c t i o no fe u k a r y o t t ce x p r e s s i o nv e c t o ro fc y t o p l a s m i cd o m a i no fd r o s o p h d a n r gg e n e ：ap a i ro fu m q u eo l i g o n u c l e o t i d ep r i m e r sw e r ed e s i g n e di nt e r m so fd n a s e q u e n c e so fn r g l s 。g e n ea n ds y n t h e s i z e d d n a s e q u e n c e so ft h ew h o l eo f c y t o p l a s m i cd o m a i no fn r g l s 。g e n ew e r ea m p h f i e db yp c r a f t e rs e q u e n c a n gw e c o n s t r u c t e de u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o ro f s 2c e l l s ，p r m h a 3 - n r g s o - c db ym e a n so f t ac l o n i n ga n ds u b c l o n i n gf o rs t u d y i n gt h ef u n c t i o n so fc y t o p l a s m i cd o m a i no f n r g i 卯g e n e 4 c h a r a c t e r i z a t i o no f n r gp r o t e i ni ns 2c e l l s ：t h ed i f f e r e n tp r o t e i nf o r m so f d r o s o p h d a n r gw e r et r a n s f e c t e du s i n gc a t i o n i cl i p o s o m ea n de x p r e s s e de f f i c t e n t l yi ns 2c e l l s t h eo p t a m m e dc o n d i t i o n sw e r e ：t r a n s f e c t e df o r3 6 h ，m d u c e df o r2 0 hw a t ho 7 m m c u s 0 4a n dt h er a t i oo fd n aa n dl i p o s o m ew a s2 ：1 5 ( i t g m ) ，a n dt h em a x a m a l t r a n s f e e t i o ne f f i c i e n c yc a l la t t a m2 0 ma b o v ec o n d l n o n s t h ee x p c n m e n to fc e l l s a g g r e g a t i o na n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h ec e l l sa g g r e g a t i o nw a sm p t d l y i n d u c e db yn r g ma n dn r g g e t , w h i l en r 于书c dw a sn o ti n v o l v e di nt h ec e l l s z d h e s m n n r g 加a n dn r g a t 1 i n d u c e dc e l l sa g g r e g a t i o nw e r ed i s t i n c t w ei nf i r s t2 h , a n d h a ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p 00 5 ) k e yw o r d s ：d r o s o p h d ao l f a c t o r ym a pg e n e t ms c r e e n s 2c e l ld s r n a x v ，i l 矿 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得 的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它 教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 妙( 勺玛拥 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 导师签名 j 、 j 前 言 前言 真核生物学的许多问题可以利用单细胞生物或是组织培养细胞进行研究。然 而更多的问题是这些简单系统目前无法解决的。例如，细胞与细胞闻的相互作用， 胚胎的形态发生与器官的发育及如何发挥功能等等。果蝇由于其介于哺乳动物与低 等生物之间的复杂程度以及1 0 0 年来积累起来的成熟研究背景，非常适于研究这些 问题，也成为研究后生生物的最优秀的模式生物之一。 上世纪初摩尔根就利用果蝇研究染色体的遗传理论。他发现在实验室里果蝇 容易饲养。而且价格便宜，只需l o 天就可以产生大量的子代他很快又发现果蝇 有若干其他优点，例如在雄性果蝇里无减数重组，只有4 对染色体，而且在幼虫唾 腺里可以直接观察到巨型多线染色体。果蝇的外部结构，如刚毛、翅脉以及复眼提 供了有价值的外观特征。突变可以影响果蝇固有的这些特征，而且在立体显微镜下 很容易观察到所产生的突变体表型。通过研究惊奇地发现脊椎动物和果蝇的发育过 程有许多相似的地方。目前果蝇基因组测序已全部完成【”，包含约1 5 0 0 0 个基因并 显示和哺乳动物的同源性高达6 l ，生命活动和基因的高度保守性使果蝇非常适 于作为研究人类疾病的动物模型。在已知的2 8 7 个人类疾病基因中1 9 7 个可以在果 蝇中找到同沥物，即使它们在果蝇上不能产生十分相似的疗状。目前研究人员正在 利用果蝇对各种人类疾病过程进行研究，已有相当数量的果蝇基因已破证明是人类 源基因或肿瘤抑制基因的同源基因。例如，肿瘤抑制基因p 5 3 的果蝇同源基因 d m p 5 3 可以诱导在细胞凋亡过程中起关键作用的r e a p e r 基因的表达，这使人们对 p 5 3 诱导细胞凋亡的分子机理有了更深入的了解1 2 3 】。果蝇系统中已经或正在建立 的疾病模型有肿瘤发生，学习与记忆，衰老，缺氧反应卯，酒精代谢卯， a l z h e l m e r s 和p a r k a n s o n s 病。瑚1 。因此有充分的理由利用果蝇强大的遗传学去研 究果蝇和人类共同的基础生物学问题。 果蝇嗅觉系统的特点及相应技术的独特结合，使其成为研究嗅觉的理想模式 系统。果蝇对多种气味有极强的敏感性，而且对气味的行为反应和嗅觉系统的组织 结构都非常类似脊椎动物91 0 川。果蝇嗅觉器官的构造相对简单，相比脊椎动物 有上百万个神经元，果蝇只有1 2 0 0 左右个神经元，所以人们希望最终阐明该系统 2 周伟光 四川农业大学博士论文2 0 0 6 年6 月 的作用原理，为研究人类的嗅觉提供有意义的参考。用果蝇作为模型动物来破译嗅 觉系统功能的主要优势在于其行为和生理试验的实用性们。用电生理学方法在体 内测定o r n s 的活动给我们提供了一个途径一可以直接估测对嗅觉刺激的神经元反 应，鉴别呈现在嗅觉器官中的神经元种类，进一步了解o r n s 是怎样编码不同气味 的。行为试验让我们可以量化嗅觉信号的转换和加工处理。 虽然对许多突变体的研究提高了对嗅觉发育的知识，但应用果蝇的真正优点 在于能够进行一个大规模基因筛选可能性。我们利用改进的g a i a u a s 系统对 3 9 9 6 p g s 系收集进行了果蝇嗅觉系统基因的鉴定，并通过对分离到的a k a p 2 0 0 的 进一步研究证明了利用超量表达法可以快速分离、鉴定调控果蝇嗅觉图谱发育的新 分子。本研究旨在通过对果蝇嗅觉系统的超量和异位表达筛选，揭示作用于嗅觉神 经的基因，为研究果蝇嗅觉神经基因的功能提供大量有意义的资源。 本文又通过体外试验对参与嗅觉发育的n r g 和l i m k 基因进行了初步研究，并 对n r g 和h m k 的相互作用的分子机制进行了探索。 第一章果蝇嗅觉系统研究概况文献综述 第一部分文献综述 第一章果蝇嗅觉系统研究概况 1 嗅觉模式系统 生物体的嗅觉可以探查其周围环境的化学成分。那么动物如何成功地鉴别食 物、捕食者以及配偶很大程度上依赖于它们能否探测大量气味的能力及从这些气味 中能区分食物等的气味。嗅觉刺激的性质和强度以及它们的空间和时间上的分布信 息以动作电位的形式编码于嗅觉感受器神经元( o l f a c t o r y r e c e p t o r n e u r o n s ，o r n s ) ， 而且这些信息直接被传送到中枢神经系统( c e n t r a ln d v o u ss y s t e m ，c n s ) 的嗅觉区 域进行加工处理。o r n s 因气味的特异性、敏感性及反应动力不同而改变，而且这些 o r n s 是外周嗅觉编码的重要组元。 摩尔根实验室的开拓性工作揭示了果蝇作为一个模式系统有许多优点： ( 1 ) 生命周期短。在短时间内可完成跨越几个世代的观察研究。 ( 2 ) 果蝇基因组较小仅1 8 0 m b ，只有4 对染色体，而且通过人工诱导可使其 染色体发生突变。 ( 3 ) 易于观察由单一基因引起的非致死性突变表型。 ( 4 ) 可以产生能够保存致死突变的平衡系。 ( 5 ) 饲养简单，经济，在一个培养箱内可饲养上千个品系。 这些优点以及个世纪以来科学家们不懈努力，使果蝇对遗传学的发展作出 了巨大贡献。遗传的染色体理论，染色体突变，基因的连锁与变换，等位基因的相 互作用方式等知识都是最先通过对果蝇的研究发现的。 自从穆勒在摩尔根实验室第一次进行果蝇遗传筛选到果蝇全基因组测序，果 蝇作为模式生物，广泛应用于发育、生态、生化、进化和行为的研究。由于果蝇本 身嗅觉系统的特点及相应技术的独特结合，使其成为研究嗅觉的理想模式系统。果 蝇对多种气味有极强的敏感性，而且对气味的行为反应和嗅觉系统的组织结构都非 常类似脊椎动物。果蝇嗅觉器官的构造相对简单，相比脊椎动物有上百万个神经 元，果蝇只有1 2 0 0 左右个神经元，所以人们希望最终阐明该系统的作用原理，为 ti|i 4 周伟光四川农业大学博士论文2 0 0 6 年6 月 研究人类的嗅觉提供有价值的资料。在昆虫和脊椎动物中，外周的o r n s 传递轴突 投射到c n s ，并且突触在嗅小球中与第二个嗅觉神经元结合n 。 用果蝇作为模型动物来破译嗅觉系统的功能的主要优势在于其行为和生理试 验的实用性。用电生理学方法在体内测定o r n s 的活动给我们提供了一个途径一可 以直接估测对嗅觉刺激的 十经元反应，鉴别呈现在嗅觉器官中的神经元种类，进一 步了解o r n s 是怎样编码不同气味的。行为试验让我们可以量化嗅觉信号的转换和 加工处理。除此之外，一个世纪以来，针对果蝇研发出了许多基因和分子生物学技 术，这些技术能够和果蝇嗅觉系统的解剖学、生理学和行为学研究有机地结合在一 起可以阐明嗅觉系统的发育和工作机理。 2 嗅觉系统的结构 果蝇属于节肢动物门的昆虫纲，双翅目，d r o s o p h d l d a e 科。野生型成虫体长3 一铀髓，淡黄或黄褐色。复眼红色，可成像而单眼只能感光，不能成像。口器为 舐吸式。果蝇分为雌雄两性，雌蝇腹部末端光滑而雄蝇则有黑色粒状突出物，且个 体比雌蝇小。果蝇性别决定为x y 型，x 染色体与常染色体数目之比是1 的为雌 蝇，比例是o 5 的为雄蝇。到目前为此，d r o s o p h i h d a e 科共发现有6 1 属，共3 0 2 0 一一气 三蛉幼虫 蟛暖瑟罗 图1 1 果蝇生活周期 f i g 1 1h f ec y c l eo f d r o s o p h d a 一代果蝇从胚胎，一龄、二龄、三龄幼虫、蛹 到成虫在2 5 下其生活周期只需l o 天。 蛹 第一章果蝇嗅觉系统研究概况 文献综述 种。其中1 6 7 7 种属于果蝇属，黑腹果蝇种即为我们常说的果蝇，它起源于中非现 广泛分布于温暖地区。果蝇的生活史共分四个阶段：卵、幼虫、蛹与成虫( 图 1 1 ) 。果蝇生命周期比较短，完成一世代所需时间视种类及生态环境而异。 果蝇的嗅觉系统比较简单，成年果蝇的头部有两对嗅觉器官：触须和下颚须 ( 图1 2 ) 。1 9 0 7 年，w m b a r r o w s 就知道了果蝇通过触须来探测气味。在2 0 世 纪4 0 年代b e g g 等用遗传学方法证明了触须为果蝇的嗅觉器官，但是直到1 9 9 1 年，a y e r 等用生理和行为试验证明了下颚须也有嗅觉功能。现已知道触须探测空 气中的远距离的挥发性气味而下颚须帮助发现近距离的气味。触须和下颚须都被触 觉器覆盖，每个触觉器中含有2 4 个o r n s 。气味分子被认为通过触觉器表面的 毛孔渗透到里面的淋巴中，并通过气味结合蛋白( o b p ) 在嗅觉神经元树突上与嗅 觉感受器结合 1 3 】。 由于外表形态的不同，把触须触觉器分为三类，即棒状的锥形触觉器、细长 的毛形触觉器和最小的腔锥触觉器( 图1 3 ) ，在图上可以见到触觉器的分布，如 锥形触觉器位于中边部，毛状触觉器位于前部边缘，腔锥形散布在它们中间。锥形 感觉器是由单层细胞壁构成的多孔化学感应刚毛，它又分为大，小锥形感器。在触 须的表面这些分类的触觉器以重叠的形式分布。下颚须触觉器全部属于小锥形感 器。大锥形感器包含4 个神经元，小锥形感器有2 个神经元。透射电子显微镜的研 究显示，锥形感觉器的小孔很可能联系外界环境和内部的树状淋巴】。研究人员 正在考虑用每一个触觉器的神经元数量，o r n s 的外部树突的分支形态，表皮厚度 和表皮上毛孔的厚度等作为触觉器分类的参数。例如，s h a n b h a g 等根据以上标准把 大锥形感器进一步分成三个亚型：l b ，i 、l b 1 1 2 和l b h 4 ，并推测这些亚型结构属 于不同的功能分类n 钔。每一个触觉器的体内记录揭示了果蝇嗅觉系统功能组织的 原则。 根据o r n s 对气味应答范围把果蝇触觉器又可以分为不同的功能型”5 ” 。b r u y n e 等通过对触觉器o r n s 的电生理学研究表明，锥形感器可分成1 6 个功 能种类并分布在7 种触觉器中“”：其中3 种触觉器包含大锥形感器，并和透射电 镜的结果一致。触觉器中的o r n s 按严格的配对原则结合：有独特功能的一类 周伟光四川农业大学博士论文 2 0 0 6 年6 月 o r n s 经常出现在相同的触觉器中。根据功能把下颚须上的触觉器可以分为三类， 每类包含2 个特异结合的o r n s 型。由于气味感受器( o r s ，o d o rr e c e p t o r s ) 基因 的表达的差异，不同功能型之间对气味应答范围也不同。不同功能类的触觉器分 别进入触须的几个区域。毛状触觉器有纵向的表皮嵴结构，靠近底部还包含一个横 向的内陷，该结构扩大了触觉器的外部面积，上部有气味分子通过的小缺e l 或小 孔。这些触觉器的一个亚基可以对信息素作出反应，其中至少2 个神经元对反一2 一乙烯醛和4 一甲基环已醇有反应。腔锥触觉器可以对一个气味亚基起反应，包括 毛状触觉器的2 个亚基。另外从触须出来的神经元直接投射到嗅叶，果蝇的嗅叶由 4 3 个嗅小球组成，不同触觉器的神经元投射到不同的嗅小球。从嗅叶神经元投射 到高级中心，包括参与嗅觉学习和记忆的蕈形体n 引。 图1 2 果蝇嗅觉器官的显微照片图1 3 果蝇右侧触须示意图 f i g 1 2t h em l c r o g r a p ho ff i g 1 3s c h e m a t l cr e p r e s e n t a t i o no f r i 吐t d r o s o p h d ao l f a c t o r yo r g a n s a n t e n n a eo f d r o s o p h d a a a n t e n n a e b m a x i l l a r yp a l l a s 触须包含第一、二和三节，把第三节触须 人为地分为四个区即a 为基部，b 为中部，c 为 前部和侧边的d 。 3 嗅党信号的传导 嗅觉信号转换是一个空气中的化学物质在化学感应神经元上发生变化的过 程。气味在细胞膜被探侧，推测要通过一个传递反应的蛋白质受体实现。细胞质的 变化导致细胞膜的导电性改变，推测该过程是通过关闭或开启在质膜上的特异离子 6 第章果蝇嗅觉系统研究概况 文献综述 通道完成。除了以上的共同步骤，空气中的气味物质必须是可溶的。气味分子从空 气到达嗅觉神经细胞膜的过程是一个额外和独特的嗅觉转换过程的一部分。目前人 们对嗅觉的接收和引起膜导电性改变的分子以及对发生在气味物质结合与嗅觉神经 元导电变化之间的数量和性质上不十分清楚，但是有许多科研工作者正在进行这方 面的研究。 嗅觉信号转换可通过气味物质对整个生物体，嗅觉上皮，单一受体神经元和 第二信使级联的反应来来进行检测。研究人员应用e a g ( e l e c t r o a n t e n n o g r a m ) 和 一个单位记录技术在细胞外测定了气昧反应“5 1 引。单位记录方法可以测定个体触 觉器神经元的动作电位。触觉器的不同区域对一些气味物质易反应啪_ ，而且单 个神经元对多种气味表现出敏感性d u b i n 和h a r r i s ( 1 9 9 7 ) 应用膜片钳术研究了 果蝇的气味转换和嗅觉敏感性发育的机理，并显示转换机理存在多样性，在膜片气 味混合体可以增强或减弱导电性比如。因此利用电生理学的方法阐明触觉器的工作 机制也是一种很重要的手段。 现已鉴定了许多果蝇气味感受器( d o r ) 候选基因旺3 刎。通过筛选2 0 的 基因组鉴定了1 6 个d o r 基因，它们编码大约4 0 0 个氨基酸，并含有七个跨膜区域 的蛋白。一些d o r 基因在触须和下颚须的亚型o r n s 里表达。o r n s 存在于触觉 器和延伸的树状突里，并展庖在触觉器淋巴中。在这种淋巴液中以高浓度的出现的 是未知确切功能的气味结合蛋白( o b p s ) 成员。这些蛋白在液相触觉器淋巴里可 能溶解疏水性的气味物质，并把这些气味配体提呈到受体或通过从受体上除掉配体 终结嗅觉反应跎5 矧。果蝇至少有3 0 个分泌的o b p 蛋白，而且在系统发育上它们 有很高的保守性2 72 8 2 9 。o b p s 可以在果蝇触觉器上表达，这增强了o b p s 直接 参与嗅觉的可能d 们1 9 9 8 年，k l m 等通过试验缺失l u s ho b p 的果蝇突变体首先 发现o b p s 确实参与嗅觉反应口们。缺失l u s h 突变体可以被高浓度的乙醇吸引。然 而通过对脊椎动物和线虫o r s 的研究发现，在缺失o b p s 时配体可以激活受体 。”。该现象和果蝇o b p 功能模型即气味感受器识别配体一o b p 复合物相反。 果蝇嗅觉信号是如何转换的尚不十分清楚。其他动物的嗅觉神经利用环核苷 和三磷酸次黄苷( i p 3 ) 作为第二信使口23 ”。脊椎动物和一些ce l e g a n so r n s 的 o r s 耦合到g 蛋白分别增加c a m p 和c g m p ，这导致环核苷通道闸门( c n g c ) 周伟光四川农业大学博士论文2 0 0 6 年6 月 开启。第二个信号转换的模型包括一个涉及果蝇t r p ( t r a n s i e n tr e c e p t o rp o t e n t i a l ， t r p ) 蛋白的c a 2 + 离子通道川。 尽管在果蝇里已鉴定了c a m p 和i p 3 信号通路的成分，但是在嗅觉信号转换 中还发现关键的证据支持c a m p 和i p 3 参与嗅觉转换m 3 63 刀。在果蝇，i p 3 可能 调节嗅觉信号，因为信号通路的不同突变体呈现轻微的嗅觉行为缺陷们。不过在 信号转导中，对果蝇突变体的研究又进一步提示在果蝇嗅觉中若干第二信使系统起 作用，以及关键的信号组成尚待鉴定。嗅觉适应性依赖正常的c a 2 + 水平，因为除 了在适应性上有缺陷外t r p 通道或i p 3 受体突变体有正常的嗅觉敏感性啪3 引。因 此，利用掌握的果蝇嗅觉感受器通过遗传或功能基因组鉴定下游信号成分是可能 的。 人们都想知道嗅觉信号转换是如何发生的，而且也知道了大量的嗅觉触觉器 的反应特征和嗅觉配体的知识。现在常用e a g 方法检测整个果蝇触须的电反应和 空气中的化学物质乜7 3 粥。在触须水平上用电生理学方法可以捕获功能上的信息气 味分子和测定嗅觉神经元里外部化学信号转换成相应的电信号。果蝇钠离子通道突 变体p a r a 基因对广泛的气味物质有e a g 缺陷。电生理学表型使该基因成为外围嗅 觉转换的重要组成部分啪1 。在果蝇嗅觉行为筛选中分离到的a c j 6 编码一个p o u 相同域蛋白，它可能调节果蝇嗅觉感受器( d o r ) 基因表达1 。 果蝇嗅觉提出了许多有兴趣的问题，涉及到受体一配体的相互作用，信息的 编码方式，信号的传递和加工及嗅觉系统发育，如气味特异性受体神经元是如何产 生的。为了完全了解该系统是怎样发挥功能的，必须揭示其最基本的分子机制。这 就需要我们发现大量的嗅觉突变体，通过突变体的研究了解突变体基因在嗅觉系统 中的作用及相互间的关系。 4 嗅觉突变体分析 早在1 9 2 7 年，穆勒发现离子辐射，如x 射线可以诱变果蝇基因组。随后的工 作表明x 射线适于在果蝇基因组中制造染色体缺失和重复。这一开创性的果蝇基 因组突变工作使他获得了1 9 4 6 年的诺贝尔奖。 8 第一章果蝇嗅觉系统研究概况文献综述 在鉴别出影响特定生命活动过程的突变后，研究人员可以利用正向的或叫标 准的遗传学方法对它们加以研究。在正向或较常规的遗传学方法中，人们首先描述 突变体表型，接着用经典的遗传学方法找出相关基因的存在，最后通过克隆、测序 来确定该基因d n a 和蛋白质序列。六十年代，s e y m o u rb e n z e r 开创了该方法并用 于神经系统和行为学研究。使用行为遗传学有2 个前提：一是，由一定数量的基因 来控制负责行为的组织结构；二是，可以分离鉴定的突变体在一定时间影响某一基 因并导致特殊行为的改变。该突变方法主要带来了通过分离涉及行为的突变体可以 鉴定一个基因的信心该方法已被证明在分离光转换及视觉系统发育基因的方面取 得了巨大的成功w ”。 1 9 7 8 年，r o d n g u e ss i d d i q i 初次应用行为遗传方法研究了嗅觉突变体，并用传 统的y 型迷宫分离到几个嗅觉突变体【4 2 1 。从此以后，人们描述了大量影响蛹和成 虫嗅觉行为突变体的行为模式，并应用于筛选，通过该筛选鉴定了许多涉及嗅觉信 号转换和嗅觉系统发育基因【4 3 “4 5 1 。1 9 8 9 年，w o o d a r d 等利用简单的嗅觉捕获试 验鉴定了o t a ( o l f a c t o r yt r a pa b n o r m a l ) 突变体，该方法可以测定果蝇的探查嗅觉引诱 剂和向其移动的能力1 。随后又发现o t a l 突变体的嗅觉器官对气味刺激有异常 的电生理学反应4 64 ”，并认为o r a l 是r d g b ( r e t i n a ld e g e n e r a t i o nb ) 基因的等位基 因，r d i g b 编码c a ”一结合磷脂酰肌醇转移蛋白，并参与i p 3 介导的光信号转换。 通过生化和生理学研究推测i p 3 第二信使通路在昆虫嗅觉转换中发挥功能4 鲥， 而且o t a 和o t a l 的发现为该推测提供了有力的证据。 突变体分析认为离子通道也参与嗅觉转换。a e e v e s 等在筛选嗅觉的学习与记 忆突变体时意外地分离到了s b l ( s m e l l b l i n d ) 突变体，并发现该突变体是嗅觉缺陷型 3 ，而且被l i l l y 等证明它是另外一个嗅觉基因o l m 的等位基因嘲。该两个突变 体的幼虫和成虫嗅觉行为都有缺陷。它们被证明是编码电压敏感钠离子通道基因 p a r a ( p a r a l y h e ) 的等位基因b ”。最近，另外一个嗅觉受损突变体s m l 6 0 也显示了由 p a r a 参与的离子通道方面的不足，提示有几种通路参与嗅觉信号的转换。 利用嗅觉行为遗传学方法也可以分离参与嗅觉系统发育的基因。m c k e n n a 等 应用果蝇对气味冲击的跳跃反应作为行为模式筛选到了a c i ( a b n o r m a le h c m o s e n s o r y j u m p ) 突变体”。在此次筛选中又分离到一个嗅觉神经元的亚型a c 3 6 ，也对气味 9 周伟光四川农业大学博士论文2 0 0 6 年6 月 反应有缺陷。随后发现a c j 6 编码p o u 域转录因子，并在发育期的o r n s 表达，推 测参与神经元身份的确定。迄今为止，已分离鉴定了2 0 多个影响果蝇气味反应的 突变体，其中大多数基因有待我们去进行详细的研究，揭示其在嗅觉系统中的功 能。 5 从突变体研究基因功能 在鉴别出影响特定生命活动过程的突变体后，人们可以用标准的遗传学方法 对它加以研究。例如，互补检测可以估计影响特定生命活动过程的基因数目。通过 测定突变与已知基因的交换率可以对突变基因进行遗传学定位。通过检测双重或更 多突变的表型可以推测参与该生命活动过程的基因顺序等。果蝇特有的许多基因技 术大大推动了以上这类研究。 虽然正向遗传学方法成功地应用于嗅觉突变体的研究，但是该方法还有一定的 局限性：一是，由于依赖所使用的行为模式，鉴定突变体的过程可能非常辛苦，因 此该方法很难获得一个满意的筛选，到目前为止，已完成的嗅觉筛选只集中在果蝇 基因组的一小部分；二是，由于取决于所使用的诱变剂，克隆突变基因比较困难， 实际上，在分子水平上只描述了少数通过嗅觉筛选的突变体；三是，多功能基因， 例如多基因家族成员很可能在突变分析过程中被遗漏；四是，如果在成虫阶段进行 的筛选中导致早期致死性突变，有多效功能的基因有可能被遗漏。 正向遗传学方法的局限性导致应用逆向遗传学研究果蝇嗅觉系统成为一种选 择。逆向遗传通常从一个候选基因或蛋白开始，然后通过分析推导出它的功能和表 型。常把基因在相关组织( 如，触觉器、下颚须或嗅叶) 的表达作为分离候选基因 的标准。目前，利用减数杂交或特异筛选方法分离到的触觉器和下颚须特异性 e d n a 克隆，成功地鉴定了几个基因眈4 弘耶1 。其中的一个编码核蛋白的基因， o s 9 ，在触觉器和下颚须o r n s 表达，提示o s 9 蛋白可能是嗅觉特异性转录因子， 或许调节其他嗅觉基因的表达啉1 ，但是还没有发现功能上的证据来支持以上观 点。逆向遗传学方法的一个缺点就是很难验证一个用该方法鉴定的基因的功能。 通过减数杂交鉴定的其他果蝇嗅觉基因有的编码气味结合蛋白( o b p s ， o d o r a n t - b i n d i n gp r o t e i n ) ，该蛋白也是昆虫信息素结合蛋白的同源物“跚。 1 0 第一章果蝇嗅觉系统研究概况文献综述 o b p s 分泌在嗅觉触觉器淋巴中，是含量丰富的蛋白2 6 蜊，m a i d a 等认为它们结 合和溶解疏水气味分子，并经过触觉器淋巴把它们传输到o r ns 5 8 1 。 利用增强子捕获技术也可以分离突变体。此方法利用含有报告基因和弱启动 子的p - 转座子，将构建物随机插入到基因组中。报告基因的表达依赖整合位点附 近的增强子，因此可以模拟邻近基因的空间和时间上的表达。该技术的主要优点是 可以相对容易地克隆突变体的基因。除了以上优点，p 转座子的移动经常导致邻近 区域的缺失，促进了基因功能的分析。利用该技术研究嗅觉组织表达基因，在幼虫 和成虫嗅觉器官分离到多个报告基因表达的座位( 1 0 c i ) 在第三节触觉器上表达 的一种携带t a u l a c z 报告基因的增强子捕获品系分离到了一个果蝇o b p 家族的新 成员l u s h 基因。随后不精确的p 一转座子转移导致l u s h 基因的破裂，这使我们能够 探究这个被认为是气味结合蛋白的体内功能。在l u s h 突变体观察到的特异嗅觉缺 陷首次提供了直接证据，即o b p s 是正常嗅觉行为所必需的n 们