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康小热：h o k s o k 介导的质粒稳定性研究 h o k s o k 介导的质粒稳定性研究 研究生：康小燕 导师：朱固强教授 专业：预防兽医学 中文摘要中又捅斐 基因工程菌工业化生产过程中，重组质粒不稳定性现象，一直是一个亟待解决 的既有理论意义又有实际应用价值的重要问题。重组质粒的不稳定性一般具有2 种 表现形式，一种是结构( 序列) 不稳定性，即重组质粒上某一区域的d n a 序列发生插 入、缺失、重排、修饰等现象，导致其表观生物学功能的丧失：另一种是分离( 分配) 不稳定性，是指整个重组质粒d n a 分子从受体细胞中逃逸或丢失的现象。在质粒不 稳定性的研究过程中，人们关注最多的，通常是质粒的分离不稳定性。以非抗生素 为选择压力的质粒解离后致死系统( p s k ，p o s t s e g r e g a t i o n a lk i l l i n gs y s t e m ) 是解决质 粒分离不稳定性的有效方法之一，即该系统并不直接参与质粒d n a 的复制，而是在 质粒发生不稳定分离后，杀死无质粒的子代细胞，从而在细胞传代中保持质粒稳定 的性状。来源于大肠埃希菌质粒r 1 的h o k s o k 质粒p s k 系统，编码一种毒素蛋白的 m r n a ( h o km r n a ) ，以及一段可以阻止该m r n a 表达的反义r n a ( s o kr n a ) 。其作 用机理基于“毒剂与解毒剂”的原则，即在含质粒细胞中，s o kr n a 能够迅速与h o k m r n a 结合，从而抑制了h o k m r n a 的表达；而当细胞质粒丢失后，s o k r n a 逐渐降 解，而h o k m r n a 仍留在细胞中，不断聚集并充分表达，产生的毒素蛋白杀死细胞， 因而保证了存活的细胞中均含有质粒，提高稳定性。 为了深入研究h o k s o k 基因对于维持质粒载体p a c y c l 8 4 的稳定性，本实验以低 拷贝质粒p a c y c l 8 4 为载体，将稳定性基因h o k s o k 插入到载体上的b a m hi 位点， 构建重组质粒稳定系统p a c y c l 8 4 h o k s o k ，并转化大肠杆菌d h 5 c e _ 。根据已构建的 重组质粒p a c y c l 8 4 h o k s o k 的d n a 全序列，设计特异性引物，通过长片段p c r 扩增， 获得含有h o k s o k a 2 7 4 t 的目的基因与载体p a c y c l 8 4 的d n a 序列的融合基因片段， 扬州人学硕十学何论文 并进一步构建重组质粒p a c y c l 8 4 h o k s o k ( m ) ，使之与重组质粒p a c y c l 8 4 h o k s o k 构成对照。其中，h o k s o k & 2 7 4 - 1 虽 j h o u s o k 第2 7 4 位碱基缺失，破坏- h o k s o k 基因的 可阅读框，抑制了s o k 反义r n a 的形成，从而使s o k r n a 不能有效地与h o k m r n a 结 合。 对所构建的含质粒p a c y c l 8 4 h o u s o k 的重组菌d h 5 a ，含质粒 p a c y c l 8 4 h o k s o k ( m ) 的重组菌d h 5 a ，以及含质粒p a c y c l 8 4 的工程菌，进行反 复的传代培养，以考察重组菌株的分离不稳定性及宿主细胞连续分裂时无抗生素选 择压力的添加对质粒稳定性的影响。其具体方法如下：在不含抗生素的l b 培养基中， 进行连续传代，每隔一定的世代间隔，将收获的细菌菌液适量稀释，涂布于空白l b 平板。再分别挑取单菌落1 0 0 个点种至含氯霉素的l b 平板，对氯霉素敏感的重组菌 菌落其质粒细胞已经丢失；同时挑取具有氯霉素抗性的单个菌落，采用标准碱裂解 法抽提质粒，以进一步确定质粒的存在。并将传代前后的重组质粒经s p hi 酶切鉴 定，并设置空载体p a c y c l 8 4 作对照。为了进一步检测晟。觚。足基因的引入对于宿主 细胞生长的影响，绘制两重组菌生长曲线，含质粒p a c y c l 8 4 的工程菌与重组菌平 行培养作对照。 试验结果表明，在无抗生素筛选压力下连续传代，含质粒p a c y c l8 4 h o k s o k 的重组菌d h 5 0 t 传至第1 3 5 4 弋时质粒稳定率仍是1 0 0 ：而含质粒p a c y c l 8 4 h o l ( s o k ( m ) 的重组菌d h 5 a 仅传至第1 5 代，质粒丢失率就达到9 8 ，由此说明h o k s o k 基 因能够显著提高所在质粒系统的稳定性。重组质粒p a c y c l 8 4 h o k s o k 传代前后的质 粒s p hi 酶切图谱没有发生变化，进一步的d n a 序列测定表明，插入的h o k s o k 基因 没有发生突变。重组质粒p a c y c l 8 4 h o k s o k ( m ) 传代前后的质粒s p hi 酶切结果 虽然没有发生变化，但由于其传代时间较短，因而不具有遗传学意义。生长曲线的 测定结果发现，重组菌d h 5 c t ( p a c y c l 8 4 h o k s o k ) 生长较快，与含原质粒p a c y c l 8 4 的工程菌生长曲线相似，而重组菌d h 5 a ( p a c y c l 8 4 h o k s o k ( m ) ) 则生长缓慢， 其低生长速率与该重组质粒的不稳定性密切相关。 综合以上结果表明，包含h o k s o k 稳定系统的质粒p a c y c l 8 4 h o k s o k ，其稳定 性明显高于无h o k s o k 稳定系统的质粒p a c y c l 8 4 和p a c y c l 8 4 一h o k s o k ( m ) 。在 康小燕：h o k s o k 介导的质粒稳定性研究 宿主细胞连续分裂过程中，重组质粒p a c y c l8 4 h o k s o k 具有良好的分离稳定性， 而重组质粒p a c y c l 8 4 h o k s o k ( m ) 则具有较高的分离不稳定性。质粒p a c y c l 8 4 虽表现出一定的分离不稳定性，但仍然能够在无抗生素选择压力条件下，在5 0 世 代内保持质粒的基本稳定遗传，该性能已经足够满足工业生产的需要。 总之，通过在载体p a c y c l 8 4 上成功构建一个h o k s o k 质粒平衡致死系统，使质 粒的稳定性大为提高，从而为进一步研究外源基因的稳定表达和促进基因工程菌的 生产提供有效的研究工具。 关键词：h o k s o k ；p s k ：重组质粒；质粒结构不稳定性；质粒分离不稳定性： v 扬州人学硕十学位论文 m a i n t a i n i n gp l a s m i ds t a b i l i t yb yt h eh o k s o k p o s t s e g r e g a t i o n a lk i l l i n gs y s t e m m s c a n d i d a t e ：x i a o y a nk a n g s u p e r v i s o r ：p r o f g u o q i a n gz h u a b s t r a c t p l a s m i d i n s t a b i l i t y i sa s i g n i f i c a n t c o n c e r ni nt h ei n d u s t r i a lu t i l i z a t i o no f r e c o m b i n a n tm i c r o o r g a n i s m s ，w h i c hi so fb o t ht h e o r e t i c a la n dp r a c t i c a li m p o r t a n c e t w o t y p e so fp l a s m i di n s t a b i l i t y o c c u rf r e q u e n t l y , b o t hi ns e g r e g a t i o n a la n ds t r u c t u r a l i n s t a b i l i t y s e g r e g a t i o n a li n s t a b i l i t yw a sd e f i n e da st h el o s so ft h ee n t i r ep l a s m i df r o mt h e c e l l sd u et od e f e c t i v e p a r t i t i o n i n g ，w h i l es t r u c t u r a li n s t a b i l i t y w a si n v o l v e di n t h e r e a r r a n g e m e n t ，l o s s ，o ri n s e i r t i o no fp l a s m i dd n as e q u e n c e s ，a s s o c i a t e dt y p i c a l l yw i t h t r a n s p o s i t i o no rr e c o m b i n a t i o n c u r r e n ts t u d i e so hp l a s m i ds t a b i l i t yh a v eb e e na p p r o a c h e d g e n e t i c a l l y , f o c u s i n go ns e g r e g a t i o n a li n s t a b i l i t y , w h i c hi sc o n c e m e da sam a j o rp r o b l e m c h a r a c t e r i z e d b y n o n a n t i b i o t i cs e l e c t i v e p r e s s u r e ，p l a s m i d e n c o d e d p o s t s e g r e g a t i o n a lk i l l i n gs y s t e m ( p s k ) i se s t a b l i s h e da s am o r ee f f i c i e n tw a yt o m a i n t a i np l a s m i ds t a b i l i t y t h ep s ks y s t e md o e sn o tp a r t i c i p a t ed i r e c t l yi n d i s t r i b u t i n g p l a s m i d st od i v i d i n gc e l l s ，o n l yk i l l i n gp l a s m i d f r e ec e l l sb yt h eh o kg e n ep r o d u c t sa f t e r d i s t r i b u t i o n ，w h i c ht h u sk e e p sp l a s m i d i cg e n e t i cc h a r a c t e r i s t i c s p a s s i n gf r o mo n e g e n e r a t i o nt oa n o t h e rg e n e r a t i o n t h eh o k s o kk i l l e rl o c u so fe c o l ip l a s m i dr 1h a st w o g e n e s ：h o k ( h o s tk i l l i n g ) e n c o d e sah i g h l yt o x i ct r a n s m e m b r a n ep r o t e i n ，d e n o t e dh o k m r n a ；s o k ( s u p p r e s s i o no fk i l l i n g ) s p e c i f i e sas m a l lc i s e n c o d e da n t i s e n s er n at h a t b l o c k st r a n s l a t i o no fh o k ，d e n o t e ds o kr n a a c c o r d i n gt ot h ep r i n c i p l eo fd o t e a n t i d o t e ， t h em e c h a n i s mo fh o k s o kl o c u sc a nb e i n t e r p r e t e d a sf o l l o w s ：i nc e l l sw i t ha h o k s o k c a r r y i n gp l a s m i d ( w h i c hp r o d u c e ss o kr n a ) ，s o kr n ab i n d st oh o km r n a 康小燕：h o k j s o k 介导的质粒稳定性研究 v r a p i d l ya n dr e p r e s s e si t st r a n s l a t i o n ；w h i l ei np l a s m i d - f r e ec e l l s ，t h es o kr n ap o o li s d e p l e t e do w i n gt or a p i dd e c a yo ft h ea n t i s e n s er n a ，t h em a t u r ea n dt r a n s l a t a b l ef o r mo f h o km r n aa c c u m u l a t e s ，a n dh o kp r o t e i ns y n t h e s i sr e s u l t si nk i l l i n go ft h ep l a s m i d f r e e c e l l s s ot h es u r v i v e dc e l l sa l lc o n t a i nh o k s o kl o c u s ，w h i c ha sar e s u l ti m p r o v e sp l a s m i d s t a b i l i t y i no r d e rt od of u r t h e rr e s e a r c ho nh o wh o k s o ks t a b i l i z e sp l a s m i d sb yap h e n o t y p eo f p o s t s e g r e g a t i o n a lk i l l i n g ，t h eh o t c s o kg e n ew a si n s e r t e di n t o t h el o wc o p yp l a s m i d p a c y c 18 4w i t hi t sb a m his i t e t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp a c y c18 4 - h o k s o kw a s c o n s t r u c t e d a n dt h e nt r a n s f o r m e di n t oe c o l id h 5 a a c c o r d i n gt ot h er e c o m b i n a n t p l a s m i dd n as e q u e n c eo fp a c y c 18 4 一h o k s o k , t h es p e c i a lp r i m e r sw e r ed e s i g n e dt od o l o n gp c r ，i no r d e rt oc o m b i n eh o k s o k a2 7 4 ta n dt h ep l a s m i dd n as e q u e n c eo f p a c y c 18 4 t h e nt h el o n gp c r p r o d u c t ss e l f - l i g a t e dt od e v e l o pa n o t h e rr e c o m b i n a n t p l a s m i dp a c y c 18 4 一h o k s o k ( m ) ，u s e da sac o n t r o lf o rp a c y c18 4 一h o k s o k a m o n g o t h e rt h i n g s ，h o k s o k 2 7 4 tw a so b t a i n e dw i t ho n etd e l e t i o ni nt h es e q u e n c eo f 2 7 4 t h s i t e ，w h i c hd a m a g e dt h es t r u c t u r eo fh o k s o k so r f ( o p e nr e a d i n gf r a m e ) a sar e s u l t ，t h e t r a n s c r i p t i o no fs o ka n t i s e n s er n aw a sd e p r e s s e d ，l e a d i n gt os o kr n a sd e f l e c t i v e u n b i n d i n gt oh o km r n a t od e t e r m i n et h es e g r e g a t i o n a li n s t a b i l i t i e so ft h ec o n s t r u c t e d p l a s m i d s ，t h et w o r e c o m b i n a n tec o l id h 5 as t r a i n sw i t h p l a s m i d s o f p a c y c 18 4 h o l c s o ka n d p a c y c 18 4 - h o k s o k ( m ) ，a n dt h ec o n t r o ls t r a i nw i t hp a c y c 18 4 ，w e r er e s p e c t i v e l y c u l t u r e du n d e rt h en o n - a n t i b i o t i cc o n d i t i o n ，t h u st e s t i f y i n gt h er e l a t i o n sb e t w e e np l a s m i d l o s sa n dn oa n t i b i o t i c sa d d i c t i o nd u r i n gc o n t i n u o u sd i v i s i o no fh o s tc e l l s t h em e t h o d w a sd e d i c a t e da sf o l l o w s ：t h er e c o m b i n a n tb a c t e r i a ls t r a i n sw e r ec u l t i v a t e dc o n t i n u o u s l y i n l u r i a b e r t a n i ( l b ) m e d i u mw i t h o u tc h l o r a m p h e n i c o l ，a n da tr e g u l a ri n t e r v a l s ， a p p r o p r i a t e l yd i l u t e ds a m p l e sw e r es p r e a do nl ba g a rp l a t e s o n eh u n d r e dc o l o n i e sw e r e t r a n s f e r r e df r o mt h el ba g a rp l a t e st ol bp l a t e sc o n t a i n i n g3 4 u g m lc h l o r a m p h e n i c 0 1 t h o s es h o w i n gc h l o r a m p h e n i c o ls e n s i t i v i t yw e r ea s s u m e dt ob e p l a s m i d f r e e c e i l s v l 扬州人学硕十学何论文 s i m u l t a n e o u s l y ，s i n g l ec o l o n i e sw i t hr e s i s t a n c et oc h l o r a m p h e n i c o lw a su s e dt oe x t r a c t p l a s m i dd n ab ys t a n d a r da l k a l i n el y s i s ，t od e t e r m i n et h ep r e s e n c eo ft h ep l a s m i d s m o r e o v e r , t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d se x t r a c t e df r o mb o t ht h eo r i g i n a ls t r a i n sa n dt h e 13 5 mo r15 m ( a st h er e c o m b i n a n ts t r a i nc o n t a i n i n gp a c y c18 4 h o k s o k ( m ) w a sv e r y u n s t a b l e ，o n l yg r o w nf o r 15g e n e r a t i o n s ) g e n e r a t i o ns t r a i n sw e r ed i g e s t e db ys p hi ， a d d i t i o n a l l yw i t ht h ep l a s m i dp a c y c 18 4a sac o n t r 0 1 c o n s i d e r i n gw h e t h e rt h eh o k s o k p s ks y s t e me f f e c t sh o s tc e l lg r o w t h ，w ec h a r t e dt h eg r o w t hc u r v e so ft w or e c o m b i n a n t s t r a i n sa sw e l la st h eg e n e t i ce n g i n e e r i n gb a c t e r i ac o n t a i n i n gp a c y c18 4 t h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t s s h o w e dt h a t ，u n d e rt h en o n a n t i b i o t i cc o n d i t i o n ，t h e r e c o m b i n a n te c o l id h 5 aw i t hp l a s m i dp a c y c18 4 一h o k s o kw e r es t a b l ym a i n t a i n e d13 5 g e n e r a t i o n s ；b u tt h er e c o m b i n a n tec o l id h 5 aw i t hp l a s m i dp a c y c 18 4 一h o k s o k ( m ) w a sv e r yu n s t a b l e ，o n l yg r o w nf o r15g e n e r a t i o n sw i t h9 8 o fp l a s m i dl o s s h e n c e ， h o k s o kp s ks y s t e mc a ne n h a n c et h ep l a s m i ds t a b i l i t yo fp a c y c 18 4o b v i o u s l y f u r t h e r r e s t r i c t i o na n d s e q u e n c i n ga n a l y s i si d e n t i f i e d t h e c o n s i s t e n c ya n dc o r r e c t n e s s o f p a c y c 18 4 一h o k s o kd n as e q u e n c ef r o mb o t ht h e o r i g i n a l s t r a i n sa n dt h e135 t h g e n e r a t i o ns t r a i n s h o w e v e r , t h es i m i l a rr e s u l t sa l s oh a p p e n e dt ot h er e c o m b i n a n t p l a s m i dp a c y c 18 4 - h o k s o k ( m ) ，i th a dl i t t l eg e n e t i ci m p o r t a n c eb e c a u s eo ft h es h o r t g e n e r a t i o n sm a i n t a i n i n gb yi t sh o s ts t r a i n c o m p a r e dw i t ht h eg e n e t i ce n g i n e e r i n g b a c t e r i ac o n t a i n i n gp a c y c18 4 ，d h 5 a ( p a c y c18 4 h o k s o k ( m ) ) g r e ws l o w l yd u r i n ga l l s t a g e so fg r o w t h ，w h i c hs u g g e s t e dt h a ti t sl o wg r o w t hr a t ew a sc l o s e l yc o r r e l a t e dw i t h p l a s m i di n s t a b i l i t y w h e r e a sd h 5 a ( p a c y c l8 4 h o k s o k ) g r e wm o r er a p i d l y , i t sg r o w t h c u r v ew a ss i m i l a rt ot h ec o n t r o lb a c t e r i a s s u b s e q u e n t l y , w ec a m et oac o n c l u s i o nt h a t ，t h es t a b i l i t yo fh o k s o k c a r r y i n g p l a s m i dp a c y c 18 4 一h o k s o kw a so b v i o u s l yb e t t e rt h a nh o k s o k f r e e p l a s m i d s o f p a c y c 18 4a n dp a c y c18 4 - h o k s o k w i t h i nt h ec o n t i n u o u sd i v i s i o no fh o s tc e l l s ，t h e r e c o m b i n a n tp l a s m i dp a c y c18 4 - h o k s o kh a sb e e ne v o l v e dw i t hg o o ds e g r e g a t i o n a l s t a b i l i t y , w h e r e a s t h er e c o m b i n a n t p l a s m i dp a c y c 18 4 一h o k s o k ( m ) h a s h i g h 康小燕：h o u s o k 介导的质粒稳定性研究 v s e g r e g a t i o n a li n s t a b i l i t y i n t r i g u i n g l y ，u n d e rt h ed e p r e s s e dc o n d i t i o nw i t h o u ta n t i b i o t i c s ， t h eg e n e t i ce n g i n e e r i n gb a c t e r i ac a r r y i n gp a c y ci8 4c a ng r o wf o ra b o u t5 0g e n e r a t i o n s w i t h o u tp l a s m i dl o s s a l t h o u g hi tp o s s e sac e r t a i ns e g r e g a t i o n a li n s t a b i l i t y , i ts t i l la g r e e s w i t ht h en e e d s o fi n d u s t r i a lp r o d u c t i o n i naw o r d ，w i t hh o k s o kp s ks y s t e mi n t r o d u c i n gi n t ot h ep l a s m i dp a c y c18 4 ，i t s p l a s m i ds t a b i l i t yi sg r e a t l ye n h a n c e d ，w h i c ht h u sp r o v i d e sam o r es a f ea n de f f i c i e n t s t r a t e g yt oi m p r o v et h et r a n s l a t i o no fe x o g e n o u sg e n e sa n dg e n e t i ce n g i n e e r i n g k e yw o r d s ：h o k s o k ；p s k ；r e c o m b i n a n tp l a s m i d ；s t r u c t u r a li n s t a b i l i t y ；s e g r e g a t i o n a l i n s t a b i l i t y ； 康小燕：h o k s o k 介导的质粒稳定性研究 p c r d n t p s 翻 s a p a m p b p x - g a l r p m m m m o l l ( m ) 叫 h m i n s e c o l i o d m l k b f d a c m t e t u g m l d g t p 符号说明 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e t o x i n a n t i t o x i ns y s t e m s h r i m pa l k a l i n ep h o s p h a t a s e a m p i c i l l i n 聚合酶链式反应 三磷酸脱氧核苷 毒素抗毒素系统 虾碱性磷酸酶 氨苄青霉素 b a s ep a i r碱基对 5 - b r o m o 一4 一c h l o r o 一3 - i n d o l y l c 【- d g a l a c t o s i d e5 溴4 氯3 吲哚a d r o t a t i o np e rm i n u t e m i l l i m e t e r m o l e l i t e r m i c r o l i t e r h o u r m i n u t e s e c o n d e s c h e r i c h i ac o l i o p t i c a ld e n s i t y m i l l i l i t e r k i l o b a s e f o o da n dd r u ga d m i n i s t r a t i o n c h l o r a m p h e n i c o l t e t r a c y c l i n e m i c r o g r a m m i l l i l i t e r g u a n o s i n et r i p h o s p h a t e 半乳糖苷 转吩 毫米 摩尔升 微升 小时 分 秒 大肠埃希氏杆菌 光密度 毫升 千碱基对 食品及药物管理局 氯霉素 四环素 微克毫升 三磷酸鸟( 嘌呤核) 苷 5 8扬州人学硕十学位论文 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研冗 成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研 究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声 明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：窿小燕 签字日期：1 年6 月i 箩日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。本 人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信 息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。 学位论文作者签名： 鼬、恶 签字日期：k ( 7 年6 月心日 导师签名： 毖、鸺 签字日期：7 伊夕年彩月j 日 2扬州人! 学硕十学位论文 文献综述 h o k s o k 解离后致死系统研究进展 基因工程菌工业化生产过程中，质粒载体的不稳定性，一直是一个亟待解决的 既有理论意义又有实际应用价值的重要问题。重组质粒的不稳定性一般具有2 种表 现形式，一种是结构( 序列) 不稳定性，即重组质粒上某一区域的d n a 序列发生插入、 缺失、重排、修饰等现象，导致其表观生物学功能的丧失；另一种是分离( 分配) 不 稳定性，是指整个重组质粒的d n a 分子从受体细胞中逃逸或丢失的现象0 , 2 j 。一般 情况下，质粒的结构不稳定性可以通过宿主菌株的谨慎和恰当的选用来消除。因此 在质粒不稳定性的研究过程中，人们关注最多的，通常是质粒的分离不稳定性。质 粒的分离不稳定性是质粒不稳定性的主要因素，历来受到学者们的高度重视。大量 研究表明，宿主的新陈代谢负荷( 理论上讲，外源质粒的引入，、将对宿主细胞的生 长造成一定的生理负担，从而影响质粒的分离稳定性) 、质粒的寡聚化效应以及在 缺陷性分配过程中造成的拷贝数差度等，均是产生无质粒细胞的重要因素，而不利 的环境条件、无质粒细胞的生长竞争以及外源基因的产物等则是进一步扩大质粒分 离不稳定性的重要原因【l 2 j 。在同一宿主中，不同的培养环境、细胞的不同生长状态 对质粒产生不同程度的影响。如在培养过程中的碳源和氮源限制、溶氧限制、温度、 d h 等因素都会在一定程度上加重质粒的分离不稳定性。 重组菌的稳定性受遗传及环境因素两方面的控制，可以通过基因水平的控制来 限制反应器中无质粒细胞的繁殖以提高系统中含质粒细胞的比例。通常，质粒的稳 定存在依赖于外界一定的选择压力，以抗生素作为选择压力及抗性基因作为选择标 志的质粒载体系统在体外的分子生物学研究中非常有用，但在人和动植物体内无法 实现；而且含抗药基因的质粒是导致临床抗药菌株播散的主要原因之一p 】：同时抗 生素的使用是基因工程产品制备过程中造成潜在痕量过敏现象发生的重要来源，因 此，上述原因成为以药物抗性基因作为选择标志和选择压力的质粒载体系统在基因 工程产品实际生产应用中的桎梏。 康小燕：h o k s o k 介导的质粒稳定性研究 3 染色体质粒平衡致死系统【4 】是以营养选择标志基因代替抗性基因的新型质粒 载体系统。其宿主菌通常在染色体上带有重要代谢途径的基因突变，因此突变株在 基本培养基上不能生长。只有补充相应的外源营养物质或导入携带有野生型基因序 列的互补质粒后，2 + 能使其生存。因此在无相应营养物质添加的基本培养基中，互 补质粒的导入是缺陷型宿主菌生长的必需条件。近年来以该体系为基础的减毒沙门 氏菌在原核表达外源基因方面已有不少成功实例，但由于细菌种属的限制、管家基 因的选择和缺陷株基因型等诸多因素的影响，不能得到广泛的应用。因此，一种更 为安全有效的新型质粒稳定系统质粒解离后致死系统( p s k ，p o s t s e g r e g a t i o n a l k i l l i n gs y s t e m ) 应运而型引，即在质粒发生不稳定分离后，无质粒细胞被杀死的现象。 这种质粒解离后致死系统又叫毒素抗毒素系统【6 】，主要编码一种毒素基因和相应的 抗毒素基因，抗毒素基因可以抑制毒素基因的表达，但一旦毒素基因得以表达并逐 渐积累，可以杀死丢失质粒的细胞，而含有质粒的细胞则得以稳定的遗传。目前， 以h o k s o k 基因为标志的质粒解离后致死系统研究极为广泛【7 , 8 , 9 】，其基因大小只有 0 6k b ，易于操作，只需在质粒系统中进行小范围的基因操作，宿主染色体不作任 何改变；应用范围广泛，几乎可以应用于所有的革兰氏阴性菌【l o 】：可以协同应用于 各种基因控制系统，从而加强质粒系统的稳定性，使外源基因得以稳定表达【9 l l 】， 因而是从事基因工程菌工业化生产的有效工具。 1 1 稳定性基因h o k s o k 的结构特点 质粒稳定性基因h o k s o k 来源于大肠埃希菌的质粒r 1 ，其操纵子编码一个解离 后致死系统。该系统并不直接参与质粒d n a 的复制、分裂过程，而是在子代细胞 发生分离后，通过h o k 毒性蛋白的聚集作用，杀死不含质粒的子代细胞，从而在细 胞传代中保持稳定的性状。h o k s o k 质粒稳定系统主要由三部分组成：h o k 、m o k 、s o k 。 h o k ( h o s tk i l l i n g ) 编码具有高度毒性的跨膜蛋白，从细胞内破坏细胞膜，造成膜结 构不可修复的损伤，导致细胞结构形骸样变p 圮】。m o k ( m o d u l a t i o n o fk i l l i n g ) 在基 因结构上与h o k 重叠，可以调节h o k 蛋白的翻译表达。s o k ( s u p p r e s s i o no f k i l l i n g ) 由- d , 段特定的反义r n a 顺式编码，可以阻断r o o k 蛋白的翻译表达。由于h o k 蛋 4 扬州人学硕十学位论文 白的表达依赖于r o o k 蛋白的调节作用，故s o kr n a 通过抑制m o k 蛋白的表达，从 而间接的抑n th o k 蛋白的表达 13 1 。s o k r n a 虽含有一段强启动子序列，但非常不 稳定，易降解( 其半衰期只有3 0 s ) ；而h o k m r n a 基因虽含有一段弱启动子序列， 却非常稳定( 其半衰期足有2 0 r a i n ) 1 4 1 。另外，h o km r n a 在体内主要以两种无活 性的方式存在，即h o k m r n a 1 和h o k m r n a 2 ( 图1 ) 。这两种h o k m r n a 均不 能表达蛋白，也不能与s o kr n a 有效结合，其中h o km r n a 2 是h o km r n a l 的酶 切产物。 ，h o k m r n a s _ i - = = = j _ - _ _ _ _ l - _ - i + 3 6 1 t r + - - _ l = = ：l - _ - _ _ _ _ - - _ - _ - - + 3 9 8f l - 2 _ _ _ _ = = = = ，- _ - _ _ _ _ _ _ _ _ - - - - _ - _ + 4 41f l 1 t a cr o o k h o k b i 一一s o k r n a 幽l 【1 4 lh o k s o k ) - 贡粒稳定系统的结构 f i g 1t h es t r u c t u r a le l e m e n t so ft h eh o k s