电镜标本处理.ppt

免疫染色后的标本处理,Prof.李瑞锡PH.D.复旦大学上海医学院解剖与组织胚胎学系2009.12.1,免疫电镜技术,是用电子显微镜观察免疫标记细胞和组织超微结构的技术是在免疫细胞化学技术和电镜技术的矛盾结合点上形成的新方法。,Protocolforimmunohistochemistry,免疫组织化学技术与电镜技术的矛盾点:免疫组织化学:破坏细胞膜增强抗体的穿透性,最大限度地标记抗原！电镜技术：最大限度地固定保存细胞的膜性结构，使细胞超微结构清晰美观。两者的矛盾结合点：既良好地标记了抗原又完美地保留了膜性结构,免疫电镜技术的基本流程,从动物到电镜照片组织固定、取材切片（40微米)免疫组化染色锇酸固定脱水树脂包埋聚合超薄切片电子染色电镜观察照相Photoshop处理照片论文照片版面做成,免疫染色后的标本处理,光镜,电镜,光镜电镜,振动切片机,40um,免疫染色,树脂包埋,脑（forexample),vibrating-blademicrotome切片,超薄切片60-80nm、电子染色（醋酸铀/枸橼酸铅）,电镜观察照相,锇酸固定,ultramicrotome,8将切片裱于蛋清涂布的载玻片上，充分晾干。入0.1mol/LPB。漂洗5min3次。9在湿盒和通风厨中，每张切片加于2%锇酸6080l。固定1.52h。漂洗5min4次。10经50%、70%、80%、90%、100%（3次）各级酒精脱水，每级10min。11在切片表面注入少量Epon/丙酮液（Epon：丙酮=2：1），用注满Epon液的塑料胶囊扣入切片上。12置聚合箱中，37聚合24h，60聚合48h。13在酒精灯外燃上加热57秒，将标本从载片上分离，剥除塑料胶囊。镜下选择超薄切片部位或细胞。14修块，用超薄切片机切片，片厚6080nm。将切片裱于铜网。15醋酸铀、枸橼酸铅染色，双蒸水洗净，电镜观察。,染色后标本处理的基本步骤,锇酸固定锇酸的配制与管理：用0.1MPB配制，浓度为2%。用棕色磨口瓶密封，4度冰箱内保存。固定时间：1.52h注意事项：在通风橱中进行。,脱水,经50%、70%、80%、90%、100%（3次）各级酒精脱水，每级10min,包埋Epon树脂的配置器具：50100ml塑料水杯或相应大小的烧杯；510ml塑料注射器；1ml注射器；医用手套；Epon套剂（4种）。Epon配方与配量：EponDDSAMNADMP-30Total（ml）23.816.011.50.852.111.90.85.750.426.05配制：根据上配方，用注射器取Epon加入杯中，置搅拌器上用磁棒旋转搅拌，依次加入DDSA，NMA，最后加入DMP-30，用膜封住杯口免湿气侵入，继续搅拌30min。,树脂包埋,聚合：聚合箱内3724h，6048h,取块与修块,超薄切片,切片刀,载片铜网,电子染色：醋酸铀/枸橼酸铅,电镜观察,实验：分组：2个组（10人/组）实验内容：1、灌注、取材。带教老师：孙燕地点：9号214室2、切片示教。带教老师：高璐、朱新平、李瑞锡地点：9号楼二楼和三楼时间：8号、10号（二、四）中午12：0013：20,提交课程报告内容：1）实用免疫电镜技术的基本步骤2）个人学习的主要收获3）对课程的意见和建议时间：12月15号（星期二）,组织化学和细胞化学研究生国家统编教材主编：蔡文琴,组织化学与细胞化学研究生国家统编教材第一章组织制片技术与细胞化学技术（北京中医药大学郭顺根）5.0万字第一节组织制片技术取材与固定石蜡切片包埋程序常用染料和染色方法树脂包埋光镜切片技术冰冻切片染色技术整封制片技术第二节常用组织化学染色方法糖原染色方法核酸染色方法酶组织化学染色方法细胞凋亡检测技术第二章免疫细胞化学技术9.0万每节15万字左右第一节免疫细胞化学的免疫学及组织细胞学概述(三军医大学张吉强)抗原抗体补体系统标记物抗体的制备和配制组织材料的处理（取材）细胞和组织的固定组织切片技术免疫染色对照设置第二节免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学的原理荧光抗体荧光免疫细胞化学染色方法（内容上含有对照实验）第三节酶免疫细胞化学技术酶标抗体法非标记抗体酶法结果分析免疫组织化学的几种特殊应用第四节亲和免疫细胞化学技术(三军医大学蔡文琴)生物素-抗生素免疫细胞化学技术葡萄球菌蛋白A凝集素第五节免疫金银及铁标记技术(三军医大学蔡文琴)免疫进技术发展史溶胶的基本概念免疫胶体金银细胞化学染色的固定剂选择光镜免疫金银细胞化学技术附录免疫细胞化学常用试剂介绍,第三章原位杂交组织化学技术5.0万第一节原位杂交组织化学技术的基本原理基本原理基本方法第二节核酸探针的种类、制备及标记特异性目的核酸（或基因）的的制备目的核酸的扩增核酸探针的放射性核素标记核酸探针的非放射性标记第三节DNA及寡核苷酸技术在原位杂交组织化学中的应用DNA探针的应用寡核苷酸探针的应用第六节原位杂交组织化学与免疫细胞化学结合法核素原位杂交组化与免疫组化PAP法的联合程序非核素原位杂交与免疫组化联合法第七节原位杂交细胞化学技术的一些新进展荧光原位杂交技术肽-核酸原位杂交细胞化学技术附录一原位杂交组织化学常用试剂及处理第四章电子显微镜技术（首都医科大学周德山）7.0万字，1-3节3.0万字第一节透射电镜透射电镜的基本原理超薄切片技术观察及记录第二节扫描电镜技术扫描电镜概况扫描电镜的生物样品制备几种常用的样品制备方法第三节冷冻蚀刻电镜技术物理固定快速冷冻方法冷冻复型样品制备冷冻超薄切片法第四节电镜细胞化学技术基本原理样品制备常用电镜酶细胞化学方法,第五节免疫电镜技术(复旦大学李瑞锡)4.0万字电镜免疫细胞化学技术概述免疫铁蛋白技术免疫酶细胞化学技术免疫电镜胶体金标记法第五节电镜原位杂交技术电镜原位杂交概述几种电镜原位杂交操作程序第五章激光扫描共聚焦显微技术(同济医科大学李和)8.0万字第一节基本原理共聚焦的发展激光扫描共聚焦显微镜共聚焦显微镜图像模式样本制备和图像采集第二节应用细胞内钙离子测定细胞内PH的测定细胞断层扫描与三维重建膜电位测定荧光漂白恢复技术笼锁化合物技术第三节激光扫描共聚焦显微技术展望第六章细胞形态与细胞化学定量分析技术(重庆医科大学唐勇)5.0万字第一节基本概念第二节细胞数的体视学定量研究从轮廓数估计细胞数细胞的直接计数随机抽样第三节成功应用举例第七章细胞化学定量分析技术（暨南医科大学夏潮涌）5.0万字第一节细胞化学计量术概述概论细胞化学计量数的评定第二节显微光度测量术显微光度测量术显微吸收光度数纤维荧光光度术第三节显微分光光度计测量方法吸收光测量荧光光度测量第四节显微图像分析系统组成图像处理与分析原理性能要求图像分析系统性能的生物学方法评估测量参数及其意义第五节流式细胞术流式细胞仪的主要组件二、流式细胞仪的原理三、流式细胞仪的应用四、流式细胞术的质量控制,第八章细胞培养及细胞内显微注射技术（北京协和大学章静波）4.0万字第一节细胞培养的基本操作及要求第二节各种细胞的特殊培养方法第三节各种干细胞的培养方法及免疫标记第四节嚣官培养方法第五节细胞内显微注射技术（第三军医大学陈鹏慧，蔡文琴）细胞内注射的类型细胞内注射操作方法细胞内注射与细胞化学技术第九章PCR的基本理论与技术（昆明医学院王廷华）3.0万字第一节概述第二节原位PCR相关技术第三节定量P