实验四 尿标本的微生物学检验PPT课件.ppt

实验四,尿标本的微生物学检验,1,.,2019/11/26,实验目的：掌握尿液标本的采集与处理、常见病原菌及一般微生物学检验程序和细菌计数方法。掌握大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌的微生物学鉴定方法和生物学性状。,2,.,2019/12/18,尿标本的采集与处理：正常人的尿液通常是无菌的，但在外尿道除有正常菌群外，尚有其他一些病原菌和条件致病菌，可通过多种途径引起尿路感染（urinarytractinfection,UTI）。如：葡萄球菌、链球菌、肠球菌、大肠埃希氏菌、变形杆菌等。标本采集方法常有五种：导尿法、中段尿采集法、肾盂尿采集法、膀胱穿刺采集法、留尿法。,3,.,2019/12/18,1）导尿法：采取导尿管导尿，是一种较好的无菌采集法，可直接插导管采集尿液标本或滞留导管集尿。直接导尿先让尿流弃15ml，滞留导管集尿先用70%酒精消毒导管口再用针筒抽取，取尿量为1015ml，直接导尿有将尿道细菌进入膀胱的危险，尽量避免此方法。2）中段尿采集法：目前国内临床常用此法。女性病人先用肥皂水或1:1000高锰酸钾水溶液冲洗外阴及尿道口；男性病人应翻转包皮冲洗，用1:1000新洁尔灭消毒尿道口；用无菌生理盐水或无菌水冲去消毒液，再用灭菌纱布擦干，让病人排尿，弃去前段尿，收集中段尿1020ml，置于无菌容器内，立即加盖送检。,4,.,2019/12/18,3）肾盂尿采集法：由泌尿科医生在膀胱镜下分别采集左右侧输尿管的尿液，并做好标记，以防左右侧错位，尿液采集量不少于1ml。4）膀胱穿刺采集法：在病人耻骨上膀胱区用碘酒、酒精消毒（要求病人不排尿充盈膀胱）以无菌针筒做膀胱穿刺，抽取尿液后针筒插入橡皮塞送检。此法主要用于厌氧培养。5）留尿法：疑为尿道结核患者，可用一洁净容器，留取24h尿液，取其沉淀部分盛于清洁瓶内送检。,5,.,2019/12/18,通常取晨起第一次尿送检。由于治疗所用药物多数均通过尿液排泄，因此，无论用何种方法采集尿液都宜在用药前进行。尿液标本的采取和培养最大的问题是污染杂菌，故应严格进行无菌操作尿液标本中不得加防腐剂，否则会影响检出的阳性率。尿液标本采集后要立即送检（常规2h内）或存放于4冰箱（不超过24h，教材规定为8h），因搁置时间稍长尿中病原菌可在室温中增殖，而影响细菌计数的正确性。应注意淋病奈瑟菌培养时标本不能冷藏保存。,6,.,2019/12/18,常见病原菌：医院内引起UTI的病原菌70%为革兰氏阴性杆菌，其中以肠杆菌科和假单胞菌属的细菌为主；革兰氏阳性菌约占20%，其中以葡萄球菌和肠球菌为多见。由于抗菌素的广泛应用，近年来真菌性UTI增多，约占10%。,7,.,2019/12/18,检验程序：尿标本直接涂片染色分离培养细菌计数直接药敏试验（特殊细菌检查离心沉淀）,BA、中国蓝或麦康凯平板（常规培养）,血清学鉴定生化鉴定药敏试验,确定病原菌,定量培养直接计数,351824h,观察菌落形态、涂片染色镜检,发报告,8,.,2019/12/18,检验程序：革兰阴性杆菌氧化酶（Oxi）-+肠杆菌科细菌非发酵菌,氧化酶阴性非发酵菌：不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌。氧化酶阳性其他革兰阴性菌：巴斯德菌、气单胞菌、邻单胞菌和弧菌属等也是氧化酶阳性。,9,.,2019/12/18,麦康凯平板（Mac）：是一种肠道杆菌专用的弱选择性培养基。培养基成分中除基础成分外，主要含有0.5%胆盐、1%乳糖、中性红指示剂。胆盐：一方面对沙门氏菌有刺激生长作用，另一方面对革兰氏阳性菌及大肠埃希氏菌有抑制作用。1%乳糖：作为一种指示糖。中性红指示剂：pH6.88.4，由红黄。（分解乳糖的细菌产酸，使菌落周围胆盐堆积变浑浊）,10,.,2019/12/18,实验器材：1、标本：1#、2#、3#模拟尿液标本。2、培养基：BA、Mac、普通营养琼脂、KIA、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐斜面、尿素、苯丙氨酸斜面、硝酸盐蛋白胨水。3、试剂：9.9ml无菌生理盐水、革兰染液、氧化酶试剂、3%H2O2、靛基质试剂、甲基红试剂、VP甲液、VP乙液、10%FeCl3、硝酸盐还原试剂甲液、硝酸盐还原试剂乙液。4、其它：无菌空平皿、载玻片等。,11,.,2019/12/18,实验方法：一、分离培养用无菌方法将1#、2#、3#模拟尿液标本分别划线接种于BA、Mac上，置35培养1824小时。二、直接涂片染色取上述1#、2#、3#标本分别作涂片、革兰氏染色、镜检。（要求绘图并描述）三、细菌计数（倾注平板法）0.1ml尿液9.9ml无菌NS混匀取0.1ml（1:1000稀释）标本无菌空平皿倾入1015ml加热融化并冷至50的无菌营养琼脂，混匀35培养1824h。,12,.,2019/12/18,0.1ml尿液,9.9mlNS,1:100稀释标本0.1ml,总稀释倍数1:1000,13,.,2019/12/18,四、结果观察：1、细菌计数1）结果记录：2）结果计算：每ml尿液细菌数=菌落平均数稀释倍数3）结果判断标准：尿标本中细菌的计数，主要是根据尿中细菌的多少来判断是否感染。一般认为，细菌计数：104/ml为污染105/ml为感染104105/ml为可疑,14,.,2019/12/18,目前认为由革兰氏阴性杆菌引起的菌尿，其菌数均可达到105/ml，而球菌所引起的菌尿，其菌数达到104/ml，即可作为尿路感染的标准（因不同细菌繁殖速度快慢不一，在同一时间内细菌繁殖数应该是：革兰氏阴性杆菌葡萄球菌肠球菌）。为此，作菌尿计数时，必须与涂片染色结果结合，作出报告。以下几种情况均可使尿液中菌数104/ml：（1）应用了低敏感性抗菌药物，尿液中细菌受到一定抑制。（2）患者大量输液或使用利尿剂后。（3）尿液pH值失常，当pH5.8或pH8.5时，细菌生长受阻。（4）尿频时，膀胱内的菌停留时间短则细菌数少。（5）某些菌的繁殖能力低。,15,.,2019/12/18,2、菌落形态描述：（BA、Mac分别描述）1#标本：2#标本：3#标本：3、菌体形态观察：分别取1#、2#、3#标本的BA、Mac培养物涂片、革兰染色、镜检。（要求绘图并描述、对比BA、Mac菌体形态差异）,BA：,Mac：,16,.,2019/12/18,五、鉴别试验:1、氧化酶（Oxidase）试验：原理：氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。氧化酶试验中，酶并不直接与试剂（1%盐酸四甲基对苯二胺或1%盐酸二甲基对苯二胺）起反应，而是首先使细胞色素c氧化，然后氧化型细胞色素c使对苯二胺氧化，出现显色反应。试剂：1盐酸四甲基对苯二胺或1盐酸二甲基对苯二胺方法：直接法和试剂纸片法直接法：用滤纸片刮取待检菌菌落（切勿刮到培养基），在有菌的位置滴加氧化酶试剂，1分钟内观察结果。结果判断：立即出现红色，继而逐渐加深为阳性（盐酸四甲基对苯二胺呈现蓝紫色为阳性），不变色为阴性。,17,.,2019/12/18,意义：本试验应用广泛，如奈瑟菌属、假单胞菌属、莫拉菌属呈阳性，肠杆菌科细菌呈阴性。2、触酶试验：,18,.,2019/12/18,六、生化鉴定：将1#、2#、3#标本分别接种于KIA、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐斜面、尿素、苯丙氨酸斜面、硝酸盐蛋白胨水中，置35培养1824小时。,19,.,2019/12/18,1、KIA（克氏双糖铁）试验：原理1、营养非常丰富2、葡萄糖：乳糖1：103、指示剂为酚红：变色范围6.08.6，pH8.6显红色4、含有硫代硫酸钠5、含有Fe2方法：直接观察结果。,20,.,2019/12/18,只分解葡萄糖,分解葡萄糖和乳糖产生气体,产生H2S,结果判断,21,.,2019/12/18,22,.,2019/12/18,结果表示：不产酸，产酸，产酸产气产酸A,产碱K斜面/底层H2S斜面/底层H2S产气/A/A/K/A,23,.,2019/12/18,2、吲哚（靛基质）试验:,原理：,色氨酸,色氨酸酶,吲哚、丙酮酸和氨,对二甲基氨基苯甲醛,玫瑰吲哚,吲哚,24,.,2019/12/18,方法:结果:,应用：用于肠杆菌科细菌的鉴定。,25,.,2019/12/18,3、甲基红试验（MR试验）4、VP试验,26,.,2019/12/18,原理：,变色范围4.46.2,27,.,2019/12/18,方法及结果：,28,.,2019/12/18,甲基红实验结果,阴性阳性,29,.,2019/12/18,VP实验结果,阳性阴性,30,.,2019/12/18,应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。MRVP大肠埃希菌产气肠杆菌,31,.,2019/12/18,IMViCI:吲哚试验M:甲基红试验V:V-P试验C:枸橼酸盐利用试验实验,32,.,2019/12/18,5、枸橼酸盐利用试验,原理：某些细菌能利用培养基中的枸橼酸钠作为唯一的碳源而获得能量，能利用枸橼酸盐的细菌也能利用铵盐作为唯一氮源，同时产生氨。分解枸橼酸盐使培养基变碱性。方法：直接观察结果。应用：肠杆菌科细菌的鉴定,33,.,2019/12/18,34,.,2019/12/18,6、尿素酶试验,原理：产生尿素酶的细菌，分解培养基中的尿素，产生碳酸铵是培养基pH，酚红由浅红色变成深红色。,35,.,2019/12/18,方法：直接观察结果。,结果：反应时间因细菌而异。培养基变成深红色为阳性。应用：肠杆菌科细菌的鉴定。,36,.,2019/12/18,7、苯丙氨酸脱氨酶试验：,原理：,37,.,2019/12/18,方法：待检菌大量接种于苯丙氨酸琼脂斜面上，培养后在斜面上直接加45滴10氯化铁试剂，出现绿色为阳性，立即观察，为可逆反应。,38,.,2019/12/18,39,.,2019/12/18,8、硝酸盐还原试验：,原理：有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。亚硝酸盐与硝酸盐还原试剂中的醋酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中对氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸与-萘胺结合成红色的N-萘胺偶氮苯磺酸。方法：在硝酸盐蛋白胨水培养物中分别滴加硝酸盐还原试剂甲液和乙液各12滴，混匀，立即观察结果。,40,.,2019/12/18,阳性：加入试剂后30s变成红色，表明有亚硝酸盐存在，表示硝酸盐还原试验阳性。阴性：加入试剂后没有颜色反应，可能是：硝酸盐没有被还原(真阴性反应)；硝酸盐被还原成非亚硝酸盐的其他产物，如NH3、N2(脱硝作用)、NO或N2O和羟胺等。由于此试剂只检测亚硝酸盐，上述产物会导致假阴性结果。因此，需要加少量锌粉于阴性反应中，锌离子还原硝酸盐为亚硝酸盐，加入锌粉后变成红色，表示有剩余的硝酸盐存在，证明是真正的阴性反应。,结果判断：,41,.,2019/12/18,42,.,2019/12/18,应用：肠杆菌科除某些生物型与欧文菌属外，均还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌等假单胞菌可产生氮气，需加入锌粉证实。阳性对照菌为大肠埃希菌，阴性对照菌为醋酸钙不动杆菌无硝变种。,43,.,2019/12/18,七、实验结果：,44,.,2019/12/18,结果报告：1#标本检出2#标本检出3#标本检出,45,.,2019/12/18,实验讨论：作业：1、查5篇关于尿标本检验常见病原菌文献，例出文献名及每篇文献中前五种常见菌。2、尿液标本分离培养选择Mac的目的？3、产