（食品科学专业论文）珠蛋白提取、ACE抑制肽的酶法制备及酶动力学的研究.pdf

珠蛋白提取、a c e 抑制肽的酶法制备及酶动力学的研究 摘要 我国人民的肉食主要以猪肉为主，然而，大多数肉类屠宰场中猪血利用率 极低，猪血球基本上被废弃。血红蛋白是猪血中的重要成分，含铁量极其丰富。 由血红蛋白提取的珠蛋白是一种非常优良的蛋白质。由蛋白酶水解珠蛋白而获 得的多肽对血管紧张素工转换酶( a c e ) 具有很高的抑制作用。 本文通过对对珠蛋白提取的试验，确定了抗凝剂的选取为0 3 的柠檬酸 三钠；确定4 倍丙酮和2 n a a c 添加量为珠蛋白与血红素提取的最优参数；此 时珠蛋白收率为2 9 0 3 9 ( 每升新鲜猪血得珠蛋白的克数) 。 利用胃蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的单酶和双酶水解珠 蛋白，进行珠蛋白的酶解试验，反应时间、加酶量、底物浓度、温度和p h 值 等因素均对酶解液水解度产生影响。四种蛋白酶单酶及双酶水解多肽对水解度 和a c e 的抑制活性有不同程度的影响，通过t c a 法和r p - - h l p c 法对水解液进 行水解度和a c e 抑制活性测定，单酶水解中以胃蛋白酶水解液的a c e 抑制率最 大，为9 4 6 3 ；碱性蛋白酶水解液的a c e 抑制率最高为9 4 4 9 ，水解度为 1 4 4 2 。双酶水解试验中，胃蛋白酶与碱性蛋白酶组合的水解物的a c e 抑制 活性最高，达9 4 8 2 ，且时间较单酶水解短，水解效率提高。 在酶促反应动力学( k i n e t i c so fe n z y m e c a t a l y z e dr e a c t i o n s ) 实验中利用 l i n e w e a v e r b u r k 方法，分别以动物蛋白一一珠蛋白为底物，求出偷和踟a x ， 以期找出酶的最优反应条件。p h2 5 时，胃蛋白酶的v m a x 值达到最大值，为 0 1 9 0 m g m l m i n ，k m 值较低小，此时酶分子对底物的亲和力较大；碱性蛋白酶 在5 0 时k m 值达到最小值为1 3 0 0m g m l ，v m a x 为0 1 4 2m g m l m i l l ；木瓜 蛋白酶的动力学试验的结果均较胃蛋白酶和碱性蛋白酶的效果差。胃蛋白酶和 碱性蛋白酶的组合酶解珠蛋白效果较佳，v m a x ，k m 分别为0 2 3 7 m g m l m i n 和 6 9 1 6m g m l 。 关键词：珠蛋白蛋白酶血管紧张素转化酶抑制肽酶动力学 g i o b i np r o t e i ne x t r a c t i o n ，p r e p a r a t i o no fa c e i n h i b i t o rf r o mg l o b i nb ye n z y m a t i ch y d r o l y s i sa n d e n z y m ek i n e t i c ss t u d i e s a b s t r a c t t h e p o r ki sam a i nm e a ts o u r c ei no u rc o u n t r y ，h o w e v e r ，t h eu t i l i z a t i o no fp i gb l o o d i s v e r yl o wi nt h em a j o r i t yo fm e a ts l a u g h t e r h o u s e s ，a n db a s i c a l l ya b a n d o n e d h e m o g l o b i ni s a ne s s e n t i a le l e m e n ti np i gb l o o d ，a n dr i c ho fi r o n t h eg l o b i n e x t r a c t e df r o mh e m o g l o b i ni sav e r yg o o dp r o t e i n t h ep e p t i d e sd e r i v e df r o mt h e g l o b i nt h r o u g hh y d r o l y z i n gh a sah i g h e ra c ei n h i b i t i o na c t i v i t y i n t h i sp a p e r ，f i 鹉t l y ，b yg l o b i ne x t r a c t i o nt e s t ，i d e n t i f yt h a t0 3 s o d i u m c i t r a t e f o u rt i m e sa c e t o n ea n d2 n a a cw c r et h eo p t i m a lp a r a m e t e r s ；a tt h i sp o i n t g l o b i ay i e l dw a s2 9 0 3 9 l ( t h eg r a m so ft h eg l o b i nc a nb ee x t r a c t e df r o mo n el i t e ro f f r e s hp i gb l o o d ) t h ea l c a l a s e ，p e p s i n ，t r y p s i n a s ea n dp a p a i nw e r ei n d i v i d u a la n dd o u b l ea p p l i e dt o h y d r o l y z et h eg l o b i n t h er e a c t i o nt i m e ，q u a n t i t yo fe n z y m ea d d i t i o n ，s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n ，t e m p e r a t u r ea n dp he f f e c t e dt h eh y d r o l y s i sd e g r e eo fg l o b i n t h e g l o b i nh y d r o l y z e db yf o u re n z y m e si n d i v i d u a la n dd o u b l eh a dd i f f e r e n td e g r e eo f a c e i n h i b i t o r ya c t i v i t ya n d h a dd i f f e r e n th y d r o l y s i sd e g r e e s t h r o u g ht c a m e t h o d a n dt h er p h l p cm e t h o d ，t h eh y d r o l y s i sd e g r e ea n dt h ed e g r e eo fa c ei n h i b i t o r y a c t i v i t yw e r ed e t e r m i n e d i ni n d i v i d u a le n z y m eh y d r o l y s i s ，h y d r o l y z a t eb yp e p s i n e h y d r o l y s i sh a dt h eh i g h e s td e g r e eo fa c ei n h i b i t o r ya c t i v i t y ，u pt o9 4 6 3 ， a l c a l a s eh y d r o l y s i sh a dh i g h e rd e g r e eo fa c ei n h i b i t o r ya c t i v i t y ，u pt o9 4 4 9 ， a n d1 4 4 2 o fh y d r o l y s i sd e g r e e i nd o u b l ee n z y m eh y d r o l y s i s ，t h eh y d r o l y s i so f c o m b i n a t i o no fp e p s i na n da l k a l i n eh a dt h eh i g h e s ta c ei n h i b i t o r ya c t i v i t y ，u pt o 9 4 8 2 a n dt h ed o u b l e e n z y m eh y d r o l y s i s t e s tn e e d e ds h o r t e rt i m et h a nt h e i n d i v i d u a l ，w i t hg r e a t e re f f i c i e n c y i nk i n e t i c so f e n z y m e - c a t a l y z e d r e a c t i o n s t e s t ，t h o u g h l i n e w e a v e r b u r k m e t h o d ，k m a n dv m a xw e r e o b t a i n e d ，t h o u g ha n i m a lp r o t e i n - t h eg l o b i n a s h y d r o l y s i ss u b s t r a t e ，w i t hav i e wt oi d e n t i f y i n gt h eo p t i m a lr e a c t i o nc o n d i t i o n s e n z y m e a tp h 2 5 ，v m a xo fp e p s i nh y d r o l y s i sa c h i e v et h em a x m u mv a l u ef o r 0 1 9 0 m g m l r a i n ，k i nl o w e r ，s ot h i se n z y m em o l e c u l e sh a ds t r o n g e ra f f i n i t yo nt h e s u b s t r a t e ；k mo fa l c a l a s ei nt h e5 0 。ct oa c h i e v et h em i n i m u mv a l u ef o r1 3 0 0m g m l ，0 1 4 2m g m l r a i no ft h ev m a x t h er e s u l t so fp a p a i ne n z y m ek i n e t i c st e s tt h a n a l c a l a s ea n dp e p s i nt h ew e r ep o o r e r t h ec o m b i n a t i o no fp e p s i na n da l k a l i n e h y d r o l y s a t i n gg l o b i nw a sm o r es u i t a b l e ，v m a xo f0 2 3 7 m g m l m i n ，k mo f6 9 1 6 m g m 1 k e yw o r d s ：g l o b i np r o t e i n a s e ；a n g i o t e n s i n ic o n v e r t i n g e n z y m ei n h i b i t o r y p e p t i d e ( a c e i p ) ； e n z y m ek i n e t i c s h i 插图清单 图1 - 1 血液的组成“1 图1 - 2 血红素的结构3 图1 3 血管紧张素转化酶对血压的调节作用4 图2 1 从猪血中提取珠蛋白和血红素的工艺1 1 图2 2 不同抗凝剂抗凝效果1 4 图2 3 丙酮添加量对血红素和珠蛋白收率的影响1 5 图2 4 丙酮添加量对珠蛋白颜色的影响1 5 图2 - 5n a a c 添加量对血红素收率的影响：1 6 图3 - 1 蛋白质标准曲线2 2 图3 2p h 值对珠蛋白溶解度的影响2 3 图3 3 马尿酸2 0 0 3 0 0 n m 波段扫描图2 3 图3 4 马尿酸标品色谱图”2 4 图3 5 加酶解液的h h l 与a c e 的色谱图2 4 图3 6 水解时间对a c e 抑制活性的影响2 5 图3 7 加酶量对a c e 抑制活性的影响2 6 图3 - 8 底物浓度对a c e 抑制活性的影响2 6 图3 9 温度对a c e 抑制活性的影响2 7 图3 1 0p h 值对a c e 抑制活性的影响2 8 图3 1 1 时间对a c e 抑制活性的影响2 9 图3 1 2 时间对a c e 抑制活性的影响2 9 图3 1 3 水解时问对水解度的影响3 0 图3 1 4 加酶量对水解度的影响3 1 图3 1 5 底物浓度对水解度的影响3 1 图3 1 6 温度对水解度的影响3 2 图3 1 7p h 值对水解度的影响3 2 图3 1 8 时间对水解度的影响一3 3 图3 1 9 时间对水解度的影响3 3 图4 1l i n c w b u r k 方程1 v 对1 s 作图3 7 图4 2p h 值对胃蛋白酶v m a x 、k m 的影响一3 8 图4 3p h 值对碱性蛋白酶v m a x 、k m 的影响3 8 图4 4p h 值对木瓜蛋白酶v m a x 、k r a 的影响3 8 图4 5 温度对碱性蛋白酶v m a x 、k m 的影响3 9 图4 6 加酶种类对v m a x ( a ) 和k i n ( b ) 的影响4 0 图4 7 加酶种类对v m a x ( a ) 和k m ( b ) 的影响4 1 图4 - 8 加酶种类对v m a x ( a ) 和k m ( b ) 的影响一4 2 表格清单 表1 - 1 血红蛋白氨基酸情况分析2 表2 - 1 不同抗凝剂的抗凝效果1 4 表2 2 丙酮添加量对血红素和珠蛋白收率的影响1 5 表2 3n a a c 添加量对卟啉铁提取率的影响1 6 表2 4 正交实验结果计算及分析一1 7 表3 1 标准曲线1 8 表3 2 实验用酶作用条件1 9 表3 3 四种酶的不同温度条件r 2 0 表3 4 四种酶的不同p h 值条件一2 0 表3 5a c e 的抑制活性试验2 2 表4 1 酶动力学实验3 6 表4 2 各种酶所考察的p h 值3 6 表4 3 碱性蛋白酶考察温度一3 6 表4 41 s 对1 v 的影响3 7 表4 5 加酶种类对v m a x 和k m 的影响4 0 表4 6 加酶种类对v m a x 和k i n 的影响4 1 表4 7 加酶种类对v m a x 和k m 的影响4 2 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标志和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得 金鳇王些太堂或其他教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文作者签字：电匣趋鼋签字日期：炉7 年胁月e t 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 金魍王些盔堂有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借阅。本人 授权 金飕王丝太堂可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文者签名：姬苞怠 导师签名： 签字日期：帆海1 2 - , g 纠日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 诈绻 签字日期：园年f 月烈日 电话： 邮编： 致谢 本文是在导师范远景副教授的悉心指导下完成的，从论文的定题、实施到 论文的撰写，都倾注了范老师大量的心血。三年来，导师在学习、工作、生活 上给予无微不至的关怀。恩师严谨的治学态度，忘我的敬业精神，使我受益匪 浅。值此论文完成之际，首先向恩师致以最崇高的敬意和最诚挚的感谢! 在本论文研究的试验过程中，得到了韩卓老师、张焱、黄璐、夏莲和伍玉 菡等师姐的大力支持；得到了学院领导和其他各位导师的关心和帮助；得到了 0 5 级研究生王俊伟和张倩同学真诚的帮助；0 4 级研究生黄南山、庞伟、潘炳 南、张必芳和孙峰给与了热情帮助；0 3 级本科生郑琛、马岩、和郭思锦同学参 加了部分工作；父母及家人给予莫大的物质支持和精神鼓励，使我得以顺利完 成学业。 谨在此一并表示最衷心的感谢! i v 作者：姬莹莹 2 0 0 7 年1 1 月1 2 日 第一章绪论 1 - l 猪血的成分与功能 猪血：味甘、苦，性温，祖国医学对猪血有“性味咸平，治头痛眩晕、中 腹胀满、肠胃嘈杂、宫颈糜烂”的记载，常服可治疗贫血、神经性头痛，身体 虚弱、神经衰弱、失眠多梦等症。除此以外，猪血还有解毒清肠、补血美容 的功效。利用猪血可以提取血红素、蛋白粉、凝血酶和超氧化物岐化酶( s o d ) 等生化产品。猪全血中除了7 9 1 的水分之外，其余干基物质9 0 以上是蛋白 质。 图卜1 血液的组成 f i g 1 1t h ec o m p o s i t i o no fb l o o d 1 1 1 血浆 如图卜1 ，血浆是猪血的组成之一，约占总量的6 5 ，其中8 为蛋白质， 血浆蛋白质一般分为血清白蛋白、血清球蛋白和血纤维蛋白三种；血浆蛋白质 已被国内外用于肉类似物、香肠、布丁的配方中“。3 1 。 1 1 2 血球 血球是猪血的另外一个组成部分，包括红血球、白血球和血小板。红血球 中的血红蛋白占到了全血蛋白质总量的2 3 ，占血细胞蛋白质总量的9 0 以上。 同时含铁量及其丰富，每1 0 0 克含铁高达4 5 毫克，比猪肝高两倍，比鸡蛋高1 8 倍，比瘦肉高2 0 倍。与牛血红蛋白相比，猪和人的血红蛋白结构近似，a 和b 亚基同源性分别达到8 4 和8 5 ，表i - i 为猪血红蛋白中各种氨基酸成分的含量。 但血红蛋白因色泽猩红，腥昧重和不易消化等特点而受到用途限制，而猪血红 蛋白的成分血红素与珠蛋白备受国内外关注h 1 。 在丛! b ；里! ：避b i ：! ! ! ：b i b ：g ! ! 上获取猪血红蛋白的全部氨基酸序列，对其中 的序列进行分析。血红蛋白由4 条多肽亚基组成，两个是一种亚基，两个是另一种亚 基。每个亚基都有一个血红素基和一个氧结合部位。4 个氧结合部位彼此保持一定距 离，其中a 链为1 4 1 个残基，8 亚基为1 4 7 个氨基酸。对猪血红蛋白氨基酸的情况 分析如表卜1 。 表3 1 血红蛋白氨基酸情况分析 t a b 1 1a m i n oa c i do fh e n eg l o b i n 血红蛋白a l p h a ( q ) 亚基血红蛋白b e t a ( b ) 亚基 a m i n on u m b e r b y b y a m i n os u m b e r b yb y a c i _ d ( c o u n t w e i g h tf r e q u e n c ya c i d ( s )c o u l t w e i g h tf r e q u e n c y 1 1 2 1 血红素 2 血红素是哺乳动物血液、肌肉中的红色色素。如图1 - 2 ，血红素的基本结 构是由四个吡咯环通过亚甲桥相互连接而成卟吩，带有侧基的卟吩形成卟啉， h 啉和一分子亚铁相结合形成卟琳铁化合物一一血红素。因此，血红素又称卟 啉铁化合物。由于卟啉铁能直接被肠粘膜上皮细胞所吸收，然后在粘膜细胞内 分离出铁并与脱铁蛋白结合形成铁蛋白。所以，卟啉铁的吸收与非卟啉铁相比 具有以下特点： a 吸收无障碍：卟啉铁因直接被肠粘膜细胞吸收，因此不受植酸盐、草酸 盐、磷酸盐和碳酸盐的影响，甚至与咖啡、茶等一起摄入，其吸收也不会受丝 毫干扰。 b 吸收率高：卟啉铁因无需在肠道内分离出亚铁离子，因此不受胃酸分泌 状态的影响，其吸收率可达1 5 - 2 5 左右。 c 摄食后无副作用：非卧啉铁( 如常用补铁剂：f e s 0 4 ) 摄食后有时会出现 恶心、腹胀、腹泻、便泌等症状，而卟啉铁不会产生这些症状。 图1 2 血红素的结构 f i g 1 2t h es t r u c t u r eo fh e m e 血红素作为一种优良的铁强化剂及抗贫血药，已被药理及临床所证实。据报道， 应用血红素治疗3 0 例成人缺铁性贫血，各种贫血症状明显改善。血液检验指标 明显好转，患者志愿服用，总有效率达9 0 。而且，无胃肠道刺激作用，具有 生物利用度高、无体内铁蓄积中毒及胃肠刺激等不良反应等优点。游开绍等晦1 1 9 9 6 年用在血红素对大鼠灌胃，观察大鼠的长期毒性反应。结果发现无法测出 血红素的口服半致死量：进行限度试验，2 4 小时内给血红素灌胃，无任何毒副 作用。可见，卟啉铁补血效果是相当安全的。同时卟啉铁还是抗肿瘤药物的重 要原料阻“，我国于1 9 9 8 年正式批准以血红素为基本原料的血卟啉为抗肿瘤新 药。美国f d a 已于1 9 8 3 年7 月正式批准雅培公司的氯化血红素作为药品使用“1 。 3 在肉制品工业中，血红素也有广阔的应用前景，传统的熏制熟肉制品加工工艺 中，加入的发色剂亚硝酸盐，有较大的致癌作用，血红素作为发色剂及人工色 素的替代品有很高的效果”1 。 1 2a c e 的功能及其抑制剂的研究意义 a c e ( a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m e ，血管紧张素转化酶，e c 3 4 1 5 1 ) 是含有z n 2 + 辅基的羧二肽酶“”】，相对分子量为1 2 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 。a c e 主要存在肺 及雄性动物的生殖器官( 辜丸) 中，其次是肾( 除鼠外) 与胃肠组织，还分布在外 周血管的内皮细胞中。a c e 对血压的调节作用主要有二：其一是将血管紧张素i ( a n g i ) 转化为血管紧张素i i ( a n g i i ) ；其二是降解缓激肽，使之失活。体内 的肾素一血管紧张素系统( r e n i n a n g i o t e n s i n s y s t e ，r a s ) 和激肽释放酶一激 肽系统( k a l l i k r e i n k i n i n sy s t e m ，k k s ) 对血压的调节起着重要作用。a c e 在k k s 系统中被称为激肽酶i i ，它能使激肽失活，使k k s 系统处于抑制状态， 导致血管收缩，血压升高。a c e 抑制剂可减少a n gi i 的形成，另一方面可阻抗缓 激肽的降解( 失活) ，可见a c e 抑制剂对肾素活性高的原发性高血压患者具有治疗 作用n 3 “，州。 肾素一血管紧张素系统( r a s )欣释放酶一激欣系统( k k s ) 血管紧张素原激肽原 j 一肾素( 激活型) 一肾素前体( 失活型) 一激肽释放酶一i 血管紧张素i缓激肽( 活性) l + 一a c e ( 激肽酶i i ) _ i 血管紧张素i i 醛固酮释放 l 钠储留 压升高 ( 无活性) 图卜3血管紧张素转化酶对血压的调节作用 f i g 1 _ 3r o l eo fa n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m e ( a c e ) i nb l o o dp r e s s u r er e g u l a t i o n 1 3a c e 抑制剂的研究进展及作用机理 现今a c e 抑制剂主要通过两方面来研制：一方面为化学合成，另一方面为从 天然食物蛋白中降解提取。 1 3 1 化学合成类 1 9 7 7 年c u s h m a n 等根据a c e 底物的化学结构推测出a c e 活性部位的模型，并据 4 此开发设计了第一个化学合成的a c e 抑制剂卡托普利( c a p t o p r i l ) 。虽然化学合 成的a c e 抑制剂作用得到医学界的普遍认可，但其对人体有一定的毒副作用。据 报道卡托普利可引起干咳，此夕f a c e 抑制剂还可引起肾功能损害、高钾血症、贫 血、咳嗽、皮疹和过敏性血管炎、味觉改变和血管神经性水肿等其他一些症状 “。这些使得研究者开始寻找安全性高的a c e 抑制剂。 1 3 2 生物降解类 降血压活性的血管紧张素转化酶( a n g i o t e n s i n - c o n v e r t i n ge n z y m e ) 抑制 肽已成为生物活性肽研究领域最热门的方向之一。降血压肽通常由蛋白酶在温 和条件下水解蛋白质或微生物发酵而获得。研究发现这些短肽食用安全性高， 并且在体内的消化吸收性能要明显优于单个氨基酸。此外，它们的突出优点是 对高血压患者可以起到降压作用，对血压正常的人无降压作用“。”1 。除降压功 能外，往往同时具有免疫促进、减肥及易消化吸收等生理功能。1 9 6 5 年f e r r e i r a 在南美一种蝮蛇的毒液中首次发现了a c e 抑制肽“”；而第一个从食物蛋白中提 取出a c e 抑制肽的人是m a r u y a m a 。1 9 8 2 年他从牛乳酪蛋白胰蛋白酶水解物分离纯 化出具有a c e 抑制活性的多肽“。1 9 9 6 年m a e n o 报道了牛奶发酵后所生产的a c e 抑制多肽可以被消化酶进一步水解“。现在可以提取a c e 抑制剂的食物种类非 常多，包括乳酪蛋白中的干酪素、乳清蛋白等；动植物蛋白来源的有鸡肉、明 胶、猪肉、鸡蛋、养麦、玉米、椰菜、大蒜等i 鱼贝藻类蛋白来源的有沙丁鱼、 金枪鱼、鲢鱼头、牡蛎、裙带菜等：国内一些研究者还从中国传统的食品即墨 老酒、豆腐乳中发现a c e 抑制肽“。s a i t o 2 3 j 等人从清酒和酒糟中分离了9 种c 端含有t r p 或t y r 的含5 个或更少氨基酸残基的a c e 抑制肽，通过对l l e t y r p r o a r g - t y r 和t y r - g l y g l y t y r 两种肽段的分析，认为a c e 抑制肽序列中的疏水性氨 基酸和肽段的c 端氨基酸对其抑制活性有着重要的作用。随着对其作用机制、 生理效果及制备方法研究的深入，普遍认为来源于食物蛋白质的降血压肤将显 示出良好的应用前景。近些年的研究表明，食物蛋白质酶解产物中的一些短肽 还具有广泛的促进钙吸收、降低胆固醇、免疫调节等生理调节功能。 1 3 3 基因工程法 除了上述两种方法外，最近还出现将筛选到的活性肽基因其克隆到生物基 因工程表达载体，再以合适的生物作为反应器，表达和制备活性肽的方法；但这 种方法尚属试验阶段，尚未应用到生产中。 1 3 4a c e 抑制肽的吸收性及其机理 很早以前就有报道称肽可被完整吸收进入血液o ”。但长期以来，游离氨基 酸一直被认为是蛋白质主要的吸收形式，直至上世纪五、六十年代，才由n e w a y 和s m i t h 首先提出了肽可以完整吸收的证据”。血液中小肽的发现以及胃肠道 能够吸收小肽的实验结论的不断增加，肽被完整吸收的观点及其生理作用才逐 渐被人们重视。生物活性肽吸收机制具有六大特点：( 1 ) 不需消化，直接吸收。 5 它表面有一层保护膜，不会受到人体的促酶、胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、消化 酶及酸碱物质二次水解。它以完整的形式直接进入小肠，被小肠所吸收，进入 人体循环系统，发挥其功能。( 2 ) 吸收快。吸收进入循环系统的时间，如同静脉 针剂注射一样，快速发挥作用。( 3 ) 它具有1 0 0 吸收的特点。吸收时，没有任何 废物及排泄物，能被人体全部利用。( 4 ) 主动吸收，迫使吸收。( 5 ) 吸收时，不 需耗费人体能量，不会增加胃肠功能负担。( 6 ) 起载体作用。它可将人所食的各 种营养物质运载输送到人体各细胞、组织、器官。肽载体吸收能力可能高于各 种从载体吸收能力的总和。 1 3 5a c e 抑制肽的抑制机理 食物蛋白经酶解或发酵产生的a c e i ，链长一般为2 1 4 个氨基酸，分子量 一般低于i 0 0 0 道尔顿。一般认为如果肽c 末端的氨基酸为p r o ，p h e ，t y r 或序 列中含有疏水氨基酸则有较高活性。对于二肽，若n 末端为甘氨酸残基时，c 末 端为t y r ，t r p ，p r o 则有较强的抑制作用。若c 末端为甘氨酸残基时，其n 末端 为v a l ，i l e ，a r g 是最有效的。最强的a c e 抑n - - - 肽v a l t r p 比最弱的a c e 抑 制二肽p r o g l y 抑制作用高1 0 0 0 0 倍。对于三肽，a h p s 与a c e 酶结合与c 一末 端的氨基酸顺序有关，更趋向于疏水氨基酸或支链的氨基酸，k o h m u r a o ”得出 疏水性氨基酸肽段较亲水性肽段抑带q a c e 酶活性要强。对于某些肽而言，l l e - t y r p r o 和p r o - l e u - p r o 序列可能是a c e 酶抑制活性所必需，是结合a c e 酶 的活性部位的位点。 此外，日本学者f u j i t a o ”等就相同或相似的小肽其a c e 抑制活性却相差很 大这一问题将a c e i s 分为3 类。第一类是抑制剂类型，a c e 不能将其再水解，从 而完全保持了它的a c e 的抑制活性，鲣鱼中的i y 、i k p 、l k p 、i w h 等属于抑制 型肽；第二类为底物类型，可被a c e 降解，生成新的小肽，降低它的a c e 酶抑 制活性，如鸡肉中的f k g r y y p 和血清中的f f g r c v s p 、e l i k v y l 属于底物型肽； 第三类是药物前体型抑制剂，可被a c e 或肠道内的酶水解为真正的a c e 酶抑制 剂，海鲤鱼中的l k p n m 、i w h h t 为药物前体型肽。在这三类a c e i s 中第一、三 类a c e i s 即使经过口服，经胃肠道蛋白酶作用后，仍具有降血压作用。 1 3 6a c e 抑制肽的制取方法与食物来源 1 3 6 1a c e 抑制肽的制取方法 目前生产a c e 抑制肽的方法有化学降解法、微生物发酵法和蛋白酶水解法。 a 。化学降解法 化学降解法是利用酸碱水解蛋白，虽工艺简单、生产成本低，但由于生产周 期长、腐蚀设备、环境污染，酸水解会使某些成分受到全部或部分损坏，如色氨 酸将被破坏，碱水解则破坏半胱氨酸、丝氨酸、部分赖氨酸以及精氨酸的胍基， 降低了蛋白质的生物化学价值，处于被淘汰边缘。而且蛋白水解程度难于控制， 因此较少使用。 6 b 微生物发酵法 微生物发酵法就是利用微生物发酵降解食物蛋白，使其断裂成具有生物活 性的小分子多肽。乳酸菌发酵乳制品制取a c e 抑制肽已经是现今比较成熟的工 艺。早在1 9 9 5 年，y n a k a m u r a 就发现发酵乳制品中含有抗高血压默，具有a c e 体外抑制能力”：国内也有学者研究这方面，如黄文利发现干酪乳杆菌l c 1 5 在复原脱脂乳中发酵至4 2h 时，发酵乳的a c e 抑制活性可达6 6 ；在模拟胃 肠环境消化条件下l c 1 5 发酵乳的a c e 抑制活力有所降低。一些公司已经推 出了有辅助抗高血压作用的乳酸菌发酵乳制品，如芬兰的v a l i o 有限公司和日本 的卡尔皮斯株式会社他”。 c 蛋白酶水解法 通过对蛋白质的水解可以把生物活性肽释放出来。酶法水解效率高，而且 条件温和，因而在营养成分的保留上有着不可比拟的优点。酶法水解能产生部 分含具有a c e 抑制活性多肽的水解物。蛋白水解物的各种性能( 包括理化与生理) 都与原料蛋白种类、酶的选择及水解工艺条件与方法密切相关。m a r u y a m a 先后 在1 9 8 2 和1 9 8 5 年报道了用胰蛋白酶水解牛乳酪蛋白的方法提取出了具有a c e 抑 制活性的多肽。”。1 9 9 6 年m a e n o 报道了牛奶发酵后所生产的a c e 抑制多肽可以被 消化酶进一步水解”。j e a n e t t eo t t e 等用嗜热菌蛋白酶、蛋白酶一k 、胰蛋白 酶、胃蛋白酶和b a c i l l u s1 i c h e n i f o r m i s 蛋白酶分别水解九种不同的牛奶蛋白 底物，发现嗜热菌蛋白酶水解底物后所得到多肽的a c e 抑制性最强，其后依次是 蛋白酶一k 、胰蛋白酶、胃蛋白酶和b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 蛋白酶。“。a m h a r 等人用嗜热菌蛋白酶和蛋白酶一k 的对酪乳清蛋白进行水解的酶解产物对a c e 的抑制活性较强，而用胰蛋白酶和放线菌酶的水解物对a c e 的抑制活性较弱 。“。辛志宏、吴守一等人用8 种蛋白酶对麦胚蛋白质作用，发现碱性蛋白酶对 水解所得产物的a c e 抑制性最强，达到了8 8 4 6 “。张国胜等用a s l 3 9 8 中性蛋 白酶、f l a v o u r z y m e 复合风味蛋白酶、p r u t a m e x 复合蛋白酶和a l c a l a s e 碱性内切 蛋白酶分别水解大豆蛋白，最后发现a s l 3 9 8 中性蛋白酶，在p h 值为8 0 ，温度 为4 5 ，e s ( 酶与底物浓度比) 6 ，s ( 底物浓度) 4 时，水解4 8 0 m i n 所得水 解产物对a c e ( 血管紧张素转换酶) 的抑制效果最强，i c 5 0 为0 8 4 6 9 l d ”。以 下为几种常见的蛋白水解酶： 1 ) 胃蛋白酶 胃蛋白酶( p e p s i n ，e c 3 ，4 2 3 。1 ) 主要是从猪、牛、羊等动物的胃黏膜中提 取，胃蛋白酶对底物蛋白的水解作用专一性较差，除粘液蛋白外，只能促进各 种水溶性蛋白质水解成为多肽，主要水解苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸疏水基 团和酪氨酸组成的肽键。 2 ) 碱性蛋白酶 碱性蛋白酶( a l c a l a s e ，e c3 4 4 1 6 ) 是经细菌原生质体诱变方法造育的 7 2 7 0 9 枯草杆微生物通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，主要成 分为枯草杆菌蛋白酶，是一种非特异性肽键内切酶，它能水解含疏水性羧基的 肽键，能从内部水解底物蛋白，生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的 能力。碱性蛋白酶的最适p h 范围在9 1 l 之间，因此需要在水解过程中加入大量 的碱液来维持反应体系的p h 恒定，致使水解物中盐分含量高；同时它的最适作 用温度也较高，在5 0 6 0 之间，这就需要大量的热能，能源消耗大。 3 ) 木瓜蛋白酶 木瓜蛋白酶( p a p a i n ，e c 3 4 2 2 2 ) 属于疏基蛋白酶，可水解蛋白质和多肽中 精氨酸和赖氨酸的羧基端，广泛存在于番木瓜( c a r i c ap a p a y a l ) 茎叶和果实中， 以未成熟果实的乳汁中为最高”。它具有广泛的底物专一性，有很强的分解蛋 白质韵能力，此外也具有水解酰胺键和酯键的特性o “。 4 ) 胰蛋白酶 胰蛋白酶( t r y p s i n e ，b c 3 4 2 1 4 ) 属予内切酶，在水解过程中具有内切 酶的作用，但它能催化底物蛋白质分子由l y s 或a r g 残基端所构成的肽链的水解， 底物特异性很强。 1 3 6 2a c e 抑制肽的食物来源 a c e 抑制肽的食物来源广泛，从陆生动植物，到海洋生物资源都存在，且 我国目前的生物蛋白资源总量在世界各国名列前茅，丰富廉价的动植物蛋白 资源及食品加工过程中产生的大量的下脚料，尤其是现在水产品加工过程中 富含大量蛋白的下脚料，从而为a c e i 的生产提供广阔的原料来源。在以天然、 健康为主题的今天，人们越来越倾向于预防保健和食疗，因此来源于食品的 降血压肽，具有巨大的潜在市场。 1 4 酶促反应动力学 酶促反应动力学( k i n e t i c so fe n z y m e c a t a l y z e dr e a c t i o n s ) 是研究酶促 反应速度及其影响因素的科学。这些因素主要包括酶的浓度、底物的浓度、p h 、 温度、挪制剂和激活剂等。在研究某一因素对酶促反应速度的影响时，应该维 持反应中其它因素不变，而只改变要研究的因素。 i 5 本文研究的主要内容与意义 i 5 i 本文研究的主要内容 1 酶解底物珠蛋白提取条件的优化 2 以珠蛋白为反应底物，采用胃蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋 白酶进行酶解试验，考察反应温度、p h 、反应时间、加酶量与底物浓度等因素 对蛋白酶制备a c e 抑制肽过程中酶解液水解度影响；以及酶解后的珠蛋白多肽 对a c e 的抑制作用。期望能够从多种蛋白酶中选取具有高水解能力及产生高 8 a c e 抑制活性的蛋白酶。 3 分别用胃蛋白酶和碱性蛋白酶组合、碱性蛋白酶和胃蛋白酶组合、胃蛋 白酶和木瓜蛋白酶组合、胃蛋白酶和胰蛋白酶组合、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶 组合及碱性蛋白酶和胰蛋白酶的组合分别水解珠蛋白，考察反应温度、d h 、反 应时间、加酶量与底物浓度等因素对蛋白酶制备a c e 抑制肽过程中酶解液水解 度影响。 4 分别对胃蛋自酶( 动物蛋白酶) 、碱性蛋白酶( 微生物蛋自酶) 、木瓜蛋 白酶( 植物蛋白酶) 及各种双酶组合水解珠蛋白的酶解动力学进行研究。 1 5 2 本文研究的意义 自1 9 9 3 年以来，我国肉类产量一直处于世界第一，其中生猪产量接近世界 总量的二分之一，是世界上的养猪大国。据资料报道，我国每年可得猪血2 5 - 3 亿公斤”。然而，我国大多数肉类屠宰场中，猪血利用率极低：只有少数屠宰 场用猪血浆制作血豆腐等，猪血球基本上被废弃。本研究对猪血球中分离的珠 蛋白进行酶解，制备具有a c e 抑制性的活性多肽，变废为宝，对我国猪血的深加 工具有重要的意义。 第二章从猪血中提取珠蛋白和血红素工艺的研究 近年来，我国利用猪血资源开发的产品比较单调，除少部分加工成血粉或 发酵血粉作为饲料添加剂及用于生化制药外，大部分都作为废弃物排出，既污 染了环境，又浪费了蛋白资源【3 ”。因此，利用猪血将血红细胞分解为珠蛋白和 血红素，进而酶解成具有生物活性的肽类物质，对于食品工业和制药工业，将 满足人们对于功能性食品的需要，同时解决了生猪屠宰时猪血对环境的污染并 提高蛋白质资源的利用率p w 。 2 1 材料与方法 2 1 1 原料 新鲜猪血( 肥东县屠宰场) 2 1 2 主要试剂 柠檬酸三钠( a r ) 丙酮( a r ) 亚硫酸氢钠( a r ) 乙酸钠( a r ) 氯化钠 无水乙醇( a r ) 9 5 乙醇 乙酸 氯仿( a r ) 乙醚 氢氧化钾( a r ) 盐酸( a r ) 氢氧化钠( a r ) 乙二氨四乙酸二钠( a r ) 柠檬酸 葡萄糖 2 1 3 主要仪器 电子天平 电热恒温干燥箱 台式离心机 b e c k m a n 离心机 7 2 1 可见光分光光度计 酶标仪3 1 8 m c 中国宿州化学试剂有限公司安徽 中国宿州化学试剂有限公司安徽 合肥工业大学化学试剂厂 合肥工业大学化学试剂厂 合肥工业大学化学试剂厂 中国宿州化学试剂有限公司安徽 中国宿州化学试剂有限公司安徽 中国宿州化学试剂有限公司安徽 天津博郎生物试剂有限公司 中国宿州化学试剂有限公司安徽 合肥工业大学化学试剂厂 天津博郎生物试剂有限公司 合肥工业大学化学试剂厂 中国医药集团上海化学试剂公司 中国宿州化学试剂有