（食品科学专业论文）蓝莓及蓝莓酒中11种酚酸和5种黄烷3醇的RPHPLC法检测.pdf

摘要 本试验以吉林北下关生产的半高灌蓝莓北青( n o r t h b l u e ) 、北陆( n o r t h l a n d ) 、北村 ( 。n o r t h c o u n l a y ，) 和高灌蓝莓蓝丰( b l u e c r o p ) 果实及蓝莓酒发酵样为试材，使用l i c h r o s p h e r 1 0 0 r p 1 8 e 色谱柱( 2 5 0 x 4 0m mi d ，5u m ，m e m k ) 和保护柱i 心- 1 8 ( 1 0m m x 4m m ，m e r c k ) 对蓝莓果实及蓝莓酒发酵样中的1 1 种酚酸和5 种黄烷- 3 - 醇进行检测，建立了蓝莓果实和蓝莓酒 中1 1 种酚酸和5 种黄烷3 醇方便、快捷的检测方法。蓝莓果实1 1 种酚酸检测中，只有北陆检 出1 1 种酚酸，而其它三个品种中均无检出香草酸和p 香豆酸，在检出的酚酸中以绿原酸、龙胆 酸、阿魏酸含量较高，各酚酸的含量在品种间差异较大，但除北村外皆以对羟基肉桂酸类酚 酸为主。蓝莓酒1 1 种酚酸中含量最高的是绿原酸，在整个发酵期间占所检测总酚酸含量的8 0 以上，总酚酸含量在发酵初期呈上升趋势，在第8 天达到最大值，后呈减少趋势到发酵结束。5 种黄烷3 醇的检测中，4 个蓝莓品种均无检山表儿茶素没食子酸酯( e c g ) ，北青，北村，蓝 丰中含量最高的是表桔几茶素没食子酸酯( e g c g ) ，而北陆中含量最高的是表儿茶素( e c ) ， 结果表明各个蓝莓品种中的黄烷3 一醇含量比率均不相同，且含量较低。蓝莓果实的原花色素检测 结果显示，蓝莓中的原花色素含景较低，聚合度在1 3 之间。蓝莓酒的5 种黄烷3 醇检测中也无 检出e c g ，其他四种黄烷3 醇含量晟高的是e g c ，其次是e g c g ，在整个发酵过程中，这四种 黄烷3 醇的变化趋势都较为平缓。蓝莓其多酚物质和抗氧化性的相关性研究中，两者体现出极高 的相关性，总酚相关系数在0 9 5 以上，总花色苷的相关系数也在o 9 0 以上。 关键词：蓝莓，蓝莓酒，酚酸，黄烷3 醇，r p - h p l c ，抗氧化性 v i a b s t r a c t r p h p l cm e t h o d sf o rd e t e c t i o n 1 1s e l e c t e d p h e n o l i c a c i d sa n d5f l a v a n - 3 一o l si n 4 b l u e b e r r i e s ( n o r t h b l u e ，n o r t h l a n d ，n o r t h c o u n t r y ，b l u e c r o p ) a n df e r m e n t i n gb l u e b e r r yw i n e w e r ed e v e l o p e dw i t hl i c h r o s p h e r1 0 0 r p - 1 8 ec o l u m nc 2 5 0 x 4 0h i mi d ，5g m ，m e r c k ) a n dt h eg u a r d c o l u m nr p 1 8 ( 1 0m m x 4m m ，m a r e k ) t h er e s u rs h o w e dt h a ta l lo f1 1p h e n o l i ca c i d so n l yf o u n d n n o r t h l a n d a n dv a n i l l i ca c i da n dp - c o u m a r i ca c i dw e r en o tf o u n di no t h e rb l u e b e r r i e s ，c h l o r o g e n i ca c i d ， f e r u l i ca c i d ，g a n f i s i ca c i dw e r ep r e s e n ti nr e l a t i v e l yh i g l lc o n c e n t r a t i o n s t h ec o n c e n t r a t i o n so ft h e p h e n o l i ca c i d sw e r ed i f f e r e n ti nv a r i e t i e s ，b u tt h eh y d r o x y c i n n a m i ca c i dd e r i v a t i v e sw a st h em a j o r p h e n o l i ca c i di nt h eb l u e b e r r i e se x c e l o t n o r t h c o u n t r y i nb l u e b e r r yw i n ec h l o r o g e n i ca c i da c c o u t e df o r m o r et h a n8 0 o ft h et o t a lp h e n o l i ca c i d a n dt h ec o n t e n to ft o t a lp h e n o l i ca c i di n c r e a s e du n t i lt h e8 m d a yo ff e r m e n t i n ga n dd e c r e a s e dt ot h ee n do ff e r m e n t i n g f o rt h ef l a v a n - 3 - o l sd e t e c t i o n ，e g cw a s n o t f o u n di nt h e4v a r i e t i e so f b l u e b e r r r i e sa n de g c gh a dt h eh i g h e s tc o n c e n t r a t i o ni n3b l u e b e r r i e s ( n o r t h b l u e ，n o r t h c o u n t r y ，b l u e c r o p ) ，b u t e ch a dt h e h i 曲c o n c e n t r a t i o ni n n o r t h l a n d i n b l u e b e r r yw i n ee c gw a sn o tf o u n de i t h e r , a n dt h ec h a n g e so ft h e4f l a v a n - 3 - o l sw e r en o tr e m a r k a b l e d u r i n gb l u e b e r r y w i n ef e r m e n t i n g f o rt h ep r o a n t h o c y a n i d i nr e s e a r c h ，t h ep o l y m e r i z ed e g r e ea n d c o n c e n t r a t i o no fp r o a n t h o c y a n i d i nw e r er e l a t i v e l yl o wi nb l u e b e r r yf r u i t s i nt h i sr e s e a r c h ，i ts h o w e da h i g hc o r r e l a t i o nc o e f f i c i a n c tr e l a t i o n s h i pb e t w e e na n t i o x i d a n tc a p a c 时a n dp h e n o l i c s k e y w o r d s ：b l u e b e r r i e s ，b l u e b e r r yw i n e ，p h e n o l i ca c i d s ，f l a v a n - 3 一o l s ，r p - h p l c ，a n t i o x i d a n tc a p a c i t y v i i 简写 c d p p h d r e c e c g e g c e g c g h p l c m l n o r a c t c a t b a 缩略语表 英文名称 ( + ) - c a t e c h i n a ，- d i p h e n y l - d - p i c r y l h y d r a z y l ， d 一2 - d e o x y r i b o s e ( 一) - e p i c a t e c h i n ( - ) - e p i c a t e c h i ng a l l a t e ， ( 一) 一e p i g a l l o e a t e c h i n ( 一) 一e p i g a l l o e a t e c h i ng a l l a t e h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h m i n u t e o x y g e nr a d i c a la b o r b _ n gc a p a c i t y t r i c h l o r o a c e t i ca c i d t h i o b a r b i t u r i ca c i d v 中文名称 儿茶素 二苯代苦味肼 2 一脱氧d 核糖 表儿茶素 表儿茶素没食子酸酯 表没食子儿茶素 表没食子儿茶素没食子酸酯 高效液相色谱 分钟 氧自由基吸收能力 三氯乙酸 硫代巴比妥酸 独创性声明 y - 簋濑蔓6 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：翁、易华 时间：z 年占月，z 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：笥兮乏耸 时间：砷口年占月，日 导师 i i 慨洲r 略 中国农业大学硕士论文 第一章绪论 第一章绪论 1 蓝莓介绍 1 1 蓝莓的营养价值及经济地位 蓝莓( e r i c a c e a ev a c c i n i u ml ，b l u e b e r r y ) 通常称为越橘果( h u c k l e b e r r y ) ，原产北美及我 国长自山与大小兴安岭，据估算，大概已有1 3 0 0 0 年历史，是最古老的水果之一。蓝莓为多年生 落叶或常绿果树，早灌木，果实为浆果。蓝莓果实呈蓝色，近圆形，单果重0 5 2 5g ，最大可达 3 5 5 0g ，果肉细腻，种子极小，甜酸适度，且具有香爽宜人的香气，可鲜食，也可加工成果汁 饮料、果酱、果酒饮品。 蓝莓果实营养丰富，含糖在8 1 1 ，总酸2 2 5 ，含有1 6 种氨基酸，维生素c 、维生素b l 、维 生素b 2 、维生素b 6 、维生素p 等多种维生素，大量的微量元素，并含有丰富的酚酸、黄烷醇、花 色素苷、类黄酮等酚类化合物。据我国对从美国引进的1 4 个品种的蓝莓果实分析测定，每百克蓝 莓鲜果中含蛋白质4 0 0 - 7 0m g 、脂肪5 0 0 - 6 0 0m g 、碳水化合物1 2 3 - 1 5 3m g ，s o d5 3 9 国际单位， 维生素含量高于其他水果，其中维生素a 高达8 1 1 0 0 国际单位、维生素e 为2 7 9 5u g ，微量元素也 很高，每克鲜果中含钙2 2 0 - 9 2 0 雌、磷9 8 - 2 7 4 峙、镁1 1 4 - 2 4 9 呜、锌21 4 3 峙、铁7 6 - 3 00 鹏、锗 o 8 - 1 2p , g 、铜2 0 - 3 2 岭( 李亚东，2 0 0 1 ) 。 蓝莓栽培的历史不到1 0 0 年，最早始于美国。全世界越桔属植物约有4 0 0 余种，1 9 0 6 年美国人 考夫莱( e v c o v i n e ) 首先开始野生蓝莓的选种工作( 李亚东，2 0 0 1 ) 。经过3 0 多年的选种选育，他 将选育出的1 5 个蓝莓品种进行商业性栽培。到2 0 世纪8 0 年代末，美国已选育出适合各地气候条件 栽培的优良品种1 0 0 多个，这些后来成为美国南部、东部、北部各洲蓝莓产区的主要品种。继美 国之后，世界各国竞相引种栽培蓝莓，其中以欧洲、澳洲、大洋洲、日本等发达国家和地区为主， 经过不断的发展，这些地区的蓝莓栽培相继进入商业性栽培和生产阶段。北美蓝莓由于经过几十 年的改良，无论在口味及产量上都远比野生蓝莓好，我国也在2 0 年前开始引进国外品种，到现在 已经在东北地区形成了几个较大的蓝莓育种、生产基地。随着蓝莓育种、栽培的推广，国内市场 上除了鲜食蓝莓外也出现了较多的蓝莓产品蓝莓果酱、蓝莓保健品、蓝莓饮料、蓝莓护肤品 等生活化工用品，蓝莓作为一个新兴的高档水果在国内正在蓬勃发展。 1 2 蓝莓的保健功能研究 蓝莓的传统保健功能备受关注，根据美国农业部( u s d a ) 对2 4 种水果、2 3 种蔬菜、1 0 种坚 果、4 种于果、1 6 种药草和香料的研究表明蓝莓是最具有抗氧化性能的食品( w ue ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 蓝莓强大的抗氧化能力可以防止自由基对胶原质的损坏，进而保护皮肤、关节以及血管系统的完 整性。随着现代营养保健研究技术的发展，蓝莓的保健机理也将进一步明确。蓝莓的保健功能丰 富，现在已经报道主要有以f 几个方面： 1 2 1 降血压、血脂，保护血管结构功f l l n o r t o n 等( 2 0 0 5 ) 研究发现蓝莓提取物可以防i r 低 密度脂蛋白( l d l ) 的氧化，减少血小扳的凝集，减少炎症，保护细胞内膜的正常功能。野生蓝 中国农业大学硕士论文 第一章绪论 莓可以用于调整血压，并且在心血管疾病上具有治疗功能。研究也发现蓝莓具有保护毛细血管， 降低胆固醇( r i m a n d oe ta 1 ，2 0 0 4 ；2 0 0 5 ) ，预防血栓的形成及动脉硬化，抗血管增生，防止内皮瘤 细胞演变成血管瘤( m u s t a f a e ta 1 ，2 0 0 3 ) 的功效。 1 2 2 改善记忆能力，逆转脑衰老：给老鼠高剂量地饲喂蓝莓，通过对老鼠的学习、认知以 及动作平衡等指标的观察统计，发现蓝莓对年龄相关的记忆衰退具有改善作用( r a m i r e ze ta 1 ， 2 0 0 5 ：a n d r e s l a c u e v a e ta 1 ，2 0 0 5 ；j o s e p he ta 1 ，1 9 9 9 ) 。同时，蓝莓可以改善脑部血流循环防止 脑肌肉萎缩( w a n ge ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 1 2 3 改善听力：r i v e r a 等( 2 0 0 5 ) 通过给成年老鼠饲喂蓝莓，发现该组老鼠的大脑听力皮层 明显优于对照组，和年青组的老鼠相似。 1 2 4 具有抗癌作用：早期的研究发现蓝莓中的提取物在治疗肿瘤平u 癌症上有一定效果 ( k a p a d i a e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。而最新的研究发现蓝莓中的类黄酮可以在一定程度上防止癌症细胞的扩 散转移( m a t c h e t t ，2 0 0 5 ) ，同时蓝莓提取物可以控制不必要的细胞分裂( y ie ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 1 2 5 保护视力，治疗青光眼：早在二战时期，法国研究者就通过让飞行员食用蓝莓来提高 夜视力和对强光伤害的恢复能力。而近代的研究发现，服用蓝莓提取物可以降低眼压，对青光眼 有一定的治疗作用( n oa u t h o r s ，2 0 0 1 ) 。 1 2 6 抗菌消炎的作用：v a a e m 等( 2 0 0 5 ) 阐述螺旋幽门杆菌是消化系统溃疡和心血管疾病的 重要病原体，野生蓝莓提取物辅助蔓越橘提取物是食物治疗螺旋菌幽门杆菌感染及相关氧化疾病 的一个重要方法。同时蓝莓提取物可以治疗大肠杆菌及其它菌类引起的妇科泌尿系统疾病( z a f r i r i e ta 1 ，1 9 8 9 ) 。 1 ，2 7 保护心血管，防止中风：在y o u d i m 等( 2 0 0 2 ) 的研究中指出，氧化胁迫引起的炎症是 心血管疾病的主要因素之一，蓝莓中的花色苷和酚酸物质具有针对h 2 0 2 、t n f 的抗氧化性和抗发 炎能力，可以降低氧化对心血管内膜的损伤，同时监莓可以在发炎和氧化部位诱导抗炎因子，补 充内皮氧化发炎部位的白衄球，从而减轻由于年龄增加引发的心血管疾病。 1 2 8 抗辐射及其引起的衰老：r a b i n 等( 2 0 0 2 ) 用放射性物质处理小鼠，模拟小鼠机体衰老， 发现用蓝莓提取物这类含抗氧化物质较多的饲料饲养小鼠，可以减缓小鼠因放射性物质引起的影 响神经的化学物质的变化以及行为上的异常。 1 2 9 防止热环境运动引起的自由基损伤：s t e v e n 等( 2 0 0 4 ) 对运动后的血样中的p l a s m a f 2 i s o p f o s t a n e s 和脂膜的抗氧化性分析研究发现，蓝莓可以缓解在热环境中运动产生的氧化胁迫， 防止运动员在热环境运动产生的伤害。 2 蓝莓多酚及其抗氧化性的研究进展 蓝莓是撮有抗氧化功能的营养物质( p r i o re ta 1 ，1 9 9 8 ；w ue ta 1 ，2 0 0 4 ) ，具有相当高的自由 基消除能力( r o s s i ，2 0 0 3 ) ，相关研究显示蓝莓的抗氧化性和其丰富的多酚物质密切相关( z h e n g e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。植物多酚是经苯丙烷类代谢和类黄酮代谢途径产生的一人类次生代谢产物，包括 酚酸( p h e n o l i ca c i d ) 、黄酮类( f l a v o n e ) 、黄酮醇类( f l a v o n 0 1 ) 、黄烷醇类) h 茶素类( f l a v a n o l c a t e c h i n ) 、黄烷酮类( f l a v a n o n e ) 、黄烷酮醇类( f l a v a n o n 0 1 ) 、花色苷类( a n t h o c y a n i n ) 、原花 2 中国农业大学硕士论文 第一章绪论 色素( p r o a n t h o c y a n i d i n ) 、白藜芦醇( s t i l b e n e ) 、木质素( l i g n i n ) 等( h o l l m a na n d a r t s ，2 0 0 0 ： h o l l m a n ，2 0 0 1 ) 。大量研究证明，多酚类物质( p l o y p h e n 0 1 ) 具有极强的抗氧化功能。随着现代 检测技术的发展和对蓝莓抗氧化性能研究的深入，针对蓝莓多酚的研究也在不断深化。蓝莓中检 测最早、研究最多的是花色苷，早在7 0 年代就有人对花色苷进行相关的研究，现在已经检测出蓝 莓中飞燕草、花青素、矮牵牛素、芍药素、锦葵素对应的葡萄糖、半乳糖、鼠李糖三种糖苷形式 以及其他一些结合态的2 5 种花色苷( k a d e re ta 1 ，1 9 9 6 ；z h a n ge ta 1 ，2 0 0 3 ) 。花色苷含量最高的 是b 燕草3 半乳糖苷、锦葵素3 葡萄糖苷和锦葵素一3 鼠李糖苷，含景最少的为芍药素3 半乳糖 苷仅为0 1 m l o o g f w 。对k a e m p f e r o l 、q u e r c e t i n 、m y r i c e t i n 这三个黄酮醇的检测也比较多，并且 在大部分品种都有检出( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 3 ；h a k k i n e ne ta 1 ，1 9 9 9 ；2 0 0 0 ；b i l y ke ta 1 1 9 9 6 ) ， 其z h a n g 等( 2 0 0 3 ) 对上述三种的黄酮醇的糖苷形式进行了检测，同时检测出绿原酸是蓝莓内 主要酚酸类物质。对于酚酸，z a d e m o w s k i 等( 2 0 0 5 ) 用g c m s 检测了蓝莓等小浆果中的2 0 种酚 酸物质，a y a z 等( 2 0 0 5 ) 用h p l c - m s 对一个小品种蓝莓中的自由酚酸、糖苷结合态、非糖结合 态以及酯结合态类的1 9 种酚酸形式进行了检测。对于蓝莓中少数黄烷醇和原花色素含量、聚合度 检测也有相关的报道( p i o re ta 1 ，2 0 0 1 ；g ue ta 1 ，2 0 0 2 ：s e l l a p p a ne ta 1 ，2 0 0 2 ：u s d a ，2 0 0 4 ) 。 但是各报道中各品种间含量差异较大，甚至同一品种同一气候环境下栽培方式不同黄烷醇含量也 会有较大差异( s e l l a p p a ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 虽然目前检测的蓝莓中的酚酸品种已经比较多( z a d e m o w s k ie ta 1 2 0 0 5 ：a y a ze ta 1 2 0 0 5 ) ， 但z a d e m o w s k i 等( 2 0 0 5 ) 的1 9 种酚酸g c - m s 检测体系中没有包括报道中含量最高的绿原酸，而 a y a z ( 2 0 0 5 ) 虽然用内标法建立的1 8 种酚酸的h p l c m s 铆i 定体系，但是这两种检测方法对仪器 要求较高。本试验选用的1 1 种酚酸为植物中常见的酚酸，同时包括了已经报道的蓝莓中儿种含量 比较高的酚酸，对蓝莓酚酸的h p l c 检测有实用价值。黄烷3 一醇是这两年来比较受关注的类黄酮 物质，本试验选用5 种黄烷3 醇单体，对蓝莓中的黄烷3 醇单体及其衍生物，进行了比较全面的 检测。 2 1 酚酸的保健功能和检测方法研究 酚酸是一类广泛存在于植物体内的次生代谢产物，包括自由态、酯结合态、糖结合态、非糖 结合态，但人部分以与葡萄糖、酒石酸、蛋白、类黄酮结合的形式存在。这类化合物具有一个苯 核( 见图1 1 ，表1 1 ) ，主要为对羟基苯甲酸和对羟基肉桂酸的衍生物，根据苯环上的c 原子数分 作三类：( 1 ) c 6 c 0 型，如：原儿茶酸、没食子酸等；( 2 ) c 6 c 1 型，如：3 羟基苯乙酸；( 3 ) c 6 c 3 型， 如：咖啡酸、阿魏酸、介子酸等。 酚酸与食品色泽等感观品质评价及营养和抗氧化性密切相关( h e r r m a n ne ta 1 ，1 9 8 9 ： b a r b e r a na n de s p i n ，2 0 0 1 ) ，而且酚酸也影响着食品的风味、收敛性和硬度( p e l e ge ta 1 ，1 9 9 1 ： b a j b u e n ae ta 1 ，1 9 9 2 ；t a ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。酚酸所具有的抗氧化功能，主要是由其苯环单元所决 定的。酚酸的抗氧化机理，主要与其清除自由基和活性氧的能力相关( e v a n se ta 1 ，1 9 9 5 ；c h a l a s e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。酚酸芳香环上的取代基的不同影响着酚酸的抗氧化性活性，对自由、酯结合态、 糖结合态、非糖结合态的酚酸的抗氧化性的评价已有研究报道( s h a h i d ia n dw a n a s u n d a r a ，1 9 9 2 ) 。 中国农业大学硕士论文 第一章绪论 也有大量有关酚酸类物质提高生物体抗氧化性的实验报道( n a r d i n ie ta 1 ，1 9 9 7 ；m o r o ne ta 1 ， 2 0 0 0 ：r e c h n e re ta 1 ，2 0 0 1 ) 。如绿原酸是人类膳食中一种有效的抗氧化剂，它属于一种酚型抗 氧化剂，c h u n g 和k i m ( 1 9 9 6 ) 报道绿原酸的抗氧化能力要强于咖啡酸、对羟基苯甲酸、阿魏 酸、丁香酸，同传统的抗氧化剂相比，绿原酸与基羟基甲苯( b h t ) 的抗氧化能力相当，但 是要比丁基羟基茴香醚( b h a ) 、生育酚的抗氧化能力强( e v a n se ta 1 ，1 9 9 5 ) 。但对酚酸类物质 在生物体内的抗氧化性或保护机理目前尚不清楚。 酚酸在人类摄入总酚中占1 ，3 左右，而对酚酸类物质的营养学功能研究，只是在近年来才引起 关注。现代相关研究表明食品中的酚酸类物质是一类与人们生活密切相关，具有利胆、抗菌、降 压、增高白血球、兴奋中枢神经系统、清除体内d p p h 自由基、预防心血管疾病、糖尿病和某些 癌症等多种药理作用的一种生物活性物质，对人体的健康具有保健作用( e v a n se ta 1 ，1 9 9 7 ； r b e n z o n i ca c i d 艮 r - c 0 0 7 o h t r a n s c i n n a m i ca c i d c h l o r o g e n i ca c i d 图1 1 几种酚酸结构示意图 f i g 1 1s t r u c t u r eo f s e v e r a lp h e n o l i ca c i d s 表1 1 几种酚酸结构表 1 曲l e11s t n l c t u r e so f p h c n o l i ca c i d s 4 中国农业大学硕士论文第一章绪论 l o d o v i c ie ta 1 ，2 0 0 1 ) 。咖啡酸与人体免疫调节功能，哮喘病和过敏反应密切相关( k o s h i h a r ae ta 1 ， 1 9 8 4 ) ，咖啡酸和其酯类物质如咖啡酸苯乙酯可能具有抗肿瘤活性。能抑制致癌基因的表现( r a n e ta 1 ，1 9 9 3 ；o l t h o f e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。绿原酸可通过降低致癌物的利用率及其在肝脏中的运输来达到 防癌、抗癌的效果，对大肠癌、肝癌和喉癌也具有显著的抑制作用( t a n a k ae t a l 1 9 9 3 ) 。a p 1 因 子是一个控制炎症、细胞分化、发育的激活启动蛋白，最近研究发现，酚酸还可以抑制a p 1 转录 因子的活性( c a p e y r o ne t a l ，2 0 0 1 ) 。绿原酸、咖啡酸的衍生物可以选择性的抑制人体免疫缺乏 病毒1 ( h i v - 1 ) 整合酶的活性，从而在治疗和预防艾滋病毒感染具有一定的效果( k i n ge t a l ，1 9 9 9 ) 。 目前对。r 酚酸在生物体内的吸收机理、抗病机理及何种形式的酚酸( 游离或结合态) 生物活性更 强都知之甚少。因此，酚酸及其衍生物的抗病毒功能及其机理研究已成为当前营养学研究的热点。 而这些营养学上的研究又必将促进对食品中酚酸含量和存在形式及对酚酸分析测定方法的研究。 酚酸的分析测定方法有纸层析法( p c ) ，薄层色谱法( t l c ) ，高效液相色谱法( h p l c ) ，高 效毛细管电泳法( h p c e ) ，气相色谱法( g c ) 以及液质( h p l c m s ) 、气质联用等( g c m s ) 。各 种分析方法各有其优缺点：紫外吸收法简单易行，但是由于样品中酚类物质复杂，在相同波k 下 酚酸和其他酚类物质均有较强的吸收，因此测定值一般偏高；薄层层析法( t l c ) 在分离效果、 速度、定量准确度等方面存在缺陷；气相色谱法( g c ) 测定速度快，灵敏度高，但该方法需衍 生化处理，前处理比较繁琐，且不适于火分子质量物质；高效毛细管电泳法( h p c e ) 是目前发 展较快的一种分离新技术，它存在分离效率高、进样量少、分析时间短、柱不易受污染，检测极 限低的优点，但是它重现性较差、线性范围窄和灵敏度较低( d r e h e ra n dh o l m ，1 9 8 3 ) 。反相高 效液相色谱法( r p - h p l c ) 采用甲醇、乙腈、水和乙酸等极性溶剂作为流动相，用于分离测定酚 酸类化合物时分离效果显著、灵敏度高和重复性好( h a j n o s e ta 1 ，1 9 9 8 ) ，但h p l c 法测定酚酸时 的不足之处是色谱柱容易污染、分离效率低。针对酚酸类化合物的h p l c 分析工作已有较多报道， 涉及固定相、流动相、p h 值、柱温、流速、不同检测器等因子对酚酸类化合物保留行为和分离效 果的影响( g u i l l e ne ta 1 ，1 9 9 6 ；h a k k i n e ne la 1 ，1 9 9 8 ) 。g u u l e n 等( 1 9 9 6 ) 通过对色谱柱和洗脱 程序的选择优化，使2 5 种酚类物质标准品在6 0 m i n l 勾得到了较好的分离，其中包括1 5 种酚酸类物 质：r o b b i n s 取i b e a n ( 2 0 0 4 ) 通过对6 种色谱柱的选择，在7 0m i n 内使1 6 种酚酸得到了较好的分离； h a k k i n e n 等( 1 9 9 8 ) 通过对样品提取和色谱柱的选择优化，建立了同时测定草莓和黑穗醋栗果实 中6 种酚酸的高效液相色谱法； m a t t i l a i k u m p u l a n i n e n ( 2 0 0 2 ) 建立了一种适合测定包括马铃 薯、苹果、草莓等在内的多种食品中1 4 种酚酸的高效液相色谱法。这些h p l c 测定法由于样品处 理、仪器、柱型、流动相和流速等分析条件的差异，所得出的酚酸的分离效果和保留时间也都不 尽相同，有的甚至相差较大。近年来，随着仪器分析和计算机技术的发展，高效液相色谱一质谱 联用( h p l c - m s ) ，气相色谱一质谱联用( g c m s ) 技术在分析和鉴定植物组织中的酚酸及其衍 生物过程中也得到了广泛的应用：z a d e m o w s k i 等( 2 0 0 5 ) 用g c m s 检测了蓝莓等小浆果中的1 9 种酚酸，a y a z 等( 2 0 0 5 ) 用h p l c - m s 对一个小品种蓝莓中的自由酚酸、糖苷结合态、非糖结合 态以及酯结合态类的1 8 种酚酸形式进行了检测。 在h p l c 检测中，样品的前处理对酚类定量测定非常重要。在前处理中一般对液态样品如 酒、澄清果汁处理要尽量简化，以减少中间的损失，常对液态样品进行二乙醚、乙酸乙酯萃取， 而经o 4 5 微米有机膜过滤后直接进样也能获得较好的测定效果。果实中的酚酸大都以结合态的 中国农业大学硕士论文 第一章绪论 形式存在，通常需要经过水解后才能将它们释放到提取液中( h a k k i n e ne ta 1 ，1 9 9 8 ：1 9 9 9 ) ， 乙酸乙酯、二乙醚及甲醇等有机溶剂都可高效提取植物组织中的酚酸。固相微萃取( s p e ) 可 以浓缩和纯化提取液中的酚酸( g l o w n i a ke ta 1 ，1 9 9 6 ) 。在提取液中加入抗坏血酸和乙二胺四 乙酸( e d l l a ) 可以防止果实前处理过程中酚酸的氧化( n a r d i n ie ta 1 ，2 0 0 2 ；2 0 0 4 ) 。 2 2 黄烷3 醇的保健功能和检测方法研究 黄烷3 醇广一泛分布于许多植物的果实、叫片和种子中。现在研究较多的茶多酚、葡萄籽多 酚中，黄烷3 醇也是其研究重点。黄烷3 醇均具有共同的母核，即2 苯基氧杂蔡。其结构相似、 分子量相近、极性相仿。常见的有以下儿种类型( 图1 2 ) 。 c a t 哎。 o h 、h0 e c ：r = h e g c ：r = o h 围1 25 种黄烷- 3 - 醇结构示意图 f i g1 2s t m c m r e so f 5f l a n v a n - 3 一o l s o h e c g ：r = - i e g c g ：r = o h 黄烷3 醇具有极强的抗氧化能力( g u e n d e ze ta 1 ，2 0 0 5 ；p a n n a l ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 能够有效地 清除体内自由基，抑制低密度脂蛋白氧化，梁钢等( 1 9 9 8 ) 对茶叶中的的e c g c ，e c ，e c g 研 究发现，这三种黄烷3 醇对vi t c - n a d p h 和f e ”，半胱氨酸两种自由基诱发系统诱发的大鼠脑、 肝、肾微粒体脂质过氧化均有显著抑制作用，以e g c g 作用最强，约是抗氧化剂v e 的1 0 0 倍， v e r s t r a e t e n ( 2 0 0 3 ) 研究表明黄烷3 醇可以减少细胞膜脂的氧化，并且保护细胞膜的双分子层。黄 烷3 醇的生理保健功能丰富，它具有抗菌、抗病毒( y ee ta 1 ，19 9 9 ；g o n z a l e z - p a r a m a se ta 1 ， 2 0 0 4 ) 、抗癌( s a n t o s b u e l g aa n ds c a l b e r te ta 1 ，2 0 0 0 ；f u k a ie t a l ，2 0 0 0 ；k a m p a e t a l ，2 0 0 0 ； g o n z a l e z - p a r a m a se ta 1 ，2 0 0 4 ) 、抗发炎( f e r r a n d i za n da l e a r a z ，1 9 9 1 ；p e l z e re ta 1 ，1 9 9 8 ； b e e c h e r - g a r ye ta 1 ，2 0 0 4 ) 、抗血栓( s a n oe ta 1 ，2 0 0 5 ) 、抗自由基( b o r sa n dm i c h e le ta 1 ，1 9 9 9 ： b e e c h e r - g a r ye ta 1 ，2 0 0 4 ；g u e n d e ze ta 1 ，2 0 0 5 ) 、心血管保护作用( d e l l a g le ta 1 ，2 0 0 4 ；r a s m u s s e n e ta 1 ，2 0 0 5 ) 等功效。黄烷3 醇及其衍生物还具有显著的药理学功能，是中药植物中的功效成 分，研究表明，该类化合物能够被迅速的吸收( h o l l m a na n d a r t se ta 1 ，2 0 0 0 ) 。口服c a t 、e g c g 、 e g c 、e c 后，分别于2 、0 5 qh 、l 2h 、1 4 2 6h 小时内血清中的含量达到最高( g i l e sa n d g u m m a ，1 9 7 3 ；y a n g e ta 1 ，1 9 9 8 ；v a n h e t h o f c t a l ，1 9 9 8 ；k i v i t se ta t ，1 9 9 7 ；m a i a n ie ta 1 ， 1 9 9 7 ：n a k a g a w a a n d m i y a z a w ae ta 1 ，1 9 9 7 ；l e ee ta 1 ，1 9 9 5 ) ；z h a n 等( 1 9 9 7 ) 研究表明富含 6 洲o 盥 驴 中国农业大学硕士论文第一章雏论 e c 的绿茶能够保护哺乳细胞免受自由基介导的氧化胁迫及程序性死亡；纯体e g c g 可以抑止 小鼠肉瘤1 8 0 细胞( s - 1 8 0 ) 和小鼠肝癌细胞( h o p ) 活性，或者使之失活，体现了一定的抗肿 瘤作用，同时能延缓免疫器官衰退( 梁钢等，2 0 0 0 ) 。此外，传统上用于治疗发炎的中草药，如 a t u n ar a c e m o s a 等，均含有高水平的c a t 及其衍生物( n o r e e ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 黄烷3 醇均具有共同的2 苯基氧杂萘母核，其结构相似、分子量相近、极性相仿，这使得 分离十分困难。再加上植物中其它多酚物质非常多，干扰大，使得黄烷一3 醇单体分离及测定非 常困难。长期以来，形成了许多种测定方法。最初，食品中的黄烷3 醇多采用化学比色法测定 ( s a r k a ra n dh o w a r t h ，1 9 7 6 ；r o b a r d sa r ma n t o l o v i c h ，1 9 9 7 ) ，但由于这类试剂不仅仅与黄烷醇 类发生反应，因而在没有结合较好的前处理分离技术的前提。r ，所得数值常常偏高( h o l l m a na n d a r t s ，2 0 0 0 ) 。随着分离检测技术的发展，h p l c 法已经成为多酚测定中的主要方法。许多学者 利用h p l c 对食品中的黄烷3 醇进行了测定( a c l l i l l ie ta 1 ，1 9 9 3 ：k e n n e d y a n d t a y l o r ，2 0 0 3 ； y a n a g i d ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。同时，为了减少或消除其它酚类物质对测定的干扰，多首先采用色谱柱， 如聚酰胺柱( m o n a g a se t a l ，2 0 0 3 ) 、c 1 8s o p p a k 柱( s u ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 等，对样品进行分离、 浓缩或对提取方法加以改进( p i n e i r oe t a l ，2 0 0 4 ) 后，采用h p l c 法对其进行定量分析。 前人采用高效液相色谱( h p l c ) 法对葡萄种子( k e n n e d ye ta 1 ，2 0 0 0 a ) 、果实( k e n n e d ye t a 1 ，2 0 0 0 b ；m o n a g a se ta 1 ，2 0 0 3 ；i b e m g 6 m e ze ta 1 ，2 0 0 2 ) 、葡萄酒( s u ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 及酿 造过程( s u n ，1 9 9 9 ) 中的黄烷- 3 一醇单体含量进行了测定。结果表明，葡萄果实和葡萄酒中均 含有c 、e c 和e c g ，但是，未能证实是否同时存在e g c 和e g c g 。最近，p a r k 等( 2 0 0 4 ) 研 究表明，茶幼叶中含有e g c 、e c 、e g c 、e g c g 和e c g 。但也未能同时将五种黄烷3 醇，即 c 、e g c 、e g c g 、e c 、e c g 进行分离和测定。这可能与所用试材、前处理方法及色谱条件有 关。g o n z a l e z - m a n z a n o 等( 2 0 0 4 ) 年对葡萄和葡萄酒的黄烷- 3 - 醇进行检测，在发酵1 0 天后的 酒中检出g c 、e g c 、c 、e c ，e c g 、p m c y a n i d m sb 1 b 4 、p r o d e l p h i n d i n s 。但是蓝莓中的对较 多黄烷- 3 - 醇单体的检测还较为稀少，本试验将同时对蓝莓以及蓝莓酒五种黄烷3 醇单体e g c 、 e c 、e g c ，e g c g 和e c g 进行分离和测定。 3 研究意义 蓝莓是一种营养丰富、具有多种保健功能的水果，具有很高的经济价值，我国的蓝莓产业 也正发展。本试验以北青( n o r t h b l u e ) 、北陆( n o r t h l a n d ) 、北村( n o r t h c o u n t r y ) 和蓝 丰( b l u e c r o p ) 四个品种蓝莓以及蓝莓酒为试材，通过对蓝莓果实和蓝莓加工产品之一蓝莓 酒中1 1 种酚酸以及5 种黄烷3 醇检测方法以及抗氧化性的研究，为进一步研究蓝莓果实和其 加工产品的保健功能提供相关理论依据。 7 中国农业大学硕士学位论文第二章蓝莓果实及蓝莓酒中儿种酚酸的r p - h p l c 检测 第二章蓝莓果实及蓝莓酒中l1 种酚酸的r p h p l c 检测 摘要：以四个蓝莓品种北青( n o r t h b l u e ) 、北陆( n o r t h l a n d ) 、北村( n o r t h c o u n t r y ) 、 蓝丰( b l u e c r o p ) 果实以及蓝莓酒发酵样为试材，采用反相高效液相色谱法，甲醇：乙酸： 水( a 项1 0 ：2 ：8 8 ；b 项9 0 ：2 ：8 ) 混合液为流动项，流速1m l m i n ，柱温3 0 ，梯度洗 脱，建立了蓝莓果实及蓝莓酒1 1 种酚酸的检测方法。测定结果表明：绿原酸、龙胆酸、阿魏酸 是该四个品种蓝莓的主要酚酸；其中北青含量最高的是阿魏酸和绿原酸，北村含量最高的是 龙胆酸，北陆的主要酚酸是绿原酸和阿魏酸，同时这两种酚酸含量是其它品种中的两倍，蓝 丰的主要酚酸是阿魏酸；蓝莓酒中以羟基肉桂酸为主，其中绿原酸含量最高总酚酸含量随着 发酵的进行有一个先升高而后降低的变化。 关键词：蓝莓，蓝莓酒，反相高效液相色谱，酚酸 r p h p l cm e