（生物化学与分子生物学专业论文）dagpkc信号转导途径调控机制的初步研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：虹 签字日期：堕年量月量日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、 使爰学位论文戆裁定，曩意大连医辩大学绦馨并囊警家有关部f - 】或枫 构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 疼送行检索，可以采爨影印、缩印或扫接等笺崩手段保存、汇缡学位 论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 签字基赣：旌年上胃土嚣 d a g p k c 信号转导途径调控褫制豹初步研究 博士磺究生：李驻蔼 指导教师：燕秋教授 专业名称：生萼夯化学与分子生物学 攘要 d a g p k c 痿号转导遗路奁缨魏内信号调控潮终孛其毒重要终翅，是 参与细胞嫩长、增殖、分裂调控的重黉信号邋路之一，并广泛分布于备 秘缀缀缨熬。本磷究王终溪察e 粪糖及p e m t 2 过表达鼹d a g p k c 信号转导谂径的调控作用。 l e 寡糖对d a g p k c 售号转导途较戆谖撩撵媛鹣龌究 哺乳动物胚胎着床怒生殖的关键环节，涉及胚胎与予茸之间所发生 豹嚣步协调豹一篆列变他。近年来载磷究表明，l 、甄子富内貘上皮缨貔 表两的l e w i s 寡糖在胚胎着床过程中疑有重鞭作用。l e w i s 寡糖是岩藻糖 化弱巍糖系烈赛羲，包括h 1 、h 2 、l e 8 、l e “、l e 。、s l e l 鞠l e 等。其 中，h 1 、l e 。、s l e 。和l e y 在胚胎着床期呈阶段特异性表达，与胚胎发 育及羞床密甥相关。体肉子富腔注射l e 7 特异携体、体外熬培养模型中 加入l e y 特异抗体以封闭子宫内膜表短的l e y 均可明显抑制胚胎着床， 但其馋用枧理和波达调控枫铡爨兹所知甚少。 核酸和蛋白质的合成均需模板来决定其核苷酸或氨罄酸的排列顺 序，恧糖链的台成却没诲模扳，它是出一系列具有麓度特舞性的糖基转 移酶的倦化作用来完成。岩藻糖化寡糖的台成怒由岩藻糖基转移酶 ( f u c o s y l t r a n f e r a s e s ，f u t s ) 催化的。因此，岩藻糖基转移酶的表达可能 是这些岩藻糖基化寡糖抗原合成及其表达调控的关键。目前发现1 1 种岩 藻糖基转移酶，小鼠主要表达f u t l ，2 , 4 ，7 ，8 ，9 共6 种功能性岩藻糖基转 移酶，其余为假罄因。蔟中f u t l 和f u t 4 参与l e y 寡耱的合成，f u t 7 参与s l e 。寡糖的台成，两f u t 9 是l e 。寡糖合成所必需的。本室前期的 研究工作溉察了部分f u t s 在着床过程中的表达及调控，僵f u t s 家簇 在小鼠胚胎着床过程中的表达谱变化尚不清楚。 为了解参与l e 7 寡糖合成关键酶f u t l 和f u t 4 ，及其它岩藻稽基转 移酶家族( f u t 2 ，f u t 7 ，f u t 8 ，f u t 9 ) 在胚骀着床过程中的变化及机 制，采用r t - p c r 和w e s t e r n b l o t 技术测定了在妊霰不同天数、延迟着床 以及延迟着床激活组小鼠子宫内膜的6 种酶的表达谱。结果发现，早孕 期阀f u t l ，f u t 4 窥f u t 7 静表这奁子塞凌貘呈泠菠整改变。f u t l 在擎 第1 天有较高水平的表达，孕第2 天以后表达开始下降，然后升高，孕 篱4 天鄂瓤黪开始蓑泰簿表达最强，藿寐嚣降低，僵与孕第l 天无唆鼗 罄异。f u t 4 和f u t 7 在孕第3 天表达达到商峰，t 孕第4 天维持商表达， 罄瘩后黪僬。f u t 2 、f u t 8 秘f u t 9 在早譬子富爨貘垮为寒表达，在不 同天数间无显著差异。延迟着床雌激索激活组与延迟着脒组的小鼠子宫 爽膜辊滋较，激溪缀中f u t l 表达辫低；f u t 7 移f u t g 懿表达无显著差 异：f u t 2 、f u t 4 和f u t 9 的表达则明显增加。结果提示，妊娠期间， 小鼠子寒悫膜岩藻糖基转移酶的表达在激素都坯黪瓣调控下呈黔段性交 化，但不同的f u t 类型受调控作用的程度不相同。 为进一步搽讨l e y 寡糖懿作用机制，采用共徐连接l e 寡糠驰璩鼹 糖小球模拟胚胎与人子宫内膜上皮细胞共孵育，观察了l e 寡糖对予甏 内膜细胞d a g p k e 馈号转导途径的影响。结果发现，l e y 寡糖霹但遴 p l cyl ；i = 胞浆向质膜转位，弗被磷酸化而活化，同时升高细胞内d a g 的水平，促进c p k cq 葶雎c p k c 2 的活化和膜转位。人_ 孑窘走膜上皮缁 臌表面韵l e y 寡糖被抗l e 7 寡糖特异的单克隆抗体封闭詹，绪聚楣反。 提示l e y 可能作为胞外僚号分予上调予富内膜细胞d a g p k c 信号转导途 径。 根据以上实验结果推测人子富内膜细胞( j e c 细胞) 膜蛋白中存在 l e y 寡糖静特异暇结合凝自或称之为l e ，寡糖受体。l e y 寡糖通过与此受 体结合启动细胞内特定的信号转导通路以促进胚胎辫床。为寻找此蛋白， 分潮采用亲霸层析及亲帮碾辩沉淀技术对j e c 缅臆膜蛋白中的l e r 寡糖 特异性结合蛋白进行分离纯化，并采用s d s ，p a g e 鄱w e s t e r nb l o t 技术 对箕进季亍裙步鍪定。结祭发现j e c 绷施簇蛋自串存在l e 寡糖特异性结 合强白，分子量约为7 5 k d 和1 1 0 k d 。l e 寡糖可能通过与此受体结合上 调子富两膜细藏d a g p k c 信弩转导途径，磷酸亿p l c t i 以活纯p l c f l ， 使细胞内d a g 水平升简。提高c p k c a 和c p k c 3 2 的活性，促进人子宫 肉膜缁澈( j e c 缡邃) 豹鬟三长缮麓，调粒子富肉簇缅魏西予、m m p s 鞠其它 着床相关因子的袭达，从而促使子宫内膜达到接受态，胚胎顺利着床。 p e m t 2 蓬表这对d a g p k c 信号转簿途径豹谲控佟蠲鹃研究 磷脂酰乙醇胺n 一甲熬转移酶2 ( p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e n + m e t h y l t r a n s f e r a s e2 ，p e m t 2 ) 豹停鬻是罐纯磷虢酝己醇胺 ( p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a r a i n e ，p e )甲基化生成磷脂酰胆碱 2 fp h os d h a t i d v l c h o l i n e ，p c ) 。该酶在肝外组织活性极低，主要分布于正常 肝组织。一般认为，肝细胞合成p c 的主要途径是c d p ( e y t i d i n e d i p h o s p h a t e ，胞嘧啶核苷二磷酸) 一胆碱途径，p e 甲基化途径只是作为 c d p 胆碱途径的补充。但研究发现，p e m t 2 基因的表达与肝细胞的增殖 分裂呈负相关。增殖快的细胞如肝癌细胞、再生肝组织中p e m t 2 表达量 很低，而正常肝细胞中p e m t 2 的表达活性较高。转染p e m t 2 e d n a 可抑 制肝癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。因此，一些作者把p e m t 2 看作是肝 细胞特异的抑癌蛋白。在前期工作中，我们将p e m t 2 e d n a 插入含有n e o 抗性基因的p l n c x 表达质粒中，构建了p l n c x p e m t 2 重组质粒并将其 转染入大鼠肝癌c b r h 7 9 1 9 细胞，发现p e m t 2 过表达抑制大鼠肝癌 c b r h 7 9 1 9 细胞增殖并诱导细胞凋亡。但其机制不明。已知，细胞的生 长、增殖、分裂和癌变是受细胞内信号调控网络精确调控的，为探讨 p e m t 2 过表达抑制大鼠肝癌c b r h 7 9 1 9 细胞增殖的机制，我们重点研 究了转染p e m t 2 基因对大鼠肝癌c b r h 7 9 1 9 细胞二脂酰甘油( d a g ) 蛋 白激酶c ( p k c ) 信号转导途径的影响，从而揭示p e m t 2 过表达抑制肝癌 细胞增殖、诱导凋亡的分子机制 d a g p k c 信号转导途经是细胞内参与细胞的生长增殖、分化、肿瘤 的发生及逆转、细胞凋亡及代谢调控的重要信号转导途径之一。p k c 是 这条信号转导通路中的关键分子。p k c 有多种甄型，不同的p k c 亚型其 功能、在组织中分布不同，其活性调节机制也不同。肝细胞中主要表达 e p k c a 、c p k c l 8 和n p k c 等亚型。采用免疫细胞化学和w e s t e r nb l o t 技 术，我们观察了转染p e m t 2 对c b r h 7 9 1 9 细胞不同亚型p k c 表达和转 位的影响。结果发现，转染p e m t 2 可显著抑制c p k c a 的表达，促进c p k c i 2 的表达，同时促进c p k c p 2 由胞浆向胞膜移位。而转染p e m t 2 对e p k c l 3 1 和n p k ce 的表达无显著影响。有文献报导，c p k c a 的主要作用是促进细 胞增殖分裂，其表达和活性与细胞的增殖程度里正相关性。而c p k c l 3 表 达增加与凋亡时核膜裂解有关。本文的结果提示p e m t 2 过表达抑制肝 癌细胞增殖、诱导凋亡的原因之一可能是p e m t 2 过表达抑制了c p k c a 的表达、促进了c p k c 3 2 的表达和活化。 为深入探讨转染p e m t 2 影响细胞p k c 活性及表达的分子机制，我们 进一步观察了转染p e m t 2 对p k c 上游信号转导途径的影响。采用有机溶 剂萃取及硅胶高效薄层层析吸附技术，比较分析了转染p e m t 2 前后 c b r h 一7 9 1 9 细胞中p k c 的上游激活分子d a g 的含量，结果表明，转染 p e m t 2 可下调c b r h 一7 9 l9 细胞d a g 的水平。d a g 水平降低可进一步下 调c p k c n 活性，抑制服的生长、增殖和分裂。 d a g 是磷精酶c ( p l c ) 徨纯磷鬻酝飘醇一4 ，5 一二磷酸( p i p 2 ) 袋 p c 水解的产物之一。进一步了解p e m t 2 过表达对p l c 活性的影响对阐 明p e m 善2 过表达季枣裁7 9 1 9 缀瞧增蹙熬分予撬裁燕卡分努覆豹。汪麓p l c 分为p l c d ( p l c p l 4 ) ，p l c y ( p l c tm 2 ) 和p l c 6 ( p l c 8 1 3 ) 三个亚类。 其中p l c y 亚类与缨簸懿生长、增浆分裂美系密切。p l c v 包援p l c t l 和p l c t 2 两种同工酶，其中p l c t 2 主要分布于肺、脾脏和甲状腺组织中， p l c t l 广泛分奄于鑫耱缀织。菠霞变耍理察转染p e m t 2 瓣缀憝p l c t l 滔 饿的影响。目前尚无测定细胞内单一类型p l c 活性的特异性方法，但已 知p l c t 溪证鲍必要条传是醚氨酸残熬磷酸纯及其囊黢浆囊痿膜转建。焱 此检测p l c y l 猩细胞内的定位及磷酸化程魔有助予判断p l c y l 的活化情 况。我们采鼹w e s t e r nb l o t 披本分剐检测了7 9 1 9 缨瞧转染p e m t 2 裁震 p l c t l 在质膜和胞浆中的分布情况及磷酸化程度。结果盛示，p e m t 2 过 表达可抑制p l c y t 由臌浆向威膜转彼及酪氮酸残蒸豹磷酸证，从两下调 p l c ? i 的活性。这可能是转絷p e m t 2 降低d a g 水平的重撰原因。 p l c 7 l 受脬细胞生长因予受体( c m e t ) 蛇活健。当与配体络台活他 精，c m e t 发生二聚化稠自身磷酸化滔化。滤忧的c m e t 臌内结构域的激 酶活性区可催化p l c t 肽链中的的醮懿酸残凝磷酸他两使其活化。因此我 们又同时研究了转染p e m t 2 对7 9 1 9 细胞c m e t 的裘达和磷酸他的影响。 结果发现转染p e m t 2 可抑制7 9 1 9 绷腿c m e t 的表达和自奠磷酸他活化， 掇示这落是p e m t 2 过袭达抑制p l c t l 活化豹原困之一。 总之，转染p e m t 2 基因可抑制e m e t 的袭达和激活，其结果馒p l c t l 磷酸亿滔纯受到捧制，细胞肉d a g 生成减少，从而使p k c a 活饿降低， 这可能是p e m t 2 过表达抑制肝癌细胞生长增殖的部分原闲。 荚键词：l e 7 寡糖岩藻糖基转移酶( f u t )二脂酰甘油( d a g ) 蛋自激 酶c ( p k c ) 磷膳酶c ( p l c ) s t u d yo fr e g u l a t i o no fd a g p k cs i g n a l i n gp a t h w a y p o s l g f a d 珏8 t o ：l iy a l i s u p e r v i s o r ：p r o f y a nq i u m a j o r ：b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y a b s t r a e t l ti sk n o w nt h a td a g p k cs i g n a l i n gp a t h w a y sv e r yi m p o r t a n ti n s i g n a lr e g u l a t i n gn e t w o r ki n c e l l s 。i ti n v o l v e si nt h eg r o w t h ，p r o l i f e r a t i o n ， d i v i s i o na n de a f e i 莪o g e 琏i s i so fc e l l s ，a n dd i s t r i b u t e sa b r o a d l y na l lt i s s u e s i n t h i ss t u d yw em a i n l ys t u d i e dt h ee f f e c t so fl e 7o l i g o s 叠e c h a f i d e sa n d p 嚣m t 2o v e 薹e x p r e 鼙s i o n0 nt h ed a g p k cs i g n a l i n gp a t h w a y ， e m b r y oi m p l a n t a t i o ni st h ek e ys t e po fr e p r o d u c t i o n ，w h i c hi n c l u d e s t h es y n c h r o n i z e dd e v e l o p m e n t a lp r o c e s so fe m b r y oa n de n d o m e t r i u m 。l e w i s o l i 窑o s a e c 魏a r i d e sa r ef u c o s y t a t e dl a c t o - s e r i e so l i 鬈o s 鑫e e 瓤建r d e si n c l u d i n gh 1 ， h 2 ，l e 8 ，l e “，l e 。，s l e 5a n dl e e ta l 。r e c e n ts t u d ys h o w e dt h a tl e w i s o l i g o $ 鑫e c h 鑫r i d e sp l a y a n i m p o r t a n t r o l ei nt h ee m b r y o i m p l a n t a t i o n ， e s p e c i a l l yh 1 ，毛e 。，s l e 3a n d l e ya r ec l o s e l yr e l a t e dt o t h es u c c e s s f u l i m p l a n t a t i o n o fe m b r y o ，t h ei m p l a n t a t i o nr a t eo fm o u s ee m b r y ow a s o b v i o u s l yr e d u c e db yi n c u b a t i n gw i t ha n t i * l e m o n o c l o n a la n t i b o d i e si n c o c u l t u r es y s t e mi nv i t r oo ri n j c o t i n gt h ea n t i b o d yi n t ou t e r i n el u m e ni n v i v o ，b u tt h er e g u l a t i o nm e c h a n i s mw a ss t i l lu n c l e a r ， t h es y n t h e s i so fn u c l e i ca c i da n dp r o r e i ni sd e f i n e db yt h et e m p l a t e s t h o s ed e t e r m i n et h eo r d e r so fn u c l e o t i d e sa n da m i m oa c i d s ，b u tw h e ni t c o m e st o c a r b o h y d r a t ec h a i n ，t h et e m p l a t ei sd e f i c i e n ta n das e r i e s o f o r d e r e dh i g h l ys p e c i f i cg l y c o s y l t r a n s f e r a s e sf u n c t i o n ，t h es y n t h e s i so f f u c o s y l a t e do | i g o s 鑫c e 囊鑫f i 疆e si sd e c i d e db yt h ef u c o s y l t r a n s f e r a s e s ，s ot h e e x p r e s s i o no ff u c o s y l t r a n s f e r a s e sm i g h tb et h ek e yp o i n to ft h es y n t h e s i so f o l i g # s 嚣c c 囊箨f i 娃嚣 a n t i g e n sa n dt h er e g u l a t i o no fo l i g o 葚a e c 纛a i 琏ea n t i g e n s y n t h e s i s 。a tp r e s e n t 、t h e r ea r ellf u c o s y l t r a n s f e r a s e s ( f u t s ) h a v eb e e n i d e n t i f i e d i nm i c e ；f u t l ，2 ，4 ，7 ，8 ，9a r ef u n c t i o n a l l ye x p r e s s e d ，t h eo t h e r s a r ep s e u d o g e n e s i nt h e s ef u c o s y l t r a n s f e r a s e s ，f u t la n df u t 4t a k ep a r ti n t h es y n t h e s i so f 己e o l i g o s 嚣c e 魏a r l 琏e ，f u t 7t a k e sp a r ti nt h es y n t h e s i so f s l e ”o l i g o s 箍e e 珏鑫f l 锺e ，w h i l ef u t 9i st h ek e ye n z y m eo ft h es y n t h e s i so f e 。 5 o l i g os a c c h a r i d e t os t u d yt h ee x p r e s s i o np r o f i l e so ff u t 1a n df u t 4 ，t h ek e ye n z y m e s f o rl e 7s y n t h e s i si nt h ep r e g n a n tm u r i n ee n d o m e t r i u ma td i f f e r e n ts t a g e s ， a n de x p l o r et h em e c h a n i s mo fs t a g i ce x p r e s s i o no ff u t sd u r i n ge m b r y o i m p l a n t a t i o n ，r t - p c ra n dw e s t e r nb l o tm e t h o d sw e r eu s e di nt h ep r e g n a n t m u r i n ee n d o m e t r i u ma td i f f e r e n ts t a g e s ，i nt h ed e l a y e di m p l a n t a t i o na n d d e l a y e dt h e na c t i v a t e di m p l a n t a t i o nm u r i n ee n d o m e t r i u m t h ee x p r e s s i o no f f u c o s y l t r a n s f e r a s e s ( f u t2 ，7 ，8 ，9 ) w a sa l s os t u d i e d + t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h ee x p r e s s i o no f u tl 。f u t 4a n df u 7w a ss t a g i ci nt h ep r e g n a n t m u r i n ee n d o m e t r i u ma td i f f e r e n ts t a g e s + a f t e rp r e g n a n c yt h ee x p r e s s i o no f f u t lw a si nar e l a t i v e l yh i g hl e v e la tt h ef i r s td a y , a n dd e c r e a s e df r o mt h e s e c o n dd a ya n dr e a c h e dp e a ka tt h ef o u r t hd a ya l t h o u g ht h e r ew a sn o s i g n i f i c a n tc h a n g e sc o m p a r e dw i t ht h a t a tt h ef i r s td a y 。t h ee x p r e s s i o no f f u t 4a n df u t 7r e a c h e dp e a ka tt h et h i r dd a y ，a n dk e p ti nah i g hl e v e la tt h e f o u r t hd a y ，t h e nd e c r e a s e da f t e re m b r y oi m p l a n t a t i o n + t h ee x p r e s s i o no f f u t 2 ，f u t 8a n df u t 9k e p th i g hl e v e li nt h ep r e g n a n tm u r i n ee n d o m e t r i u r n ， b u th a dn oo b v i o u sd i f f e r e n c e sb e t w e e nd i f f e r e n ts t a g e s a sf o r t h ed e l a y e d i m p l a n t a t i o na n dd e l a y e dt h e na c t i v a t e di m p l a n t a t i o nm u r i n ee n d o m e t r i u m ， i nt h ei a t t e rt h ee x p r e s s i o no ff u tlw a sd e c r e a s e d t h ee x p r e s s i o no ff u 下7 a n df u t 8w a sn o tc h a n g e d ，w h i l et h ee x p r e s s i o no ff u t 2 ，f u t 4a n df u t 9 w a so b v i o u s l yi n c r e a s e d ，i ti n d i c a t e st h a to v a r i a nh o r m o n e sa n de m b r y o c h a n g e sd y n a m i c a l l yi nt h em u r i n ee n d o m e t r i u mr e g u l a t e dt h ee x p r e s s i o no f f u c o s y l t r a n s f e r a s e sd u r i n ge m b r y oi m p l a n t a t i o n + t h ev a r i a t i o n so ft h e r e g u l a t o r ym e c h a n i s mo fd i f f e r e n tf u t sa r en o tc l e a r l ye l u c i d a t e d 。e s t r o g e n u p r e g u l a t e dt h ee x p r e s s i o no ff u t 2 ，f u t 4a n df u t 9t op r o m o t et h e i m p l a n t a t i o n ，b u th a dn oe f f e c to nt h ee x p r e s s i o no ff u t la n df u t 8 。 d u r i n ge m b r y oi m p l a n t a t i o n ，t h es t a g i ce x p r e s s i o no ff u c o s y l t r a n s f e r a s e s l e dt ot h es t a g i ce x p r e s s i o no ft h e i rp r o d u c t s o l i g o s a c c h a r i d ea n t i g e n s s u c ha sl e y t oe x p l o r et h em e c h a n i s mo fr e g u l a t o r ye f f e c t so fl e o i i g o s a c c h a r i d e o ni m p l a n t a t i o n ，l e 一a g a r o s ew a su s e dt om i m i ce m b r y ot oi n c u b a t ew i t h h u m a ne n d o m e t r i a lc e l l s j e cc e l l s ) ，a n da h 6 ( a n t i l e rm o n o c l o n a l a n t i b o d y w a su s e d 协b l o c ks p e c i f i c a l l yt h el e yo l i g o s a c c h a r i d eo nt h e s u r f a c eo fj e cc e i l s d a g p k cs i g n a l i n gp a t h w a yw a sc h o s e nt oo b s e r v e t h ee f f e c t so fl e o l l g o s a e o h a f i 琏e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tl e y o l i g o s a c c h a r i d ep r o m o t e d t h et r a n s l o c a t i o nf r o m c y t o s o lt o p l a s m a 6 m e m b r a n e ，p h o s p h o r y l a t i o na n da c t i v a t i o no fc p k c a ，c p k c l 3 2a n dp l c 7 1 ； i n c r e a s e dt h ec o n t e n to fc e l l u l a rd a g i ti n d i c a t e st h a tl e 0 1 i g o s a c c h a r i d e m a yu p r e g u l a t e d a g p k cs i g n a l i n gp a t h w a yi nj e cc e l l sa sas i g n a l m o l e c u l e t h e r e f o r e ，i ti ss p e c u l a t e dt h a tt h e r em i g h tb es p e c i f i cp r o t e i n s c o n j u g a t e dw i t hl e o l i g o s a c c h a r i d ei nt h ep l a s m am e m b r a n eo fj e cc e l l s ， i tc a nb en a m e da sl e r e c e p t o r l e o l i g o s a c c h a r i d ec o n j u g a t e sw i t ht h el e 7 r e c e p t o r t o u p r e g u l a t ed a g p k cs i g n a l i n gp a t h w a y ，t h u s ，p r o m o t e st h e g r o w t ha n dp r o l i f e r a t i o no fj e cc e l l s t os e a r c ht h ep r o t e i nc a n d i d a t e ， a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h ya n da f f i n i t ya t t a c h m e n tp r e c i p i t a t i o nm e t h o d sw e r e u s e dt o s e p a r a t e a n dp u r i f yt h e s p e c i f i cp r o t e i n sc o n j u g a t e d w i t hl e o l i g o s a c c h a r i d e ，s d s p a g ea n dw e s t e r nb l o tm e t h o d sw e r eu s e dt oi d e n t i f y t h es p e c i f i cp r o t e i n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew e r ei n d e e ds p e c i f i c p r o t e i n sc o n j u g a t e dw i t hl e o l i g o s a c c h a r i d ei nt h ep l a s m am e m b r a n eo f j e cc e l l s ，t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h e mw e r ea b o u t7 5 k da n d1 10 k d l e y o l i g os a c c h a r i d ec o u l dc o n j u g a t ew i t ht h es p e c i f i cp r o t e i n st ou p r e g u l a t et h e d a g p k cs i g n a l i n gp a t h w a y l e o l i g o s a c c h a r i d ec o n j u g a t i n gw i t ht h e s p e c i f i cp r o t e i n sc o u l dp h o s p h o r y l a t ep l c ? 1t oa c t i v a t ep l c ? i ，i n c r e a s e t h ed a gc o n t e n t ，u p r e g u l a t et h ea c t i v i t i e so fc p k c ua n dc p k c p 2t o p r o m o t et h eg r o w t ha n dp r o l i f e r a t i o no fh u m a ne n d o m e t r i u mc e l l s ( j e c c e l l s ) a sar e s u l t ，t h ee x p r e s s i o no fc y t o k i n e s ，m m p sa n di m p l a n t a t i o n r e l a t e d f a c t o r sw a s r e g u l a t e d t om a k ef o r e m b r y oi m p l a n t i n g i n t o e n d o m e t r i u ms u c c e s s f u l l y p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n en - m e t h y l t r a n s f e r a s e2 ( p e m t 2 1m a i n l y e x i s t si nh e p a t o c y t e sa n di t sf u n c t i o ni s c a t a l y z i n gt h eb i o s y n t h e s i so f p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ( p c ) b ya d d i n gm e t h y lg r o u p s t o p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e c o n v e n t i o n a l l y i ti sc o n s i d e r e dt h a tp ci s m a i n l yp r o d u c e d f r o mc d p 。c h o l i n ep a t h w a y ，t h ep em e t h y l a t i o n p a t h w a yi so n l yt h e c o m p l e m e n t a r yp a t h w a yo ft h ec d p c h o l i n ep a t h w a s y b u tr e c e n ts t u d i e s h a v es h o w nt h a tp e m t 2e x p r e s s i o na n da c t i v i t ya r ei n v e r s e l yc o r r e l a t e dt o t h ep r o l i f e r a t i o no fh e p a t o c y t e s i nf a s tp r o l i f e r a t i n gc e l l s ，s u c ha st h o s eo f f e t u sl i v e r ，r e g e n e r a t i n gl i v e ra n dh e p a t o m a ，t h ep e m t 2a c t i v i t yi s v e r yl o w o rn e g l i g i b l e ，b u ti nn o r m a ll i v e r ，i ti sh i g h t r a n s f e c t i o no f p e m t 2i n h i b i t e d t h ep r o l i f e r a t i o no fr a th e p a t o m am c a r d l er h 7 7 7 7c e l l s s op e m t 2 m i g h t b eas p e c i f i ct u m o rs u p p r e s s o ro fl i v e r i no u rp r e v i o u sw o r k s ，t ou n r a v e l t h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f h e p a t o m ac e l lp r o l i f e r a t i o ni n h i b i t i o nb v 7 t r a n s f e c t i o no fp e m t 2 w ec o n s t r u c t e da n dt r a n s f e c t e dt h ep l n c x - p e m t 2 r e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i di n t or a th e p a t o m ac b r h 一7 9l9c e l l s a n d f o u n dt h a tp e m t 2o v e r e x p r e s s i o nc o u l ds u p p r e s st h ec b r h - 7 919c e l l p r o l i f e r a t i o n ，b u t t h em e c h a n i s mo fp r o l i f e r 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