（有机化学专业论文）基于导电聚合物膜的电化学免疫传感器的研究.pdf

i一 基于导电聚合物n o 0 电化学免疫传感器的研究 摘要 电化学免疫传感器是将免疫分析技术与电化学传感器相结合的一种新型免 疫分析方法，是基于测量电流、电位变化束进行免疫分析的生物传感器。电化学 免疫传感器在临床医学、环境和食品工业等方面都有重要应用，并以其体积小、 专一度强、灵敏度高、检测快速方便、成本低和容易实现实时在线活体检测等优 点，成为当前研究的热点之一。 在电化学免疫传感器的构建中，如何有效地利用生物分子固定化技术及固定 化材料决定着生物传感器的稳定性、灵敏度和选择性等主要性能。此外，将抗原 抗体之间结合所产生的电化学信号进行放大在制备高灵敏电化学免疫传感器方 面也具有相当重要的意义。萨是基于以上考虑，本文结合导电聚合物膜良好的电 子传递特性，酶的化学放大作用，以及纳米会大的比表面积和良好的生物兼容性， 构建了三种电化学免疫传感器。主要内容如下： 1 用循环伏安法在玻碳电极( g c e ) 上电聚合一层稳定的中性红聚合物膜， 通过戊二醛的共价键合作用将癌胚抗体( a n t i c e a ) 固定到电极表面上，进而用 牛血清白蛋白( b s a ) 封闭电极上的非特异性吸附位点，采用双抗体夹心的方法 制得高灵敏电流型癌胚抗原免疫传感器。实验结果表明，该传感器对癌胚抗原具 有良好的电流响应，该传感器的线性范围为0 5 0 1 0 0n gm l 叫和1 0 0 8 0 0n g m l ，检出限( 3 0 ) 为0 2 0n gm l 。该方法制备的电化学免疫传感器对c e a 的 检测较为理想，有一定的应用价值。 2 以聚合物膜电极为基体，通过戊二醛的共价键合作用将甲胎蛋白抗体自组 装到电极表面上，最后用辣根过氧化物酶封闭电极上的非特异性吸附位点，并同 时起到放大向应电流信号的作用，制得高灵敏伏安型甲胎蛋白抗原免疫传感器。 实验结果表明，该传感器对甲胎蛋白抗原具有良好的电流响应，该传感器的线性 范围为1 0 0 1 0 0n gm l 叫和10 0 2 0 0n gm l 一，检出限( 3 0 ) 为o 4 0n gm l 一。 该方法中电极制备简单，操作简便，有较高的灵敏度，实现了对甲胎蛋白的免疫 分析。 3 基免疫反应对聚硫孳存光激发f 氧化底物h 2 0 2 的阻碍而产生的光致 电化学响应，制备了无标址癌胍抗原免疫传感器。将硫羹聚合到玻碳电极表面形 成带正电的多孔聚硫堇( p t h ) 复合膜，通过静电吸附固定纳米金，利用纳米会 大的比表面积和强的吸附能力将癌胚抗体固定到电极表面，通过循环伏安法和光 电流法考察了修饰电极的光电化学行为，并对免疫传感器的性能进行了详细研 究。在优化的实验条件下，该传感器的响应电流值与癌胚抗原浓度的对数值在 1 o o 8 0 0n gm l - 1 的范围内有良好的线性关系，检出限( 3 0 ) 为o 4 0n gm l - 。 该免疫传感器已应用于血清样品中c e a 的检测。 关键词：电化学免疫传感器中性红硫堇甲胎蛋白癌胚抗原光致电化学 s t u d yo fe l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o r s b a s e d0 nc o n d u c t i n gp o l y m e rf i l m a b s t r a c t e l e c t r o c h e m i c a ll m m u n o s e n s o r s w h i c hi n t e g r a t e dt h ee l e c t r o c h e m i c a ls e n s o ra n d i m m u n o a s s a y ，h a v eb e c o m eav e r ya t t r a c t i v er e s e a r c h ，o w i n gt ot h ea d v a n t a g e so ft h e i r h i g hs e n s i t i v i t y , r e l a t i v e l yh i g hs e l e c t i v i t y , s h o r ta n a l y s i st i m e 1 0 w c o s ta n df e a s i b i l i t y u n d e rm i l dc o n d i t i o n s t h ei m m o b i l i z a t i o no ft h ep r o t e i n ( a n t i b o d yo ra n t i g e n ) w a s v e r yi m p o r t a n ti nt h ef a b r i c a t i o ni m m u n o s e n s o r ，s ot h ec r u c i a la s p e c ti nt h ef a b r i c a t i o n o fab i o s e n s o ri st h ei m m o b i l i z a t i o no fb i o r e c o g n i t i o nm o l e c u l ei nh i g ha m o u n t sw i t h r e t e n t i o no ft h e i rb i o a c t i v i t y i nt h ef a b r i c a t i o no fe l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o r , h o wt o e f f e c t i v e l y i m m o b i l i z eb i o s e n s o rm a t e r i a l sd e t e r m i n e st h es t a b i l i t yo ft h em a i np r o p e r t i e so f s e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t y i na d d i t i o n ，t h ea n t i g e n a n t i b o d yb i n d i n gb e t w e e nt h e e l e c t r o c h e m i c a ls i g n a lp r o d u c e db ya m p l i f i c a t i o ni nt h ep r e p a r a t i o no f h i g h l ys e n s i t i v e e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o ra l s oh a v ev e r yi m p o r t a n t f o rt h e s er e a s o n s ，w e c o m b i n e dt h em e r i t so ft h eu n i q u ee l e c t r i c a lc o n d u c t i v i t yo rc h a r g et r a n s p o r tp r o p e r t i e s o fc o n d u c t i n gp o l y m e r s ，g o o db i o l o g i c a lc o m p a t i b i l i t yo fg o l dn a n o p a r t i c l e sa n dt h e a m p l i f i c a t i o no fe n z y m e st ot h ea n t i g e n a n t i b o d yr e a c t i o nt od e v e l o pt h r e ed i f f e r e n t i m m u n o s e n s o r t h em a i nw o r k sa r es h o w na sf o l l o w s ： 1 a nv o l t a m m e t r i ci m m u n o s e n s o rw a sf a b r i c a t e db yu s i n ga ne l e c t r o p o l y m e r i z e d n e u t r a lr e d ( p n r ) o nag l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e t h eo fa m i n og r o u p so fp n rw a su s e d t oc o v a l e n t l ya t t a c hp r o t e i np r o b e sv i at h ea i do fg l u t a r a l d e h y d ec r o s s - l i n k i n g ，l e a d i n g t os i g n i f i c a n t l yi m p r o v e dd e t e c t i o ns t a b i l i t y t h e nb o v i n es e r u ma l b u m i nw a su s e dt o b l o c ku n s p e c i f i cs i t e s c a r c i n o e m b r y o n i ca n t i b o d i e sw e r ei m m o b i l i z e do n t ot h ep n r m o d i f i e de l e c t r o d et o r e c o g n i z e c a r c i n oe m b r y o n i ca n t i g e n ( c e a ) t a r g e tb yt h e ”s a n d w i c h ”d e t e c t i o nw a y u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h ei m m u n o s e n s o rw a s h i 曲l ys e n s i t i v et oc e aw i t had e t e c t i o nl i m i to f0 2 0n gm l - 1a n dt h el i n e a rr a n g e w a sa tt w oc o n c e n t r a t i o n sf r o m0 5 0t ol0 0n gm l 叫a n df r o mlo ot o8 0 0n gm l t h ei m m u n o s e n s o rh a da c c e p t a b l es t a b i l i t y w h i c hi n d i c a t i n gt h ei m m u n o s e n s o rc o u l d s a t i s f yt h en e e do fp r a c t i c a ls a m p l ed e t e c t i o n 2 o nt h e b a s i so fp n rf i l me l e c t r o d e ，a nv o l t a m m e t r i ca - f e t o p r o t e i n ( a f p ) i m m u n o s e n s o rw a sc o n s t r u c t e d t h ea m i n og r o u p so fp n rw a su s e dt oc o v a l e n t l y a t t a c hp r o t e i np r o b e sv i at h ea i do fg l u t a r a l d e h y d ec r o s s l i n k i n g h r pw a s u s e di n s t e a d o fb o v i n es e r u ma l b u m i nt ob l o c ku n s p e c i f i cs i t e s ，w h i c ha m p l i f i e dt h ea m p e r o m e t r i c r e s p o n s es i g n a l a n dt h u se n h a n c e dt h es e n s i t i v i t yo ft h ei m m u n o s e n s o r u n d e rt h e o p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，t h ei m m u n o s e n s o rs h o w e das p e c i f i cr e s p o n s et oa f pi n t h e r a n g ef r o m1 0 0t o10 0n g m l - 1a n d10 0t o2 0 0n gm l - 1w i t had e t e c t i o nl i m i to f 0 4 0 n gm l t h ef a b r i c a t i o ns t e p sa r es i m p l ea n dc o n v e n i e n ta n dt h ei m m u n o s e n s o r h a s h i 曲s t a b i l i t ya n ds e n s i t i v i t y 3 an o v e lp h o t o e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o rf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc e a b a s e do np o l y ( t h i o n i n e ) c o n d u c t i n gp o l y m e rh a sb e e nf a b r i c a t e d b e c a u s et h en a n o - a u c a na d s o r ba n t i b o d i e sb e c a u s eo f i t s l a r g es p e c i f i c s u r f a c ea r e a sa n d g o o d b i o c o m p a t i b i l i t y , t h eg o l dn a n o p a r t i c l e sw e r eu s e dt oi m m o b i l i z ep r o t e i np r o b e so nt h e p o l y ( t h i o n i n e ) f i l me l e c t r o d e t h e m o d i f i c a t i o np r o c e d u r ew a se l e c t r o c h e m i c a l l y m o n i t o r e db yc y c l i cv o l t a m m e t r ya n dp h o t o c u r r e n tc u r v e t h ef a c t o r so fe x p e r i m e n t w e r es t u d i e di nd e f a i lw h i l eh 2 0 2w a sa sa ne l e c t r o nd o n o r u n d e rt h eo p t i m a l e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ，t h ed e v e l o p e di m m u n o s e n s o re x h i b i t e df a s tr e s p o n s e t oc e a a n dt h el i n e a rr a n g ew a s1 0 0 8 0 0n gm l - 1w i t had e t e c t i o nl i m i to f0 4 0n gm l 1 a n dt h i sp h o t o e l e c t r o c h e m i c a lr e a c t i o nc a n d e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n s b ee m p l o y e da san e wm e t h o df o rt h e k e yw o r d s ：v o l t a m m e t r i ci m m u n o s e n s o rn e u t r a lr e dt h i o n i n ea - f e t o p r o t e i n c a r c i n o e m b r y o n i ca n t i g e np h o t o e l e c t r o c h e m i s t r y i v 目录 第一章文献综述1 1 1 免疫分析_ ：1 1 2 免疫传感器2 1 2 1 免疫传感器的定义，特点和测定原理2 1 2 2 免疫传感器的分类3 1 2 3 电化学免疫传感器4 1 2 4 免疫传感器的固定化一6 1 2 5 免疫传感器的应用l0 1 2 6 免疫传感器的发展趋势1 1 。1 3 本论文选题背景和研究思路l3 参考文献14 第二章基于电聚合中性红膜癌胚抗原免疫传感器的研究2 0 引。言2 0 2 1 实验部分2 1 2 1 1 仪器与试剂2 1 2 1 2 免疫传感器的制备2 l 2 1 3 实验方法2 2 2 2 结果与讨论2 2 2 2 1 聚中性红膜的电化学性质2 2 2 2 2 电极修饰过程的电化学表征2 4 2 2 3h 2 0 2 的催化反应2 5 2 2 4 实验条件的优化2 6 2 2 4 1p h 和温度的选择2 6 2 2 4 2h 2 0 2 用量的选择2 6 2 2 4 3 孵育时问的选择2 7 2 2 5c e a 免疫传感器的性能2 7 2 2 5 1 对c e a 抗原的电流响应2 7 2 2 5 2 传感器的稳定性、选择性和重现性2 8 2 2 5 3 免疫传感器用于人体血清的检测2 9 2 3 本章小结2 9 参考文献3 0 第三章基于中性红电聚合膜的伏安型甲胎蛋白免疫传感器3 2 引言3 2 3 1 实验部分3 2 3 1 1 仪器与试剂3 2 3 1 2 免疫传感器的制备3 3 3 1 3 实验方法3 4 3 2 结果与讨论3 4 3 2 1 电极修饰过程的表面形貌和电化学表征3 4 3 2 2h r p 的催化特性3 6 3 2 3 实验条件的优化3 8 3 2 3 1p h 和温度的选择3 8 3 2 3 2h 2 0 2 用量的选择3 8 3 2 3 3 孵育时间的选择3 9 3 2 4a f p 免疫传感器的性能3 9 3 2 4 1 对a f p 抗原的电流响应3 9 3 2 4 2 传感器的稳定性、选择性和重现性4 1 3 2 4 3 血清中a f p 的测定4 l 3 3 本章小结4 l 参考文献4 3 第四章基于聚硫堇一过氧化氢光电效应的癌胚抗原免疫传感器4 5 引言4 5 4 1 实验部分一4 5 4 1 1 仪器与试剂4 5 4 1 2 免疫光电极的制备4 5 4 1 3 测试方法4 6 4 2 结果与讨论一4 6 4 2 1 免疫光电极修饰过程的表面形貌和电化学表征4 6 4 2 2 聚硫堇的光诱导反应4 8 4 2 3 免疫光电极层层白组装过程的时问一电流曲线5 0 4 2 4 免疫传感器埘c e a 抗原响应性能5 l 4 2 5 免疫时间、温度的影响5 3 4 2 6 传感器的稳定性、选择性和重现性5 3 4 2 7 免疫传感器用于人体血清的检测5 3 4 3 本章小结5 4 参考文献一5 5 结论；j ：5 6 致谢5 7 攻读学位期间已发表和待发表的相关学术论文题录5 8 独创性声明5 9 岛科技人学研究生学位论文 1 1 免疫分析 第一章文献综述 免疫分析【l - 3 】是利用抗原与抗体的特异性结合作用来选择性识别和测定可以 作为抗体或抗原的待测物，它的提出及发展是生物分析化学最大的成就之一。免 疫分析法是基于抗原与对应抗体之间高度选择性反应而建立起来的一类分析方 法，抗原抗体反应的特异性和专一性决定了免疫反应具有高度的选择性，也正因 为此，它作为裁决检测技术优于其他方法，应用广泛。抗原和抗体的相互作用是 免疫分析的基础，抗原是指可被t 淋巴细胞、b 淋巴细胞识别，能够刺激机体 免疫系统，诱导免疫应答产生相应的抗体或致敏淋巴细胞等物质，同时又能在体 内、外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的物质，即能够刺激动物机体产生 免疫反应的物质，但从广义的生物学观点看，凡是具有引起免疫反应性能的物质， 都可称为抗原。一个完整的抗原具有两种基本性能：诱导机体产生免疫应答反应， 即免疫原性或抗原性；能够与相应免疫反应产物发生特异性结合反应，即免疫反 应性或反应原性。抗体是b 细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的能 与抗原发生特异性结合的糖蛋白，简单来说，即由抗原刺激机体产生的具有特异 性免疫功能的球蛋白，又称为免疫球蛋白，抗体或者可以定义为人和高等动物免 疫系统产生的一类能与侵入机体的抗原异物发生特异性结合的球蛋白。抗体中存 在对抗原结构进行特殊识别、结合的部位，当免疫系统细胞暴露在抗原物质或分 子中时，抗体可与其独特的抗原高度专一性可逆结合，其问有静电力、氢键、疏 水作用和范得华力。抗原抗体反应的特异性和专一性决定了免疫反应具有很高 的选择性。 目前在临床上应用的免疫分析主要有：放射免疫分析、免疫放射分析、均相 酶免疫分析、酶增强免疫分析、酶免疫分析。2 0 世纪5 0 年代y a l o w 4 】等发展 了放射性免疫分析法( r i a ) ，利用具有放射性1 2 5 i 标记抗原，极大地提高了免 疫分析的灵敏度，但该法存在放射性污染。6 0 年代，e n g v a l l i s l 等提出了酶联免 疫分析技术( e u s a ) ，用特定酶代替放射性同位素作为示踪物，通过测定酶催化 底物反应间接定性或定量分析待测物。酶联免疫分析技术现己成为临床免疫检验 中的主导技术，这是与它的方法上的特异性、操作上的简便性和试剂的稳定性分 不开的，还有重要的一点是其对环境没有污染威胁。但由于这些免疫分析技术存 在分析时间长、分离分析操作繁琐及对分析操作技能要求高或所用仪器、试剂价 基丁导电聚合物膜的电化学免疫传感器的研究 格昂贵，不便于分析系统的集成化、微型化，不能满足实际生物样品分析的在线、 快速检测的要求，而且假阳性和假阴性结果的存在也在一定程度上限制了它们的 使用范围。2 0 世纪8 0 年代以来，生命科学的发展为免疫传感器的发展提供了 强有力的帮助，这种传感器是将抗体或抗原固定在固体基质上，可从复杂组分中 富集抗原或抗体，使固定化的生物敏感膜发生信号变化( 如重量、光学、热学、 声学、电化学信号等) ，达到检测特定抗原或抗体的目的。它集免疫反应、信号 产生、信号检测一体化，具有结构紧凑、使用方便、灵敏度高、成本低、能微型 化等特点。因此，以免疫分析技术为基础而发展起来的免疫传感器的应用，大大 地推动了免疫分析技术在医学、临床、生物、化学、环境、农业、工业等领域的 应用和发展【5 1 。 1 2 免疫传感器 1 2 1 免疫传感器的定义，特点和测定原理 1 9 9 0 年h e n r y 等【1 6 j 提出了免疫传感器的概念：将高灵敏的传感技术与特异 性免疫反应结合起来，用以检测抗原一抗体反应的生物传感器称作免疫传感器。 它即具有电化学传感技术的高灵敏度，又具有免疫分析的高特异性和专一性。免 疫传感器的工作原理和传统的免疫测试法相似，都属于固相免疫测试法，即把抗 原或抗体固定在固相支持物表面，来检测样品中的抗原或抗体。不同的是，传统 免疫测试法的输出结果只能定性或半定量地判断，且一般不能对整个免疫反应过 程的动态变化进行实时检测。而免疫传感器具有能将输出结果数字化的精密换能 器，不但能达到定量检测的效果，而且由于传感与换能同步进行，能实时检测到 传感器表面的抗原抗体反应，因此，它可促使免疫诊断方法向定量化、操作自动 化方向发展。抗原抗体的反应被公认是一种专一性极强的化学反应，利用抗原抗 体专一性反应的原理并与及时、快速、简便、灵敏、自动的传感技术相结合，形 成了医学诊断中具有良好发展势头的检测方法一免疫传感器技术，用于在体或离 体的超灵敏高特异的相关分子的检测。免疫传感器的主要优点有【”l ： ( 1 ) 目标物具有很高的特异性，免疫反应具有可逆性。 ( 劲响应时间短，检测速度快。 r 3 ) 分析复杂样品时( 血清，食品，废水等) ，无需对样品进行预处理。 h ) 能够在环境监控，药物分析和工业过程中实行连续监控。 ( 5 ) 能够设计成便携式装置，可进行活体分析和少量样品中多组分测定。 2 青岛科技大学研究生学位论文 ( 6 ) 能和其它装置结合实现免疫传感器的自动化，数据能以多种方式被处理、 存储、输出和显示。 免疫传感器具有三元复合物的结构，即感受器、转换器和电子放大器。在感 受器单元中与抗体和抗原选择性结合产生的信号敏感地传送给感受器，抗体与抗 原的结合具有高度的特异性，检测抗体的结合有两种基本方法： ( 1 ) 标记法标记法采用酶、荧光物质、电活性化合物等进行标记，抗体与 抗原反应过程通过电化学、光学等手段进行检测，同时对浓度信息加以化学放大 ( 酶标记) ，从而实现高灵敏检测目标物f 协2 3 1 。该类传感器的原理主要有夹心法 和竞争法，前者是在样品中的抗原与传感界面上的抗体结合后，再加标记的抗体 与样品中的抗原结合，形成夹心结构；后者则是用标记的抗原与样品中的抗原竞 争结合传感界面的抗体。 ( 2 ) 非标记法非标记法指抗体与其相应抗原识别结合时将其免疫作用直接 转变成可测信号。这类传感器在结构上可进一步分为结合型和分离型两种。前者 是将抗体或抗原直接固定在传感器表面上，传感器与相应的抗体或抗原发生结合 的同时产生可测信号；后者是用抗体或抗原制作抗体或抗原膜，当其与相应的配 基反应时，膜电位( 或其他物理参数) 发生变化，测定膜电位的电极与膜是分开 的。 1 2 2 免疫传感器的分类 由于免疫传感器的检测结果最终还需换能器转换成输出信号，其检测效果因 此也往往取决于所用换能器的精确度和稳定性，故换能器的种类对传感系统来说 就显得尤为重要。正是基于换能器在传感器中的特殊地位，免疫传感器的种类一 般都根据换能器的不同来划分。到目前为止，可将其分为质量测量式免疫传感器、 光学免疫传感器、热量测量式免疫传感器和电化学免疫传感器等。 ( 1 ) 质量测量式免疫传感器是测量免疫反应后引起的质量信号变化量的一类 传感器。质量变化可以通过压电晶体和声波技术测量出来。压电免疫传感器是最 常见的一种质量测量式免疫传感器，它的测量原理为石英晶片在振荡电路中振荡 时有个基础频率，当样品中的抗原或抗体与包被在晶片上的抗体或抗原结合时， 由于负载的增加，晶片的振荡频率会相应减少，其减少值与吸附上去的质量有相 关性。1 9 7 2 年s h o r t s 等【冽人首先在石英晶体表面涂覆一层塑料薄膜以吸附蛋白 质，成功制各了用于测定牛血清白蛋白抗体的压电晶体免疫传感器，从而使压电 现象用于免疫测试的想法成为现实。由于此类技术( 尤其是压电晶体) 操作简便， 无须标记且灵敏度高，因此发展较为迅速，它们的有关产品j 下逐步得以商品化。 3 基于导电聚合物膜的电化学免疫传感器的研究 ( 2 ) 光学免疫传感器是测量免疫反应后引起光学信号变化量的一类传感器。 光学信号包括光吸收、荧光、磷光、反折散射等，此类免疫传感器是基于光学 原理，利用光学换能器对抗原抗体发生反应后所产生的反应物发出或吸收的电磁 射线进行实时动态监测或利用薄膜光学干涉技术检测免疫应答形成的生物膜的 厚度瞄l 。在光学免疫传感器中，光学信号的获得既可通过标记法也可以不用。不 需要标记的光学传感器( 直接光学传感器) 占目前使用的化学免疫传感器中相当 大一部分，包括表面等离子体、紫外、荧光、化学发光、拉曼散射、光声等免疫 传感器。光学免疫传感器具有很高的传输信息容量、检测安全、信号稳定等特点 但使用的仪器和药品价格昂贵。 ( 3 ) 热量测量式免疫传感器是基于利用热电堆来测量化学和生物反应中热量 变化的原理而制成的传感器1 2 6 , 2 7 。此类免疫传感器是将抗原或抗体固定在热敏换 能器上，样品中的抗体或抗原与之发生特异性反应后引起酶促反应，可产生2 0 l o o k j p m o l 的热量，然后通过热敏电阻检测出来。1 9 9 1 年，u m 孤【2 8 1 用小型薄膜 热敏电阻固定抗体来检测抗原，制成了微型热量检测免疫传感器，预示着有可能 生产出大小适宜且简单的装置。该类传感器结构简单、价格低廉，但检测灵敏度 较低。 h ) 电化学免疫传感器是基于抗原抗体反应的，可进行特异性的定量或半定量 分析的自给式的集成器件，抗原抗体是分子识别元件，且与电化学传感元件直接 接触，并通过传感元件把某种或者某类化学物质浓度信号转变为相应的电信号 【冽。具有生物传感器选择性好、种类多、测试费用低、适合联机化等优点：又具 有电化学体系可实现在体检测、不受样品颜色、浊度的影响( 即样品可以不经处 理，不需分离) ，所需仪器设备相对简单，具有简便、快速、体积小等特点；能 广泛应用于医疗、食品分析、工业生产、环境检测等领域。 1 2 3 电化学免疫传感器 电化学免疫传感器是将免疫组分固定在电极表面后，通过抗原抗体免疫反 应后用电化学方法检测反应的进行。根据所采用的电化学检测方法可以分为电流 型、电导型、电位型和电容型免疫传感器，其中应用最广泛、研究最成熟的是电 流型免疫传感器。 ( 1 ) 电流型免疫传感器 电流型免疫传感器测量的是恒定电压下通过电化学池的电流，待测物通过氧 化还原反应在传感电极上产生的电流与电极表面的待测物浓度成正比。此类系统 有高度的敏感性，以及与浓度线性相关性等优点( 比电位测量式系统中的对数相 4 青岛科技大学研究生学位论文 关性更易换算) ，很适于免疫化学传感器。该类传感器的原理主要有竞争法和夹 心法两种：前者是用酶标记抗原与样品中的抗原竞争结合在基体电极上的抗体，催一 化氧化还原反应产生电活性物质，从而引起电流变化，测此变化值便可知样品中 抗原浓度；后者则是当样品中的抗原与基体电极上的抗体结合后，再加酶标抗体 与样品中的抗原结合，形成夹心结构，从而催化氧化还原反应产生电流值变化。 电流型免疫传感器的标记物有酶和电活性物质两类。最常用的标记酶有碱性 磷酸酶、辣根过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶等。电活性标记物一般有二茂铁、 f e ( c 6 1 似、硝基雌三醇、金属离子外p b “、z n 2 + 等。e e m e d y a n t s e v a 等 3 0 l 将含有胆碱脂酶的硝化纤维膜固定在电极表面，利用戊二醛和正己烷将致病真菌 抗体连接在纤维膜上从而制得检测致病真菌抗原的电流型免疫传感器。d a i 等【3 1 】 利用辣根过氧化物酶标记c a l 2 5 抗体制备了电流型免疫传感器，成功地检测了 血清中c a l 2 5 的含量。 a f p 是诊断肝癌的重要蛋白质，利用酶的放大作用，可获得极高的灵敏度。 岍传感器在l o 8 1 0 - 1 2 9 m l 范围内有定量关系。方法是将抗原固定于氧电极 的表面，测定时在待测a f p 的溶液中加入已知浓度经标记过氧化氢酶的a f p 溶液，一旦遇到a f p 的抗体时，待测的a f p 抗原与标记的抗原就在电极上产 生与抗体结合的竞争反应，最后达到一定的比例，然后将电极取出洗净，放入含 过氧化氢的酶活性物质溶液中，由于酶能催化过氧化氢分解而产生氧，氧的增加 使传感器电流值增大，根据电流增加速度和最大变化量可求出标记酶的量，即结 合于膜的标记帅的量，然后球的a f p 抗体膜的最大抗原结合量，便可推算 被测非标记岍抗原的型3 2 1 。r u q i ny u 实验小组制作了c 3 电流型免疫传感 器，将c 3 抗体固定在溶胶凝胶修饰的电极上，并与待测溶液中的c 3 - h r p 和 c 3 竞争反应，从而达到检测补体c 3 的目的其浓度范围可达0 0 8 5 6 仉g m l t 3 3 1 。此外，用酶联免疫吸附试验及多功能电流免疫传感器还先后检测了茶碱， 黄体生成激素，载体蛋白e 等人体血清中的生物活性物质，为该类传感器在医 学领域里的应用进一步拓宽了道路。 从电流型免疫传感器研究开发的情况来看，目前仍在寻找更合适的固定方法 和固定材料，探求更灵敏稳定的标记系统和电活性物质，追求更完美的信号检出 系统。 ( 2 ) 电导型免疫传感器 电导型免疫传感器是利用免疫反应引起溶液或薄膜的电导发生变化来进行 分析的传感器。酶催化底物的反应，导致反应体系中离子种类及浓度的变化，从 而改变溶液的导电率。由于待测样品的离子强度与缓冲液电容的变化会对这类传 感器造成影响，加之溶液的电阻是由全部离子移动决定的，使得它们还存在非特 5 基于导电聚合物膜的电化学免疫传感器的研究 异性问题，因此这类免疫传感器发展比较缓慢。 ( 3 ) 电位型免疫传感器 电位型免疫传感器兴起于7 0 年代，集免疫分析的高灵敏度和离子选择电 极、气敏电极的高选择性于一体，直接或间接用于各种抗原、抗体的监测、响应 时间较快。1 9 7 5 年j a n a t a 首次描述了用电位测量来监测免疫化学反应。这种免 疫测量原理是先通过聚氯乙烯膜把抗体固定在金属电极上，然后用相应的抗原与 之特异性结合，抗体膜中的离子迁移率随之发上变化，从而使电极上的膜电位也 相应发生改变。膜电位的变化值与待测物浓度之间存在对数关系，因此根据电位 变化即可求得待测物浓度，它是基于测量电位变化来进行免疫分析的生物传感 器。电位型免疫传感已成功用于人埯g 、乙型肝炎、人绒毛膜促性腺激素等的检 测【蛳】。电位型免疫传感器存在的问题是信号与干扰的比例度，因为大部分生物 分子上的电荷密度相对于背景干扰来说比较低，而且信号对p h 和离子强度等条 件有明显依赖性，被测电位只与离子活性有关，生物样品中其它组分在电极表面 的吸附会造成污染，从而降低了测定的可靠性。 2 0 世纪8 0 年代r e c h n i t z 等人把离子选择性电极，p h 电极或气敏电极引 入到电位测量式免疫传感器中，使灵敏度得以改进。如将c 0 2 气敏电极用于人 i g g ，地高辛和抗生素的免疫化学检测，离子选择性电极的免疫传感器也被用来 检测地高辛抗体和前列腺素等1 3 6 1 。r u o y u a n 小纠3 7 】报道了纳米金修饰玻碳电极固 载抗体的电位型白喉类毒素免疫传感器的研究。该传感器利用纳米材料大的比表 面积及良好的生物兼容性，从而提高了传感器的灵敏度。 ( 4 ) 电容型免疫传感器 电容型免疫传感器是建立在双电层理论上的一种传感技术，物质的吸附和表 面电荷的改变对双电层结构都产生显著影响。电容型免疫传感器是基于将抗体固 定在电极表面，当抗原抗体在电极表面结合时，界面电容相应地降低，据此检测 抗原的量。w a r a k o ml i m b u t 等研制了基于硫脉自组装膜的电容型癌胚抗原免疫 传感器，该传感器检测线可达1 0p g , m l t 硎。 1 2 4 免疫传感器的固定化 电化学免疫传感器中的分子识别元件即抗原或抗体，在电化学免疫传感器的 制备过程中将其固定在电极表面，实现分子识别元件的固定化，形成一层生物敏 感膜。生物敏感膜是电化学免疫传感器的关键组成部分，其性能将直接影响传感 器的灵敏度、重现性和使用等性能。因此在电化学免疫传感器制备中，将抗原或 抗体固定在转换器( 固体电极) 表面是一个非常重要的步骤，它是影响电化学免 6 青岛科技大学研究生学位论文 疫传感器的稳定性、分析灵敏度和选择性的关键因素之一。适合于电化学免疫传 感器的常用固定方法有：吸附法、包埋法、自组装法、共价键合法、交联法、定 向固定法、溶胶一凝胶法和丝网印刷技术等。 r 1 1 吸附固定法 经非水溶性载体物理吸附或离子结合作用使生物敏感元件固定，称为吸附 法，这些结合可能是氢键、范德华力或离子键等，也可能是多种键合形式共同发 生作用。吸附固定法是一种较为简单的固定化方法，通过物理吸附作用将生物免 疫组分固定在电极表面。吸附载体的种类繁多，如金胶，壳聚糖以及纳米氧化物 等。吸附的牢固程度与溶液的p h 、温度、溶剂性质和种类等有适当处理，用抗 体或抗原溶液浸泡或涂敷，抗体或抗原由于分子间作用力固定在电极表面。该法 固定化过程简单，由于无需使用化学试剂，对免疫组分生物活性影响较小。但是 由于生物分子与载体相互作用力弱故存在电极稳定性不佳，易脱落等缺点，特别 在环境条件改变时，但若能找到适当的载体，这是很好的固定化方法，而且与其 他方法结合使用可以在很大程度上减小环境条件的影响以及减少关，因此，为了 得到最好的吸附效果并保持最高的活性，控制实验条件非常重要。电极表面经过 生物敏感元件的脱落，例如吸附交联法。 ( 2 ) 包埋法 包埋法是将生物分子直接包埋在高分子聚合物或复合电极中，从而将生物 分子固定在转换器上的一种固定方法。该技术的特点是：可采用较温和的固定条 件，包埋的生物活性分子较牢固及聚合膜的孔径和几何形状可以调控，并且可以 固定较高浓度生物大分子。硅烷基溶胶一凝胶、固体石蜡、环氧树脂、烯酸酷聚 合物、电聚吡咯等都可作为固定免疫组份的基底材料。包埋法一般不需要与生物 物质的残基进行结合反应，很少改变生物活性物质的高级结构，因而生物活性损 失很少。其中，电聚合高分子包埋是将高分子单体和生物分子同时混合于电解液 内，通电使单体在电极表面电聚合成高分子，与此同时可以将抗体抗原包埋于高 分子膜内而固定于电极表面，构成免疫传感器 3 9 , 4 0 。碳糊包埋是将抗体( 抗原) 与石墨粉、石腊油按一定比例调制成糊状物，填充于玻璃管内制备成碳糊电极 4 1 , 4 2 。包埋法也存在着一些缺点，如生物敏感元件对应的大分子量底物或产物在 凝胶网络内扩散较困难，因此包埋法一般适用于作用于小分子底物和产物的生物 活性物质，而作用于大分子底物和产物的生物活性物质因传质阻力过大而不宜采 用。 ( 3 ) 自组装法 自组装法是一种基于化学反应的化学吸附法。由于该方法的简单、多样性， 并能够在分子水平上建立一种