（细胞生物学专业论文）转基因番茄叶绿体特征及其蛋白质差异研究.pdf

转基因番茄叶绿体特征及其蛋白质组差异研究 摘要 本实验以一株转基因番茄( l y c o p e r s i c u me s c u l e n t u mv a nc e r a s i f a r m ) 为实验材料，通 过对其细胞学特征、倍性和蛋白质组进行研究，为研究变异机理提供理论基础。主要取 得以下进展： 1 转基因植株叶片总叶绿素含量较对照株略微增加，而保卫细胞和栅栏组织中的叶 绿体数目则分别是对照株的1 7 和1 6 倍。 2 经透射电子显微镜分析叶绿体的显微结构，转基因植株中的叶绿体表现出明显的 膨胀，且内囊体膜发育不良，呈现出模糊和不连续现象。 3 利用流式细胞仪分析d n a 含量，结果表明此转基因植株为3 倍体植株。 4 通过双向电泳技术，共得到了3 6 8 个差异蛋白。以对照株的蛋白组图谱为参考， 转基因植株有1 2 2 个蛋白上调，2 4 6 个蛋白下调。 5 成功鉴定出1 6 个丰度百分比差异在二倍以上的蛋白点，它们涉及到很多生物学功 能。 关键词：转基因，樱桃番茄，透射电镜，流式细胞技术，双向电泳 r e s e a r c ho nc h l o r o p l a s tc h a r a c t e r sa n d p r o t e o m i cv a r i a t i o n so f t r a n s g e n i ct o m a t o a b s t r a c t a t r a n s g e n i ct o m a t o ( l y c o p e r s i c u me s c u l e n t u my a ec e r a s i f a r m ) p l a n th a sb e e ns t u d i e da n di t s c y t o l o g i c a lc h a r a c t e r s ，d n ap l o i d y a n dp r o t e i ne x p r e s sv a r i a n c e sc o m p a r e dw i t ht h e w i l d t y p ep l a n tw e r ec h a r a c t e r i z e d t h e s e r e s u l t sw i l lp r o v i d et h eb a s i so fm u t a t i o n m e c h a n i s m h e r ea r es o m ec o n c l u s i o n sw ea c h i e v e di nt h i sr e s e a r c h ： 1 l e a ft o t a lc h l o r o p h y l lc o n t e n to ft r a n s g e n i cp l a n th a v ei n c r e a s e ds l i g h t l yc o m p a r i n gt h e c o n t r o l ，w h i l et h en u m b e r so fc h l o r o p l a s t si nt h eg u a r dc e l l sa n dp a l i s a d et i s s u ei nt r a n s g e n i c p l a n tw e r e1 7a n d1 6t i m e sm o r et h a nt h a ti nc o n t r 0 1 2 m i c r o s t r u c t u r eo fc h l o r o p l a s tw a sa n a l y z e db yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e t h e s t m c t u r eo fc h l o r o p l a s ti nt r a n s g e n i cp l a n t l e ts h o w e de x p a n s i q n ，a n dt h es h a p eo ft h y l a k o i d s w a sb l u r r ya n di n c o m p a e t 3 f l o wc y t o m e t r yr e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h et r a n s g e n i cp l a n tw a st f i p l o i d 4 u s i n gt h et w o d i m e n s i o n a lg e le l e e t r o p h o r e s i s ，w ef o u n d3 6 8p r o t e i nv a r i a n c e s t h e c o n t r o lg e lw a ss e r v e d 雒t h er e f e r e n c e i nt r a n s g e n i cp l a n t l e t ，12 2p r o t e i ns p o t ss h o w e da d e c r e a s ei nt h e i ri n t e n s i t y ，w h i l eo t h e r2 4 6s p o t sw e r ei n c r e a s e d 5 1 6p r o t e i ns p o t s ( v a l u er a t i o 一2 ) w e r ei d e n t i t i e ds u c c e s s f u l l y t h e s ep r o t e i n si n v o l v e di n m a n yb i o l o g i cf u n c t i o n s k e yw o r d s ：t r a n s g e n e ，l y c o p e r s i c u me s c u l e n t u m ，t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ，f l o w c y t o m e t r y , t w o d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。 本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研 究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它 相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作暑签名：二牡指导教师签名： a 沪了年6 月暑 日 知了 年6 月罗日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研 究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和 致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示 身 意。 靴敝零鬻唆日 炒了年月宕日 西北人学硕士学位论文 1 1 转基因技术的研究进展 第一章前言 1 1 1 植物转基因技术 1 1 1 1 植物转基因技术的发展 植物生物技术中的转基因技术突破了物种间的界限，将有用的外源基因转入其他物 种，使远缘生物之间可以进行基因的交换，创造新种质或品种。到目前为止，人们已经 设计和提出了很多的转基因方法，它们各具特色，其中一些主要的、常用的方法如下： 1 ) 根瘤农杆菌转化系统： 在所有产毒的根瘤土壤杆菌中普遍都存在着t i 质粒，分子量大：b 2 0 0 2 5 0 k b 。在不同 株系的根瘤土壤杆菌中，t i 质粒一般分为四个区域，即与肿瘤形成有关的t - d n a 区和v i r 区，还有两个与接合转移和质粒自身复制有关的区域。在肿瘤形成过程中，t o d n a 可以 被转移到植物细胞中并插入到染色体基因组。这种方法是目前最常用的方法之一，主要 用来对双子叶植物进行外源基因的转化，具有很高的转化成功率。同时也被用于其它植 物的转化形式【1 1 。 2 ) 植物病毒载体系统： 植物病毒载体系统的主要原理是将外源基因插入到病毒基因组中，利用病毒对植物 细胞的感染，将外源基因导入到植物细胞。目前，比较常见的植物病毒载体系统有三种： 单链r n a 植物病毒载体系统、单链d n a 植物病毒载体系统和双链d n a 植物病毒载体 系统。 a 单链r n a 植物病毒载体系统 大多数植物病毒的遗传物质都是具有感染性的正链r n a ，因此选择以单链r n a 植物 病毒作载体转化植物细胞。b i s a r o 和s i e g e l1 2 ：j ：1 9 8 0 年应用烟草脆裂病毒( t r v ) 进行转基 因操作，并首先提出了这种病毒载体系统。它的主要步骤是：首先用反转录酶和d n a 聚合酶将单链的病毒r n a 合成为双链的e d n a 拷贝，然后将其克隆到原核生物的质粒或 粘粒载体上，通过常规的遗传操作和分子生物学的方法对载体d n a 进行改造，将外源基 因插人到病毒的c d n a 部分，最后，再通过体外转录，将带有外源基因的病毒d n a 感染 并进入植物受体细胞。 随着研究的深入，又有很多单链r n a 病毒载体被发现。其中，有一些已得到广泛应 第一章前言 用，对其的研究也较为充分，例如雀麦花叶病毒( b m 、，) f 3 j 、烟草花叶病毒( t m v ) 训。 b 单链d n a 植物病毒载体系统 双粒病毒是一类单链d n a 植物病毒，其病毒颗粒一般是成对存在的。它的基因组比 较小，其大小约为2 5 3 5 k b ，主要是由单链的环状d n a 分子组成，但也含有少量的复制 型双链d n a 分子。双粒病毒成对的两个颗粒中所包含的基因组可以不同，但只有当两种 d n a 混合时才具有感染性网。这种二连基因组载体系统的优点就在于此，当病毒的复制 基因只在一种基因组上时，那么在另一种基因组上插入外源基因，将不会影响到整个基 因组的复制。这种载体系统也存在着一定的局限性，它的感染部位仅局限在植株的维管 组织，而且大部分靠媒介昆虫传毒，不能机械转移接种；另外，这种病毒都是球形颗粒， 插入外源d n a 的片段不能太大【6 1 。 c 双链d n a 植物病毒载体系统 双链d n a 病毒载体系统的典型代表是花椰菜花叶病毒( c a m v ) 。c a m v 的基因组是 双链环状的d n a ，长度大约为8 o k b 。虽然c a m v 本身可以作为承载小片段外源d n a 的 克隆载体，但由于在它的大多数限制性酶切位点中插入外源d n a 都会导致病毒失去感染 性，而且它不能包装具有大于原基因组3 0 0 b p 的重组体基因组。因此，近年来人们主要 研究将c a m v 的d n a 整合到t i 质粒d n a 中组成混合的载体系统1 7 1 。 2 ) d n a 直接导入法： 由于土壤农杆菌转化系统和植物病毒载体系统的操作要求高，而且步骤比较繁琐， 所以近些年来，d n a 的直接导入法被越来越广泛的应用。d n a 直接导入法的植物材料 对象大多是原生质体，另外其他的一些植物材料也可以作为细胞受体，包括器官分生组 织、未成熟的胚、愈伤组织、悬浮细胞、花粉、卵细胞等等。 d n a 直接导入法可分为：化学物质诱导法、电穿孔法、脂质体法、微注射法、基因枪法 ( 微弹轰击法) 和花粉管通道法等等。 a 化学物质诱导法 现在被使用最多的化学物质是聚乙二醇( p e g ) ，它能刺激原生质体，使其较好地 接受外源d n a 的进入。p e g 通过电荷之间的相互作用与d n a 形成紧密复合物，植物细胞 通过内吞作用吸收这些复合物到细胞内。一般低浓度的p e g 不会对原生质体造成伤害。 p e g 法首先用于转导象t i 质粒那样比较大的质粒，转导的原生质体一般来源于烟草等双 子叶植物。现在用此法来转导大肠杆菌质粒这样小的d n a 分子，转化率可达l o 4 【8 1 。 b 脂质体法 2 西北大学硕士学位论文 脂质体法的基本原理是将包含外源基因的带负电荷的脂质体与植物原生质体相融 合，从而达到转基因的目的【9 ，1 0 1 。一般可分为以下四个步骤：原生质体分离和纯化；脂 质体的制备；原生质体与脂质体的融合以及转化体的培养：筛选和鉴定。结合使用p e g 或p v a 等化学试剂可以促进植物原生质体与大肠杆菌或农杆菌的融合【1 1 j 。 c 电穿孔法 植物细胞膜在外界高压电脉冲下会造成非对称穿孔，由于这种孔孔径较小( 8 4 r i m 左右) ，加之可在很短时间内( 2 0 0 n s ) 恢复到0 5 n m ，所以这对细胞本身的生理活动的 影响不大。在每个细胞膜上的穿孔多达上百个，因此外源基因可以由此进入到细胞内。 电穿孔法大致可分两类：高压短时程法和低压长时程法。一般是根据细胞种类和实验条 件来具体选择方法。 d 微注射法 微注射法是使用毛细微管( 一般针尖的直径为0 5 n m ) ，在显微镜下将外源d n a 直接 注射入植物细胞或原生质体的一种方法。这种方法首先在动物细胞的转基因中使用【1 2 】， 由于植物细胞的细胞壁和原生质体的弹性，此法在植物上的应用时进行了一些改进，即 将细胞用琼脂糖多聚赖氨酸固定。此外科学家们使用此方法不仅对细胞质，而且还对细 胞核【1 3 】、细胞器【1 4 1 等进行了定点的d n a 注射。 e 基因枪法 基因枪法又被称为高速微弹法或微弹轰击法，一般是用钨或金微粒( 直径1 - 2 # m ) 包裹外源d n a ，接着用一定的方法加速这种微粒，从而穿透植物细胞壁和细胞膜，使外 源d n a 能进入到植物细胞中。基因枪法首先是i 扫s e k im 【1 5 】等用于研究拟南芥组织细胞 的瞬时表达系统，后来又有人用于玉米【1 6 1 、水稻【1 7 1 、大豆【1 8 】和小麦i 1 9 】等一些标记基因 的表达，以便为研究外源基因在不同细胞类型中的表达提供参考的数据。基因枪转化效 率的主要影响因索有：微粒的大小、微粒的加速程度、外源d n a 的量、微粒与外源基因 结合程度、受体细胞的生理状态等等。 f 花粉管通道法 k o n s t a n t i n o v t 2 0 1 首先应用这种方法将外源d n a 导入植物的技术。在授粉后向子房注 射含有外源目的基因的d n a 溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将 外源d n a 导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发 育而成为携带有外源基因的新个体。花粉管通道法的优点是操作方便，而且能马上得到 种子，在时间上比较节省，而且不需要专门的仪器和昂贵的药品：但其缺点是工作量相 3 第一章前言 对巨大【2 。 1 1 1 2 植物转基因技术的应用、展望 随着植物转基因技术的飞速发展，越来越受到人们的重视和利用。选定带有特殊作 用的外源基因转入植物受体细胞内，使得植物获得某种特性，最终达到增加产量、改良 种系和生产外源蛋白等。为人类认识和利用自然，并为我所用作出了重要贡献。转基因 植物的主要有以下几个应用方面： 1 ) 抗除草剂转基因植物 将抗除草剂基因转入农作物，能有效地防治田间杂草。目前从植物和微生物中己克 隆出多种抗除草剂基因，如抗除草剂甘瞵的a r o a 基因【2 2 】和水解溴苯腈的b x n 基因【2 3 1 等。 2 ) 抗病毒转基因植物 通过导入植物病毒的外壳蛋白基因、病毒复制酶的基因、核糖体失活蛋白基因和干 扰素基因等，使植物获得或者提高抗病毒能力。已经利用烟草花叶病毒( t m v ) 2 4 】、苜 蓿花叶病毒( a i m v ) 2 5 l 、大豆花叶病毒( s m v ) 1 2 6 】、马铃薯x 和y 病毒( p v x 和p r y ) 2 7 , 2 8 】 等进行试验，使植物获得了对相应病毒的抗性。抗病毒转基因烟草已在进行田间试验， 且增产效果显著，这对现代医学和环境保护方面都有着重要的意义【2 9 1 。 3 ) 抗虫转基因植物 把抗虫基因转入农作物，由作物本身合成杀虫剂，从而获得抗虫性。抗虫基因有很 多的来源。来源于微生物苏云金芽孢杆菌( b t ) 的基因被广泛的应用1 3 0 , 3 1 l ，可以产生一 种6 一内毒素，它可进入害虫肠道后导致孔洞，进而导致害虫肠道受损，停止进食直至死 亡。来源于植物本身，主要包括蛋白酶抑制剂基因，例如豇豆胰蛋白酶抑制剂基因( c p t i ) 【3 2 ，3 3 】；淀粉酶抑制剂基因，例如菜豆骆淀粉酶抑制剂基因( a a i p v ) 3 4 】：植物外源凝 集素基因，雪花莲外源凝集素基因( g n a ) 【3 5 】等。来源于动物的抗虫基因包括蛋白酶抑 制剂基因，如牛胰腺胰蛋白酶抑制剂( b p t i ) 3 6 1 、脾抑制剂( s i ) 【3 7 1 、o a - 抗胰蛋白酶 ( 一a t ) 1 3 8 】、几丁质酶基因【3 9 】和神经毒素基因【删等。 4 ) 抗逆境转基因植物 向植物导入一些与胁迫抗性有关的基因可以提高植物的胁迫耐受能力。例如在水稻 中过量表达大麦的l e a 蛋白h v a i 时，转基因水稻种子苗和成熟植物对盐和干旱的抗性 均得到增强【4 。在烟草中过量表达大肠杆菌g r 基因，其叶片中g r 的含量水平将提高3 倍，对百草枯和s o ：的耐受力得到明显增强【4 2 1 。将烟草线粒体m n s o d 基因转移到苜蓿中， 苜蓿获得了对冰冻和干旱胁迫的耐性增加【4 3 1 。 4 西北大学硕士学位论文 5 ) 医药领域中的转基因植物 随着转基因技术的不断成熟，利用植物生产细胞因子、抗体、疫苗和酶等药物蛋白 已经成为可能，出现了大量的植物反应器。利用植物反应器，一般表达的药物蛋白都具 有很高的应用价值。例如将人的溶菌酶基因用水稻谷蛋白g t - 1 启动子调控，并连接转 运肽序列，得到能够表达溶菌酶的转基因水稻。用其作为食品的添加剂，能够减少腹泻 或上呼吸道感染的机会【删。 通过转基因技术可以优化植物的农艺性状，获得良好的经济效益。但是，关于植物 转基因研究中还存有一些潜在的问题，例如：食品安全性问题、一些病虫的抗性问题、 环境生态平衡问题等等。此外，在转基因技术方面也存在一些问题：外源基因尚未能定 点、定量导入受体细胞基因组中，并获得稳定、高效的表达和遗传，但却又不影响受体 生物本身优良性状的表达。随着生物技术产业化进程的加快，转基因技术也将会更加的 完善，产生的作用也将会是越来越重要。 1 1 2 转基因植株变异及其原因 j 应用转基因技术改良作物品种时，理想的结果是只将目标性状导入受体植物， 实现作物的定向改良。外源基因的导入会使植株获得新的特性，但随着其插入目标植物 基因组中，也将导致染色体上插入位点处的基因发生缺失而产生突变体【4 5 1 。 植株变异产生的原因是受多方面的因素所影响的。例如，基因的转化方法、组织培 养体系的筛选、再生组织的扩繁和继代等。此外，在很大程度上，变异是由外源基因的 导入而引起的。目前，比较认可的原因被概括如下： 1 ) 外源基因本身特性及其表达 为了增强外源基因的表达，提高其表达的稳定性，科学家们先后设计出了一系列的 策略和载体，包括强启动子、修改植物偏好密码子1 等等。然而，当外源基因与受体植 物基因存在较高的序列同源性时，则会导致内、外源基因表达同时受到抑制，即产生共 抑制现象【4 7 1 。因此，在转基因载体构建时，要注意以下几个方面的问题：避免使用与内 源基因同源的序列，尽量保持与内源基因在序列上的多样性；避免使用重复序列或基因 组片段，以防被甲基化酶识别：避免使用相同的启动子，应该从同一方向开始阅读以免 形成异常或反义r n a 。 2 ) 外源基因的位置效应 外源基因的表达受到插入位点及其周围序列的影响，这就是所说的位置效应。现在 普遍认为外源载体转基因到宿主染色体内，其整合位点是随机的，外源基因可以插入到 与 第一章前言 植物基因组的任何一条染色体的任何位点上，但是往往对转录活跃的区域具有优先插入 的特性【4 8 1 。外源基因在植物基因组中插入情况大致有三种：当外源基因插入到转录活跃 区域中时，外源基因就会顺应该区域的染色质结构，使其可以高水平的转录和表达；当 外源基因插入到转录不活跃区域的异染色质区中时，它只能进行低水平转录或发生基因 沉默；当外源基因插入到内含子中时，它会在转录后的剪接过程中将被剪接掉，最终得 不到表达【4 9 1 。 此外，随着外源基因的插入，使得受体植物的染色质上原有基因序列发生变化，进 而引起染色质的空间构象发生相应变化。此时，外源基因的序列也可能将随之发生改变， 从而使得其表达在一定程度上偏离原先的模式，或者使外源基因和内源基因的表达都受 到一定影响，甚至都出现基因沉默现象。 3 ) 受体细胞的表达调控系统 植物拥有着自己的一套防御及表达调控系统，这个系统对外源基因或物质的进入有 着识别、抵御和修复功能。因此，当外源基因转入道受体细胞中时，可能被受体植物的 基因组调节系统所识别，从而被基因表达调控系统修饰或视为异己加以剔除【矧。植物基 因组的防御体系基本包括两个：在外源基因整合插入前，复制修复系统的各种酶类物质， 将对其进行作用，使之出现断裂、降解、重排等，进而发生序列的改变f 5 l 】；在外源基因 整合插入后，其也会在植物的有性传递过程中出现重排或丢失【5 2 】。另外，甲基化也是植 物细胞中一种对外源基因常见的沉默原因【5 3 】。 4 ) 环境因素 环境对于植物生长和发育起着至关重要的作用。与动物相比，植物的基因调控和表 达对环境有高度依赖性，其中，光照、温度、水份、土壤肥力和外源激素等是主要的环 境因素。在一定环境条件下，基因的表达一般是由光控因子、热休克元件、顺式作用元 件和反式作用因子以及其它因子共同协同作用的结果【5 4 1 。然而，从植物感受环境信号到 基因表达调控，这中间仍存在着很多不问题，其机制尚不清楚。 1 2 流式细胞技术研究应用进展 1 2 1 流式细胞仪 流式细胞仪是进行流式细胞分析的仪器，集电子、计算机、激光、流体理论于体， 被誉为试验室的“c t 。 1 2 1 1 流式细胞仪的基本结构 6 西北大学硕士学位论文 流式细胞仪一般由三部分构成：1 ) 传感系统，包括样本递送系统、样品池、检测 系统、电子传感器和激光源等；2 ) 计算机系统；3 ) 电路、光路和水路系统，包括电源、 光学传导和滤片、鞘液循环和回收部分等。 1 2 1 2 流式细胞仪的基本工作原理 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞 的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样， 鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行 排列，依次通过检测区域。 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上， 被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向 光电二极管和9 0 0 方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信 号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色 性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。 y 这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光 电倍增管接收后可转换为电信号，再通过a d 转换器，将连续的电信号转换为可被计 算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示 在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查 询或进一步分析。 。 检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形 式表达，其x 轴为测量强度，y 轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率 有5 1 2 或1 0 2 4 通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据， 既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三 维立体视图。 细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超 高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些 液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在 高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器， 从而实现细胞的分离。 1 2 2 流式细胞技术 7 第一章前言 流式细胞术( f l o wc y t o m e t r y , f c m ) 是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子 进行定量分析和分选的检测手段，它可高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测 得多个参数，与传统荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当 代最先进的细胞定量分析技术嘲。 1 2 2 1 样本制备的基本原则 样本制备的基本原则：1 ) 使用的各种液体和悬浮细胞样本需为新鲜制备，尽快完 成样本制备和检测；2 ) 针对不同的细胞样本进行适当洗涤、酶消化或e d t a 处理，以清 除杂质，使粘附的细胞彼此分离而形成单细胞状态；3 ) 对新鲜实体瘤组织可选用或联 用酶消化法，机械打散法和化学分散法来获得足够数量的单细胞悬液；4 ) 对石蜡包埋 组织应先切成若干4 0 5 0 u m 厚的蜡片，经二甲苯脱蜡到水后，再用前述方法制备单细胞 悬液；5 ) 单细胞悬液的细胞数不应少于1 0 4 个。 1 2 2 2 植物样品细胞核悬液的制备 表1 是5 种常用的植物细胞核提取液的化学组成，细胞核染色质在含有镁离子的溶 液【5 硒8 1 和含有精胺的多胺缓冲液【5 9 】中可以保持稳定。在m a r i e 的分离缓冲液中，葡萄糖 的存在可以保持细胞核的完整性，并且防止核的凝聚【鲫。e d t a 可以结合二价阳离子， 被作为核酸酶辅助因子使用。柠檬酸钠作为一种温和的鳌合剂在很多缓冲液中被大量使 用，而无机盐则用来保证溶液达到一定的离子强度。这些缓冲液的p h 值一般都在7 0 8 0 之间，这与常用的d n a 荧光染料相同。两种非离子去污剂：t r i t o nx 1 0 0 和t w e e n2 0 ， 被用来将细胞核从细胞质中分离出来，去除残留在核表面的细胞质残片。伊巯基乙醇被 用来保护染色质蛋白，并消除酚类化合物对d n a 染色的干扰作用。由于伊巯基乙醇对 人体有很大的伤害，现在多用p v p 或偏重亚硫酸钾代替【6 l 】。 1 2 2 3 应用范围 流式细胞技术的应用：1 ) 测定细胞内d n a 的变异系数【6 2 1 ，此方法的准确性很高， 变异系数最小，一般在2 以下；2 ) 能准确地进行d n a 倍体分析【6 3 l ；3 ) 借助于荧光 染料进行细胞内蛋白质“1 和核酸的定量研究【6 5 】；4 ) 快速进行细胞分选1 6 6 1 和细胞收集6 7 】； 5 ) 医学应用及相关研究：疾病诊断【鲫，免疫功能研列6 9 1 ，癌症病人的多药耐药性【7 们 7 h ， 细胞功能及代谢动力学研究【7 2 1 ，血小板分析( 心血管疾病) 7 3 1 等；6 ) 细胞生物学和分 子生物学研究【7 4 1 。 3 西北大学硕上学位论文 表1 常用细胞核提取缓冲液 t a b 1t h em o s tp o p u l a rb u f f e r su s e df o rp r e p a r a t i o no fn u c l e i 缓冲液名称 g a l b r a i t h b u f f e r c 5 5 1 组成 4 5 r a mm g c l 2 ，3 0 m ms o d i u mc i t r a t e ，2 0 m mm o p s ，0 1 t r i t o nx 1 0 0 5 0 r a mg l u c o s e ，15 m mk c l ，15 r a mn a c l ，5 m mn a 2 e d t a ，5 0 m ms o d i u mc i t r a t e ， m a r i eb u 妇f e 一1 0 5 t w e e n2 0 ，5 0 m mh e p e s ，0 5 b - m e r c a p t o e t h a n n o l 2 0 0 m mt r i s ，4 m mm g c l 2 6 h 2 0 ，o 5 t r i t o nx - 10 0 b u 丘“5 6 】 a r u m u g a n a t h a n 9 5 3 m mm g s 0 4 7 h 2 0 ，4 7 6 7 m mk c i ，4 7 7 m mh e p e s ，6 4 8 m md t r , 0 2 5 b u f f e i l 5 7 1t r i t o nx 一1 0 0 i5 m mt r i s ，2 m mn a 2 e d t a ，o 5 m ms p e r m i n e 4 h c i ，8 0 m mk c l ，2 0 m mn a c i ， l b 0 1b u f f e r t ”j 1 2 - 3 展望 流式细胞仪从细胞技术的提出发展至今，6 0 至7 0 年代是其飞速发展时期，激光技 术、喷射技术以及计算机的应用构成了流式细胞仪在原理和结构上形成了特有的、固定 的模式。在随后的时间里，流式细胞仪开始逐渐的商品化，这期间不断有新型号的仪 器推出，在多参数检测技术上得以不断地提高和完善。 进入9 0 年代，随着微电子技术特别是计算机技术的发展，流式细胞仪的功能也越 来越强大，出现了很多新的设备，例如全反射荧光流式细胞仪【7 5 】，此外在数据管理、数 据分析方面有了长足进步。然而，在技术原理和设计方面一直没有突破性的进展。人们 将更多的注意力开始投向流式细胞仪的各种应用，不断提出新的荧光探针、新的荧光染 料、新的染色方法等等，使流式细胞技术在新的细胞参数指标分析方面日益发展。在分 析软件上，设计出了更多的、操作简便的、功能强大的应用分析软件和图形编辑软件， 全面的提高队数据自动分析能力。 1 3 双向电泳技术的研究应用进展 1 3 1 蛋白质组学 9 第一章前言 蛋白质组( p r o t e o m e ) 指由一个基因组( g e n o m e ) 或一个细胞、组织表达的所有蛋 白质。这一概念的是澳大利亚m a c q u a r i e 大学的w i l k i n s 和w i l l i a m s 于1 9 9 4 年最先提出 的【7 6 j 。在翻译转录时，一个基因可以以多种m r n a 形式进行剪接，并且同一蛋白可能 以许多形式进行翻译后的修饰。所以一个蛋白质组并不是一个基因组的直接产物，蛋白 质组中蛋白质的数目有时可以超过基因组的数目。因此，蛋白质组更为准确的定义应为 一种细胞内存在的全部蛋白质。生物体内的蛋白质组随着组织发育、功能的建成和受环 境状态的改变而改变。蛋白质组学旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式， 其内容主要包括鉴定和分析蛋白质的表达水平、存在方式、修饰形式、结构、功能及其 他们的相互作用等。 1 3 1 1 植物蛋白质组学 近些年来，基因组学研究发展迅速，先后己经完成了多种模式植物和重要农作物基 因组的测序工作【7 7 1 。植物基因组学研究已经转入到功能基因组学的研究上面。目前已经 提出了很多功能基因组学研究的新方法，例如e d n a 微阵列、d n a 芯片、基因表达系统 分析( s e r i a la n a l y s i so f g e n ee x p r e s s i o n ，s a g e ) 和基因敲除( g e n ek n o c ko u t ) ，它们都 能够有效分析和鉴定大量基因的表达模式和功能类型。然而基因的功能最终是以蛋白质 的形式表现出来的，每种蛋白质都有其特有的存在和活动规律，因此在转录水平上获得 的基因表达的信息并不足以揭示其在细胞内的确切功能，这就需要直接分析蛋白质的表 达模式和功能模式。蛋白质组学即成为了现今生物学界的新的研究热点。植物蛋白质组 学是在植物基因组学的研究成果基础上，利用高通量的蛋白质分析技术和鉴定技术，对 植物细胞内蛋白质组学进行研究的- - f - i 新兴学科。高通量蛋白质组技术包括双向电泳技 术( t w o d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i s ，2 - d e ) 、蛋白质芯片技术、质谱技术和酵母双杂 交技术，这些技术促进了植物蛋白质组学的发展。目前，植物蛋白质组学研究已由植物 类群、组织、器官和细胞水平深入至亚细胞水平【7 引，一些重要的细胞器，如叶绿体、线 粒体等蛋白质组已被分析和鉴定，已发现了许多新的叶绿体和线粒体蛋白质【7 9 8 1 】。 1 3 1 2 蛋白质组学技术 蛋白质组学技术大致包括一下三大技术：1 ) 蛋白质分离技术：2 ) 鉴定技术( 如生 物质谱技术) ；3 ) 蛋白匹配数据库分析技术。 该技术的过程流程基本为：蛋白样品制备一2 d e 电泳一图像采集、比对和分析一凝 胶切点一胰蛋白酶( t r y p s i n ) 等消化一提取肽混合物- - m a l d i t o f m s 质谱技术分析 一获得肽质量指纹( p m f ) 一在m a s c o t 等数据库中进行蛋白质匹配一获得鉴定蛋白质一 l o 西北大学硕士学位论文 对蛋白进行功能验证。 1 3 。2 双向电泳技术 1 9 7 5 年o f a r r e l 等首次提出双向电泳技术【8 2 】，其方法可以在同一块凝胶上同时分离数 千种蛋白，因此在蛋白质组学研究中一直处于核心地位。随着质谱分析技术的发展，双 向电泳技术与之的结合使用，满足了准确、快速、高通量的蛋白质组学研究的需求8 3 , 9 4 】。 目前，双向电泳系统大都使用的是第一向为等电聚焦( i s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，i e f ) ， 第二向为s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，s d s p a g e ) 的二维电泳体系。样品经过电荷和质量水平上的两次分离后，蛋白可以以点的形态展现 出来。根据c a r t e s i n 坐标系统，从左到右是等电点的增加，从下到上是分子量的增加。 该技术的基本流程如下： 1 ) 样品制各 样品制备的好坏对双向电泳的最终结果来说是至关重要的。它的主要目标是去除 盐、脂类、多糖和核酸等干扰物质，尽可能提取组织或细胞内所有蛋白，同时防止蛋白 发生化学修饰或降解，保证蛋白的完整性。其主要步骤包括细胞破碎、干扰物去除、蛋 白提取及复溶。在这整个过程中，蛋白的提取和复溶是关键步骤，其中涉及到裂解液的 选择和严谨度的高低。针对不同样品和实验目的应选用适当的裂解液和严谨度。严谨度 越高，样品中的干扰物就越少，样品更为纯化，但同时会损失部分蛋白，丢失蛋白差异 信息。 目前，在双向电泳中所用的裂解液一般包括中性促溶剂( 尿素，硫脲) 、非离子去 污剂( n p 4 0 ，t r i t o nx - 1 0 0 ) 或兼性离子去污剂( c l a j p s ) 、还原剂( d t t ，d t e ，t b p ) 、 载体两性电解质或i p g 缓冲液等。 植物组织中一般含有大量的色素、酚类、核酸及次生代谢产物，这些物质都严重影 响双向电泳分辨效果。v a l c u 等人【8 5 l 设计出了一种适合溶解分离木本植物的蛋白裂解 液，并且发现尿素与硫脲组合的溶解效果不因样品类型的改变而改变，去污剂组合的溶 解效果却因样品类型的改变而改变。g o m e z 等人在实验中建立了一套适用于椰枣树叶 片中提取全蛋白的提取液体系。m a l d o m a d o 8 7 】等人比较了三种不同的蛋白提取裂解液， 在蛋白产率上没有显著的差别，提取的蛋白大多存在p h5 - 8 和1 4 8 0 k d a 范围之内，t c a 丙酮酚法对蛋白点的聚焦、强度、重现性有较好的结果。s a r m a1 8 8 1 等人系统地研究了提 高双向电泳的分辨率的植物蛋白分离提取和稳定性的问题，提出将d t t 用于所用的溶 液中，采用含用大量d t t 的高浓度去污剂和交性剂的混合提取液可以提高蛋白的复溶 1 1 第一章前言 效果，并增强样品蛋白液的稳定性。这些裂解液适合多种组织和细胞蛋白质样品的制 备，但是对具体样品有时也需要做适当的改进。 2 ) i e f 等电聚焦是目前最常用的第一向分离技术。该技术是根据蛋白质的等电点不同而将 它们分开，因此p h 值梯度的维持对其是相当重要的。 在最早的等电聚焦中，是通过两性电解质在聚丙烯酰胺管胶内产生的p h 梯度将蛋 白质分离【8 9 1 。然而这种方法存在着很多的缺点：1 ) 重复性差：2 ) p h 梯度不稳定：3 ) 管胶机械强度低。g 6 r g 等人【则是首先使固相胶条进行等电聚焦电泳。固相胶条发展至 今，已经具有不同p h 范围、不同线性关系、不同长度，而且完全商品化。近些年来， 极窄p h 范围的重叠固相胶条及碱性p h 范围胶条的出现，进一步提高了低丰度蛋白和 疏水蛋白的分辨率，对蛋白质组学研究提供了新的研究平台。 样品的上样量和聚焦程序的选择是等电聚焦的两个核心内容，需根据不同样品特 性、i p g 胶条的p h 范围和长度、凝胶染色的方法等因素进行优化选择。 3 ) 胶条平衡 目前，比较常用的是两次平衡，分别在平衡缓冲液中加入d t t 和碘乙酰胺。第一 次平衡加入d t t 的作用是打开二硫键，保持蛋白还原状态，使之能与s d s 充分结合； 第二次平衡加入碘乙酰胺是为了去除多余的d t t ，保证第二向电泳结果的稳定性。 4 ) s d s p a g e s d s p a g e 一般分为水平式及垂直式两种类型，两者各有特色【9 l 】。凝胶的制备也分 为均一胶和梯度胶两种模式。s d s p a g e 胶浓度的选择，需根据样品性质和实验目的而 定，最常用的是分辨范围在1 5 6 0 k d a 的1 2 t 均一胶。均一胶的优点是灌胶方便，重 复性好；缺点是蛋白点较为集中，分辨率不高。常用的缓冲系统是l a e m m l i 的t r i s g l y c i n e 不连续缓冲液系统【9 2 】。针对于低分子量蛋白( 小于1 5 k d a ) 一般采用t r i s t r i c i n e 缓冲液 系统，糖蛋白则采用硼酸盐。 4 ) 图像获得和扫描分析 凝胶染色的目的是把所分离的蛋白可视化，目前常用蛋白染色方法有靠马斯亮蓝法、 银染法、荧光标记染色法和负染法等，它们在操作性、灵敏度、兼容性及定量分析等方 面各有特剧9 3 1 。 5 ) 蛋白检测与鉴定 关于蛋白质的鉴定，现比较常用的方法有h p l c m s 、l c e s i - m s 和m a l d i - t o f - m s ， 1 2 谣北大学顶i ：学位论文 它们在操作系统、处理模式、鉴定能力上各有特点【9 4 1 ，应根据具体的实验目的选定，或 者选取同时多种方法。 1 3 3 双向电泳技术在植物蛋白质组学中的应用 差异蛋白质组学作为蛋白质组学的一个研究策略，它的主要目标是研究各种因素引 起的蛋白质组成或者含量变化，以发现具有差异的蛋白质，通过对这些差异蛋白进行深 入研究，探究影响因素和蛋白质变化的机理。目前，差异蛋白质组学作为专门的技术体 系广泛应用于植物生理、植物组织器官和亚细胞、植物突变体、植物遗传多样性等多方 面研究。双向电泳技术则为差异蛋白质组学研究的主要技术。 在植物生理应答机制的研究中，以双向电泳技术为核心的差异蛋白质组学研究被大 量应用。植物在受到外界环境中的许多因子作用时，会引起植物体内大量的蛋白质在表 达种类和数量上发生变化，研究这些差异蛋白质可以使我们更好地了解植物对环境的信 号应答和适应机制等。x u 等人【9 5 】利用紫外线照射大豆，发现其叶片中黄酮含量出现明 显变化，因此，他们利用双向电泳技术分别分析了经过和不经过紫外照射的大豆叶片蛋 白，鉴定出了6 7 个变化显著的蛋白质，它们分别参与了包括疾病防御、能量代谢、蛋白 合成、转录和次级代谢等很多生物过程，为研究黄酮在保护植物叶片抵御紫外线伤害机 制方面提供了大量的资料基础。n e i l a 等人【9 6 l 利用双向电泳技术研究了盐胁迫下一种葡萄 品种( t u n i s i a n ) 的蛋白质组学变化，实验结果发现植物经过浓度为1 0 0 m m o l l 的n a c l 处理1 5 天后，共检测和鉴定了9 个下调蛋白，3 2 个上调蛋白和7 个新蛋白。 此外，在植物转基因突变研究中，应用双向电泳技术对经转基因或基因敲除产生的 重组体与野生对照株进行差异蛋白质组学研究，并结合基因功能研究，可为转基因突变 后的生理生化变化提供信息。r o c c o 等人【9 7 】在烟草植物中表达番茄p r o s y s t e m i n 基 ，烟 草获得较高的抗病原体和氧化应激作用，然后利用双向电泳技术分析了烟草叶片的蛋白 质组学，为利用蛋白质组学技术系统分析植物组织转基因的表达机制提供资料。k o m a t s u 等人【9 8 】利用双向电泳技术分析了突变型的水稻胚蛋白质组，鉴定出明显下调表达的7 种 胚蛋白，通过后续实验