（生物化学与分子生物学专业论文）lbparacasei+hd17对小鼠肠道微生态体系的影响.pdf

中文摘要 中文摘要 肠道微生物区系是由致病菌和非致病菌构成的一个极其复杂的生态系统，在 人类的健康和疾病中起着十分重要的作用。因而，对这个复杂的微生物生态系统 及其微生物多样性的探索已成为近年来的研究热点。本课题主要探讨了 l b p a r a c a s e ih d l 7 菌对机体肠道内环境的耐受能力以及与其它肠道菌群的相互作 用情况，并检测其对小鼠肠道微生态体系的调节作用，为后续功能性保健食品的 开发奠定基础。 论文首先摸索- f l b p a r a c a s e ih d l 7 对胃肠环境的耐受性。结果表明，在空腹 条件下，l b p a r a c a s e ii - d i 7 对模拟人工胃液和肠液具有良好的耐受性，在p h 3 的胃液和p h 8 0 的肠液中生长良好，且可以保持相对较高的存活率；在添加乳蛋白 的模拟人工胃液中的存活率明显高于空腹情况，且存活时间延长；且食用液体早 餐能明显增强l b p a r a c a s e i i - i d l 7 的存活率。l b p a r a c a s e i h d l 7 对0 1 0 3 的胆盐 环境中均有良好的耐受能力。 其后探索了l b p a r a c a s e ih d l 7 在体外对肠道致病菌和肠道益生菌的作用情 况。试验结果显示，l b p a r a c a s e ih d l 7 能够明显的抑制沙门氏菌、志贺氏菌、大 肠杆菌和变形杆菌四种肠道致病菌的存活，并对青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、 嗜酸性乳杆菌和酵母菌四种肠道益生菌无影响。 最后研究了l b p a r a c a s e i h d l 7 对小鼠肠道微生态区系的影响。以昆明种小鼠 作为研究对象，用细菌浓度为2 x1 0 8 c f u m l 的l b p a r a c a s e ih d l 7 连续灌胃小鼠 l o d ，取其盲肠内容物，提取细菌总基因组d n a ，p c r 扩增16 sr d n av 3 可变区， 通过对实验组和空白组小鼠肠道菌群d g g e 指纹图谱进行分析可知，每只小鼠个 体的肠道内均存在一定数量的优势种群，而在灌胃l b p a r a c a s e i h d l 7 后，小鼠肠 道内的优势菌群发生了明显的变化，说明l b p a r a c a s e i h d l 7 对肠道微生态有着重 要的调节作用，它能够导致肠道内的微生物区系的改变，不仅可以使原肠道内的 优势菌群和非优势种群相互间发生转变，而且也可以促进部分新菌种在肠道中的 黑龙江大学硕士学位论文 定植，也能够抑制某些菌株的生长甚至使其消失。 关键词：l b p a r a c a s e ih d l 7 ：胃肠耐受；微生态体系；p c r d g g e a b s t r a c t a b s t r a c t i n t e s t i n a lm i c r o b i a lf l o r a sa rec o m p l e xe c o s y s t e m sm a k eu po fn o n p a t h o g e n i c b a c t e r i aa n dp a t h o g e n se x t r e m e l y ，a n dt h e yp l a yf u n d a m e n t a l l yi m p o r t a n tr o l e si n h u m a nh e a l t ha n dd i s e a s e t h e r e f o r e ，i n v e s t i g a t i n gt h i sc o m p l e xm i c r o b i a le c o s y s t e m s a n dm i c r o b i a ld i v e r s i t yi nr e c e n ty e a r sh a sb e c o m et h eh o t s p o t t h em a i nt o p i c s d i s c u s s e dt h et o l e r a n c eo fl b p a r a c a s e ih d1 7i nt h e g a s t r o i n t e s t i n a lt r a c t ；t h e i n t e r a c t i o no fl b p a r a c a s e ih d1 7a n di n t e s t i n a lb a c t e r i a , a n dt h ei n f l u e n c eo fg u t m i c r o f l o r ao fm i c e ，t h e s ei n v e s t i g a t i o n sw i l lh a v es i g n i f i c a n te f f e c to nt h ee x p l o i t a t i o n o ft h ef u n c t i o n a ln 1e a n ! n if o o dp r o d u c t s f i r s to fa l l ，t h et o l e r a n c eo fl b p a r a c a s e ih d l 7u n d e rd i f f e r e n tg a s t r o i n t e s t i n a l e n v i r o n m e n ti ss t u d i e d t h er e s u l t ss h o wt h a ti nf a s t i n gc o n d i t i o n s ，l b p a r a c a s e ih d 1 7 i sa b l et ot o l e r a t ea r t i f i c i a ls i m u l a t i o no ft h eg a s t r o i n t e s t i n a lp hv a l u eo fw h i c hi sl a g e r t h a n3 ；a n dc o n s u m p t i o no fl i q u i db r e a k f a s tl b p a r a c a s e i h d l 7c a ns i g n i f i c a n t l y e n h a n c et h es u r v i v a lr a t e l b p a r a c a s e i h d l 7o fb i l es a l th a sag o o dt o l e r a n c ei nr a n g e o fo 1t o0 3p e r c e n to ft h eb i l es a l ti nt h ee n v i r o n m e n t l b p a r a c a s e ih d 1 7w a se x p l o r e di nv i t r oi n t e s t i n a l p a t h o g e n i cb a c t e r i aa n d i n t e s t i n a lp r o b i o t i c si n t h er o l e t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，l b p a r a c a s e ih d1 7c a ni n h i b i t t h es u r v i v a lo fs a l m o n e l l as p ，s h i g e t l as p ，e s c h e r i c h i ac o l ia n dp r o t e u sv u l g a r i s o b v i o u s l y ，a n dh a v en oe f f e c t o ft h e g e n e r a t i o n o fb i f i d o b a c t e r i a a d o l e s c e n t ， b i f i d o b a c t e r i a i n f a n t i s ，l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sa n ds a c c h a r o m y c e t e b e s i d e s ，t h ee f f e c t i o no fl b p a r a c a s e ih d1 7t ot h ei n t e s t i n a lm i c r o e c l o g yi s s t u d i e d k u n m i n go r i g i nw h i t em i c ea r eg i v e nl b p a r a c a s e ih d1 7 、析t hb a c t e r i a c o n d e n s a t i o no f2 10 8 c f u m l c e c a lf a e c e sa r eo b t a i n e d ，a n dt h eg e n o m i ct o t a ld n a o fb a c t e r i aa r ea b s t r a c t e d ，a n dt h e n l6 sr d n av 3v a r i a b l ea r e af r a g m e n t sa p p l i f i e db y p c r ，t h ed g g ef i n g e rp r i n tp r o f i l eo fe x p e r i m e n t a lg r o u pa n db l a n kg r o u pa p p r o v e i i i 黑龙江大学硕士学位论文 t h a tc e r t a i na m o u n to fd o m i n a n c yo fi n t e s t i n a lf l o r ae x i s ti ne v e r ye x p e r i m e n t a lm o u s e t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ed o m i n a n c yo fi n t e s t i n a lf l o r ai ne x p e r i m e n t a lm o u s ec h a n g e s a f e r g i v e nl b p a r a c a s e i h d1 7 ，w h i c hm e a n sl b p a r a c a s e i h d 1 7c o u l da d j u s tt h e i n t e s t i n a lr n i c e c o l o g y , w h i c hc a nn o to n l yt r a n s f o r mt h ed o m i n a n c yo fi n t e s t i n a lf l o r at o u n d o m i n a n c yo fi n t e s t i n a lf l o r a , b u ta l s oh e l pt h e c l o l o v i z a t i o no fs o m en e wb a c t e r i ai n i n t e s t i n a l b e s i d e s ，i tc a na l s oi n h a b i tt h eg r o w t ho fc e r t a i nb a c t e r i a , e v e nm a k et h e b a c t e r i av a n i s h k e yw o r d s ：l b p a r a c a s e ih d1 7 ；t o l e r a n c eo fg a s t r o i n t e s t i n a lt r a c t ；m i c r o e c o s y s t e m ； p c r d g g e i v 黑龙江大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨蕉堑态堂或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料。 学位论文作者签名： 绡佩 签字日期：灿矿年厂月l 2e t 学位论文版权使用授权书 本人完全了解墨虚堕太堂有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权墨蕉! 态堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。 学位论文作者签名：彳寸了武、 签字日期：凇辟彳月f 乞日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 翩雠：嗽7 签字日期：。夕毽年月 7 - e t 电话： 邮编： 第1 章绪论 第1 章绪论 肠道细菌群是由致病菌和非致病菌构成的一个极其复杂的生态系统i l j ，正常人 胃肠道内生活着大量的细菌，成年人体内约有4 0 0 多种细菌，细菌数超过1 0 0 万亿， 它们相互依赖又相互制约，共同作用于机体。 近年来，越来越多的学者认识到肠道菌群对人类健康的重要性。尽管外界环境因 素以及宿主的遗传组成对肠道菌群的分布会起到调节的作用，但人们已经越来越 深刻地认识到膳食成份对肠道菌群的构成及代谢的有益调节作用【l 】，摄取外源微生 物是一条有效途径。现代研究正逐步揭开天然无致病性微生物，即益生菌在维持 人类健康和治疗各种肠道疾病方面的潜在功划引。益生菌是一种通过改善肠道微生 物平衡从而对宿主施加有益影响的活的微生物【3 j ，它能够迅速提高机体的抗病、代 谢能力，并促进机体的生长。它不能直接杀灭病原体，而是抑制病原菌的生长， 降低胃肠中的炎症【4 】。在用于临床治疗时，不仅能克服抗生素治疗时的缺点，毒副 作用及耐药性或抗药性问题，还可防治微生态平衡失调，通常被用来治疗与胃肠 道相关的疾病。寻求安全而有效的益生菌生产出益生菌制剂对改善肠道微生物生 态平衡具有积极的协助治疗的作用。 1 1 肠道菌群 1 1 1 肠道茵群的构成 近几十年来，随着现代科学技术的迅猛发展，人们逐渐认识到肠道微生物生态系 统是人体最大、最复杂的微生态系统( m i c r o e c o s y s t e m ) ，其中存在着大量不同类型、 含量多少不一的各种细菌，其数量约1 0 倍于人体真核细胞。在正常生理状况下， 肠道含有4 0 0 5 0 0 种不同类型的细菌，其重量约为1 - 2 k g 。这些细菌主要寄居于远 端小肠、盲肠、结肠等部位，其中9 0 9 9 9 是专性厌氧菌，兼性厌氧菌和需氧 菌约为o 1 一1 0 。这一庞大的细菌群组成了消化道的正常菌群，也构成了一个极 其复杂的生态系统，这些微生物群对于人体健康和正常的生理代谢起着极其重要 黑龙江大掌硕士学位论文 的作用，它可以帮助人类消化食物【5 1 、代谢药物及外源复合物【6 1 、合成维生素1 7 1 、 抑制病原体的侵袭峭j ，影响免疫机能的发育等等。其赖以生存的营养物质，均来自 于宿主的食物，不同人群由于其生活环境、饮食结构的差异，提供给益生菌的营 养成分差异很大，各自菌群的种类和优势菌也有所不同，不同种类的肠道菌群结 构，对肠道的生理功能将产生不同的影响1 9 1 。若是内外环境发生重大变化时，这种 平衡就要遭到破坏，发生微生态失调，并引起宿主各种类型的疾病【l o l 1 。 1 1 2 肠道菌群的分类 肠道个体菌群分为3 个部分：( 1 ) 生理性细菌，与宿主共生关系，为专性厌 氧菌，是肠道的优势菌群，如双歧杆菌、类杆菌、优杆菌和消化球菌等是膜菌群 的主要构成者，具有营养及免疫调节作用。( 2 ) 条件致病菌，与宿主共栖，以兼 性需氧菌为主，为肠道非优势菌群，如肠球菌、肠杆菌，在肠道微生态平衡时是 无害的，在特定的条件下具有侵袭性，对人体有害。( 3 ) 病原菌，多为过路菌， 长期定植的机会少，生态平衡时，这些菌数量少，不会致病，如果数量超出正常 水平，则可引起人体发病，如变形杆菌、假单胞菌和韦氏梭菌等f 1 2 1 。 不同类的细菌在肠腔的空间分布也不相同，肠道细菌在肠腔内形成3 个生物 层：深层的紧贴粘膜表面并与粘膜上皮细胞粘连形成细菌生物膜的菌群成为膜菌 群，主要由最具生理意义的双歧杆菌和乳酸杆菌组成；中层主要为粪杆菌、消化 链球菌、韦荣球菌和优杆菌等厌氧菌：表层的细菌可游动成为腔菌群，主要是大 肠杆菌、肠球菌等好氧和兼性好氧菌f 1 3 】f 1 4 1 。 1 1 3 肠道菌群的生理作用 1 1 3 1 营养作用 定植在大肠的有益共生菌主要发酵不能被小肠消化的多糖如抗消化淀粉、纤 维素、半纤维素、果胶、和菊搪和低聚搪如低聚果糖掣1 洲i i6 1 。同时也能分解部分 的多肽和蛋白质。物质代谢的终产物主要是短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸。 丁酸是肠上皮细胞主要的能源物质，它可促进肠皮的修复和增殖。此外，一些肠 第1 荦绪论 道厌氧菌可以合成多种维生素如b l 、b 2 、b 1 2 ，维生素a 、e 、k 等1 1 7 1 ，且可产生多 种微量元素与矿质离子，参与钙、镁、铁等离子的吸收【1 8 】，矿质离子的吸收有利 于糖等物质代谢顺利地进行。 1 1 3 2 保护作用 定居于肠道内的正常菌群构成了机体一道十分重要的屏障，能阻止潜在的致 病菌的入侵或外袭菌在粘膜上的定植。通过实验发现，无菌动物对条件致病菌有 较高的敏感性【1 9 1 ，定植抗性也限制了条件致病茵在胃肠道的生长。肠道厌氧菌对 于维持正常的肠蠕动起着重要的作用，而正常的肠蠕动是阻止致病菌在肠道定植 的一个重要手段，而且厌氧菌产生的短链脂肪酸使肠腔内呈酸性，氧化还原电位 低，不利于致病菌的繁殖【2 0 1 。 1 1 3 3 免疫作用 正常菌群促进免疫器官的发育成熟。在无菌动物的胃肠粘膜上，淋巴细胞较 少，并且血液中免疫球蛋白的浓度较低。j i a n g 等发现但把无菌动物暴露于普通条 件下，淋巴细胞的数目迅速增长，血清中免疫球蛋白的浓度上升1 2 1 1 。l a o 等经过实 验也证明双歧杆菌能激活机体的吞噬活性2 2 1 ，m a l c i n o 等研究得知双歧杆菌可以促 进机体特异性和非特异性抗体的产生【2 3 】。乳酸杆菌可刺激脾中的n k 细胞活性， 有研究发现口服乳酸杆菌死菌可使其t h l 细胞增殖，从而导致l g e 抗体产生增加 【2 4 】。亦有研究者发现细菌孢子可安全有效的通过肠道屏障将异体抗原传递给新个 体并引起t h l 细胞反应和细胞免疫，这给疫苗的研究开辟了新的方向【2 5 】。 1 1 4 肠道微生态平衡 微牛态平衡是指在长期进化过程中形成的正常微生物群与其宿主在不同发育 阶段的动态的生理性组合，这个组合是指在共同宏观环境条件影响下，正常微生 物群各级生态组织结构与其宿主体内、体表的相应的生态空间结构正常的相互作 用的生理性统一体，这个统一体的内部结构和存在状态就是微生态平衡人体肠道 栖息着大约多种菌群，1 4 个菌属，其中主要包括有双歧杆菌属、乳酸杆菌属、类 杆菌属、真杆菌属等。虽然整个肠腔内都存在大量细菌，但分布、浓度不一。各 黑龙江大学硕士学位论文 种属细菌处于相互牵制，动态平衡状态。正常微生物群随着宿主的年龄、生理功 能的变化而变化。肠道微生物达到动态的、相对稳定的、协调的微生态平衡是机 体健康的保证和象征之一。 1 1 5 肠道菌群的微生态失调 肠道固有菌群之间在长期生长过程中形成既相互依赖又互相制约的共生状 态。正常情况下，肠道菌群按一定的比例组合，各菌之间互相制约，互相依存， 在质和量上形成一种生态平衡。正常肠道菌群可能通过以下机制抑制病原体的侵 袭，成为宿主的生物屏障：( 1 ) 直接作用：产生抗菌物质和杀菌素，可降低病原体 毒素、杀死或抑制外袭菌，如肠道内乳酸杆菌在抑制肠内腐败菌生长和繁殖的同 时，对金黄色葡萄球菌、变形杆菌、副伤寒沙门菌、大肠杆菌、痢疾杆菌有杀灭 作用；肠道内固有菌密集地栖息在肠黏膜表面，阻碍了病原体与肠黏膜的接触。( 2 ) 间接作用：刺激宿主的免疫和清除机能，如促进抗体和增加干扰素的产生、刺激 吞噬细胞的功能，另外还可以产生非结合胆酸，破坏某些病原菌。总之，以厌氧 菌为主的肠道原籍菌与肠粘膜紧密粘附，产生定植抵抗力，并借助于固有的肠粘 膜屏障和肠道内的杀菌物质及免疫系统，共同防止外籍菌的粘附和定植，从而维 持肠道内微生态环境的平衡l 冽。 在外环境的影响下，机体正常微生物群之间及组成正常微生物群的微生物之 间的平衡遭到破坏所引起的病理过程称为微生态失调。引起生态失调的因素很多， 如宿主受到环境不适、抗菌药物的使用、机体患病和治疗、外源致病菌入侵等的 影响。主要表现在宿主和环境两方面因素：a 宿主因素如机体的饮食、精神、刺 激、感染以及宿主的种类、年龄、性别、生活习惯、生理、发育、营养等对体内 菌群都会有影响。b 环境影响如手术、放疗、化疗和抗生素药物的使用，破坏了 微生态平衡的危害已毋庸置疑。机体在以上因素作用下免疫机能降低，外袭菌更 易侵入和繁殖，而且免疫力低下时更易引起肠内菌向上、向体内移位。向上移位 逆向繁殖，甚至可引起肺炎；向体内移位，引起肠源感染和内毒素血症，甚至导 致多系统器官功能衰竭1 2 7 j 1 2 8 】。 第1 章绪论 1 1 6 肠道菌群组成的影响因素 人体肠道菌群的组成和很多因素有关。除了上面提到的宿主基因型的影响以 外，很多环境因素例如不同的饮用水纯净度，食物的质量，不同的卫生条件，甚 至不同的气候都使得生活在不同地域的人们肠道菌群有所不同。 1 1 6 1 年龄 近年来，很多研究表明肠道菌群的组成与宿主的年龄相关。f a v i e r 等人在对 两例自然分娩婴儿肠道菌群进行长达十个月的跟踪分析之后发现新生儿肠道内最 先定植的是b i f i d o b a c t e r i a ，而一些发酵产酸的细菌如s t r e p t o c o c c i 和e n t e r o c o c c i 则在母乳喂养期间可以检测到【2 9 1 。婴儿在两岁的时候结肠中的菌群结构就与成年 人相类似t - t 3 0 1 ，但是随着年龄的增长，肠道内的菌群组成会发生变化，肠道内的 厌氧菌，如b i f i d o b a c t e r i a 减少而e n t e r o b a c t e r i a 增加【3 1 】。h e 等人在从7 例健 康成年人与6 例健康老年人的粪便样品中分离到5 1 株双歧杆菌菌株，经过鉴定 以后，发现在健康成年人肠道中出现的双歧杆菌有b a d o l e s c e n t i s ，b b r e v e ，b i n f a n t i s 和丑l o n g u m ，而在老年人肠道中出现的双歧杆菌有& a d o l e s c e n t i s 和最 l o n g u m ，通过体外实验检测这些菌株对于肠粘膜的吸附能力，结果表明从健康老 年人肠道中分离到的双歧杆菌和粘膜的吸附能力与从健康成年人肠道中分离到的 双歧杆菌相比有所下降，这也可能是双歧杆菌在老年人肠道中种群数量减少的原 因之一【3 2 1 。 1 1 6 2 饮食 近年来，很多研究利用分子生物学的技术研究饮食与肠道菌群的关系。许多 基于培养的研究表明，不同的食谱以及不同的营养摄入情况直接影响肠道菌的组 成1 3 3 1 ，增加食物中谷物纤维，果胶，脂肪和蛋白质的含量，可以影响不同种类的 细菌在肠道内的生长情况p 4 1 。高脂摄入可以使厌氧菌生长加快，而高蛋白摄入有 利于好氧菌的生长。此外，通过对粪便样品中的细菌脂肪酸进行气液色谱分析， 人们发现素食也可以影响肠道菌群的组成。w a n g 等人通过跟踪两例自然分娩婴儿 肠道菌群在出生后六个月的动态变化，发现在母乳喂养阶段婴儿肠道相对稳定， 黑龙江大学硕士学位论文 但是在断奶期间肠道菌的变化比较明显。另外也有研究发现食用奶粉的婴儿肠道 内有一个相对复杂的微生物系统，包括s t a p h y l o c o c c i 、e n t e r o b a c t e r i a 、c l o s t r i d i a 而母乳喂养的婴儿肠道内则是b i f i d o b a c t e r i a 占优势。 1 。1 6 3 运动情况 运动情况也会影响一个人的肠道菌群，有研究表明减少老年人两周的活动量 就可以对食物通过肠道的时间造成一定的影响。研究者认为，运动可以加速肠道 的蠕动，减少肠内容物通过肠道的时间，从而改变肠道细菌的生长环境。老年人 尤其是患有某种疾病的老年人运动较少及长时间的卧床，导致了肠内容物通过肠 道的时间增加，肠道内细菌细胞数量减少【3 5 】。 1 1 6 4 分娩方式 婴儿在离开母体前肠道内是一个无菌的环境，在出生时通过与母体及外界环 境的接触，婴儿肠道内迅速接种细菌，不同的分娩方式对于婴儿肠道菌的组成是 有一定影响的。g r o n l u n d 等人通过培养的方法对3 4 例自然分娩的儿童及3 0 例 剖腹产儿童的肠道菌群组成进行长达半年的跟踪研究，结果表明剖腹产婴儿粪便 菌的定植晚于自然分娩的婴儿。h a l l s t r o m 等人利用气液色谱分析对自然分娩和剖 腹产的婴儿肠道菌群进行分析后发现在婴儿7 日龄的时候，s t a p h y l o c o c c u s 在两 种分娩方式的婴儿肠道中都占优势，而e s c h e r i c h i ac o l i 则在自然分娩的婴儿肠道 中检测率比较高【3 6 1 。不同的分娩方式在婴儿出生六个月的时候还会对肠道菌群的 组成造成影响，剖腹产婴儿六个月大的时候肠道内b a c t e r o i d e s f r a g i t i s 属的比例还 是明显低于自然分娩婴儿的【3 7 1 。 1 。1 6 5 抗生素 人们在服用抗生素治疗和预防疾病的时候，也扰乱了肠道菌群的生态平衡。 目前已经有很多研究关注抗生素对肠道菌群造成的影响。抗生素本身的性质、吸 收情况、代谢途径都会对肠道细菌造成扰动。临床上由于抗生素治疗引起的腹泻 及真菌感染比较常见，另外就是抗生素抗性菌的增加。有研究表明在服用抗生素 以后，肠道内的重要厌氧菌，如双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌都会大量减少而一 些病原菌如肠球菌则呈现增加的趋势。 6 第1 章绪论 1 1 6 6 疾病 疾病也可以影响肠道菌群的组成，而肠道菌群也在很多疾病的发生和发展中 起着不容忽视的作用。目前的研究表明不仅肠道疾病与菌群有密切的关系，一些 非肠道类疾病也和肠道菌群有着密不可分的关联。 1 2 益生菌 1 2 1 益生菌的概念 益生菌的英文“p r o b i o t i c s 源于希腊语，意思是“为了生命( f o rl i v e ) ，与 a n t i b i o t i c s 相对立。而它的现代定义则最早在19 6 5 年被l i l l e y 和s t i l l w e l l 阐述为 “由一种微生物分泌的刺激其他微生物生长的物质或组织提取物 。此后随着对益 生菌研究的深入，益生菌定义也屡次被修订。p a r k e r l9 7 4 年将其表述为“有助于肠 道菌群平衡的微生物及其相关物质 。后来f u l l e r 在1 9 8 9 又将此定义修改为“能 通过改善肠道微生物平衡而对宿主产生有益影响的活的微生物制剂”。1 9 9 2 年 h a v e n a a r 等进一步扩展此定义为“单一或混合发酵的微生物，能通过改善内源微 生物的性质而对人或动物有益 。1 9 9 6 年a r a m e o 等对益生菌做出进一步的定义： 益生菌是含有生理性活菌或死菌( 包括其组分和代谢产物) ，经口服或其他途径投 入，旨在改善黏膜表面的微生物群或酶的平衡，或刺激机体特异性或非特异性免 疫机制，提高机体定植抗力或免疫力的微生物制剂。而1 9 9 8 年g u a m e r 等提出的 更精炼的定义为“当摄入一定量时能对宿主健康有作用的微生物活体”。 1 2 2 益生菌的选择标准 目前，有关益生菌及其产品开发的最大兴趣是分离和开发新的益生菌菌株。然 而，并非所有的双歧杆菌、乳杆菌菌株等都能够发挥益生作用，适宜于食品、保 健品和医药等制品的应用。不同的微生物菌种( 株) 所产生的健康效应都是不尽相同 的【3 8 j 【3 9 】。理论上，益生菌菌株的选择应依据如下标准【4 0 1 ： ( 1 ) 益生菌应该来自寄主，理想的是来自健康人肠道的自然菌群； ( 2 ) 能顺利通过消化道，尤其是在上消化道极端条件( 高胃酸、高胆汁) 下具有较 7 黑龙江大学硕士学位论文 高的存活率； ( 3 ) 具有对上皮细胞表面的粘附力，能在消化道内定植； ( 4 ) f i g 与寄主肠道内菌群竞争，并具有生存发展的能力； ( 5 ) 具有拮抗、免疫调节等有益于寄主健康的生理作用； ( 6 ) 是非致病性的，并且无毒素产生； ( 7 ) 具有加工和贮藏中的稳定性，在加工和贮藏过程中，应保持所有上述特性。 筛选益生菌制剂的生产菌株首先应从安全的微生物范围内考虑，如乳杆菌属、 双歧杆菌属、链球菌属。在动物饲料添加剂领域，许多国家都公布了通常可以安 全使用的菌种范围。美国食品和药品管理局公布了4 2 种安全的益生菌，主要为乳 酸杆菌，芽孢杆菌，酵母菌几类，我国农业部1 9 9 4 年公布的能够用于动物养殖 的微生物有五类：乳酸杆菌，芽孢杆菌，酵母菌，粪链球菌和双歧杆菌等。使用 其它菌种应非常慎重，如果在安全方面有疑虑，就应该做急性和慢性毒性试验。 其次是确定其目的菌株的来源。要根据益生菌使用的目的确定其筛选来源，如在 使用中不主要利用其黏附和定植特性，菌株的来源就不是特别重要的问题，原则 上，最理想的所要筛选的菌株最好适于原宿主、原生境、原微生态系、原微生物 群落甚至原微生物种群相适应的菌种。再次，益生菌制品其生产菌株的活性和存 活能力是筛选考虑的重要因素之一，作为益生菌制品有明确的质量要求，在筛选 菌株时就要考虑这个问题，注意筛选易培养、易保存、存活期长、抗逆性强的菌 株。检验益生菌菌株在不同条件( 如温度、湿度) 下的存活期是非常必要的。此外， 益生菌对相应生境和使用途径的体液必须要有体液耐性，如不同菌株对低p h 值 胃液、胆汁、胰液、肠液、皮肤及粘膜分泌物等其耐性不同。根据所选菌种可能 起的作用的生境条件，要将所选的菌株先做试管内或体内试验。 1 2 3 益生菌的生理作用 1 2 3 1 维持正常的微生态平衡 动物肠道的正常微生物群是在长期进化过程中形成的，是动物机体的一部分， 它保持相对平衡的稳定状态，对动物的生长发育和抗御疾病具有十分重要的意义。 8 第1 章绪论 但在某些因素影响下，肠道微生物生态系统会被破坏，引起肠道菌群失调，使动 物产生疾病症状。在肠微生物生态学失衡和屏障功能被破坏的情况下，肠道内的 细菌甚至可以出现在肠外组织，这叫细菌移位，其产生机制包括肠道内细菌过度 生长、肠蠕动减弱、肠黏膜萎缩、通透性增加及宿主免疫防御功能降低等，如果 病情严重，最终导致脓血症、休克、多器官功能障碍综合症，明显增加病人的死 亡率【4 。应用益生菌，可以补充和恢复优势菌群的数量、种类和比例，防止细菌 移位1 4 2 1 ，恢复微生态平衡，维持肠道健康。 1 2 3 2 抑制有害菌生长，促进有益菌生长 正常菌群直接参与机体生物防御的屏障结构，这包括机械屏障、化学屏障、 生物屏障和免疫屏障等，并且与外源细菌争夺营养物质、占取生存空间，这些生 物拮抗作用有效阻碍病原菌在肠道黏膜上定殖，维护肠道健康。而益生菌可以有 效补充肠道优势菌群的数量，使肠道微生态平衡，并且促进有益菌生长。嗜酸乳 杆菌、双歧杆菌等益生菌在生长代谢过程中能够产生有机酸( o r g a n i ca c i d s ) 、过氧 化氢( h y d r o g a np e r o x i d ) 、细菌素( b a c t e r i o c i n s ) 等多种拮抗物质，可以有效的抑制 体内有害菌的生长和繁殖，控制肠胃感染。此外，益生菌粘附在宿主消化道内并 定植和存活下来形成生物屏障，一方面可以抑制病原菌在消化道粘膜上的粘附， 并通过与病原菌竞争营养物质抑制病原菌的生长；另一方面可以防止毒素等有害 物质的吸收并中和有毒产物。 1 2 3 3 刺激机体免疫机制 肠道微生物对宿主的免疫系统发育具有重要作用，研究发现，无菌动物由于 缺乏肠道微生物，肠道内派依尔节( p e y e r sp a t c h e s ) 数目比正常动物少，免疫球蛋 白a 型( i g a ) b 细胞的数量仅是正常动物的十分之一；免除无菌状态，动物的免疫 系统可恢复正常发育f 4 3 1 。肠内固有菌可以促进肠黏膜内免疫器官的发育成熟， g r o e n i u n d 等研究0 - 6 个月的健康新生儿时，发现肠道内脆弱类杆菌和双歧杆菌定 殖的时间越早，外周血中i g a 定向细胞的含量可以越早的被检测到，且随着肠内 脆弱类杆菌和双歧杆菌数目增加，外周血中i g a 定向细胞的数量也逐渐增加【卅。 口服益生菌暂时定殖于肠道后，可模仿固有菌的免疫促进作用，而且其中的一些 9 黑龙江大学硕士掌1 立论文 菌株长期定殖后，还可通过产生免疫信号影响外周或肠道局部免疫系统的功能【4 5 1 。 益生菌还能激发细胞应答，增强宿主免疫力【删，益生菌可作为非特异免疫调节因 子，通过细菌本身或细胞壁表面结构成分刺激宿主免疫细胞，使其激活，产生促 分裂因子，提高自然杀伤细胞和巨噬细胞活性。此外，益生菌还可以发挥特异性 免疫功能，促进宿主b 淋巴细胞产生抗体能力，调整肠道菌丛，使之恢复正常。 1 2 3 4 缓解乳糖不耐症 乳糖是人体重要的营养源，并具有重要的生理作用。乳糖只有在乳糖酶的催 化下水解成葡萄糖和半乳糖，才能被人体转化吸收。而在亚非洲，特别是我国成 人中约有5 5 1 的人都因体内缺少乳糖酶，而致使乳糖在大肠中积累，成为肠道微 生物的异质性发酵基质，结果引起腹泻、腹胀、腹部疼痛和肠胃气胀等不适症状， 这种现象被称为乳糖不耐症( l a c t o s ei n t o l e r a n c e ) 。世界上有相当比例的人群患有 乳糖不耐症，因此乳糖不耐症愈来愈多地受到人们的关注。 乳糖不耐症状随着被消费的乳糖含量、乳糖酶缺乏的程度、肠道微生物的适 应性以及是否存在其它补充乳糖酶的途径等发生变化。饮用嗜酸乳杆菌、双歧杆 菌等益生菌发酵的酸奶有助于乳糖消化，可大大降低乳糖不耐症。嗜酸乳杆菌等 益生菌在乳糖存在的情况下可以诱导合成p 半乳糖苷酶( p g a l a c t o s i d a s e ) ，有利于 乳糖的分解和利用。 1 2 3 5 降低血清胆固醉水平 胆固醇在人体生理活动中起着重要作用，是不可缺少的物质。它不仅是构成 细胞膜的组成成分之一，而且与生物膜的通透性和神经传导有关。同时，胆固醇 又是形成类固醇激素、胆汁酸等成分的基础原料。然而，随着人们生活水平的提 高，不合理的膳食结构逐步导致体内胆固醇含量增加。胆固醉过量堆积将导致冠 心病、高血脂症、动脉粥样硬化以及其它心血管疾病即1 。 人体内血清胆固醇的7 0 为内源性合成，其余3 0 为膳食胆固醇。目前研究 认为，人体内胆固醇的合成速度受膳食胆固醇的影响很大。因此，人们尤其希望 通过非药物途径限制饮食中胆固醇的含量。国内外大量临床实验证实，服用乳酸 菌及其相关制品具有减少人体血清胆固醇含量，降低心血管疾病发病率的功效1 4 8 】。 一1 0 第1 章绪论 研究认为，嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) 和嗜酸乳杆菌( 厶a c i d o p h i l u s ) 可 以显著降低血清总胆固醇和低密度脂蛋白的含量f 4 9 1 。 1 2 3 6 抑制癌症 国内外对益生菌的抗癌效应开展了深入的研究。1 9 7 2 年，o r a s e r 和h i l l 倡导 了一种理论，认为肠道细菌能改变人体肠道内部的化学环境，因而在抑制癌症的 形成和发展中起着重要作用【5 0 1 。应用动物模型进行乳酸菌抗癌效果的研究已有许 多报道，主要包括应用干酪乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sc a s e i ) 、双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u m 妒) ，德氏保加利亚乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i is s p b u l g a r i c u s ) 、嗜酸乳杆菌 ( 三a c i d o p h i l u s ) 开展抑制肿瘤或癌症发生的研究。然而，与人体有关的、直接的 实验研究尚没有报道。关于乳酸菌的抗癌效应的机理，目前并不清楚。 1 2 3 7 促进生长 益生菌能够合成多种维生素如尼克酸、叶酸、烟酸、维生素b 卜维生素b 2 、 维生素b 6 、维生素跳等，补充机体所需的营养物质。据报道，酸奶酪等发酵乳制 品比直接酸化的产品含有更多的维生素b 和维生素p p 。可见，酸奶等发酵乳制品 含有大量的消化性更好的蛋白质、维生素等物质。益生菌也可产生特有的某些酶 类来补充宿主在消化酶上的不足，帮助分解上消化道未被充分水解吸收的营养物 质，有利于促进宿主对蛋白质、脂类、碳水化合物等的消化、吸收，同时还能够 增加宿主必需的维生素、氨基酸、微量元素、某些无机盐类( 如钙、磷、铁、钴等) 等的利用。 1 2 3 8 其它 益生菌对人体的健康促进作用还包括：抗诱变、抗氧化、抗过敏、降血压、 消除炎症、促进泌尿系统健康、减弱放射性同位素等作用。 1 3 变性梯度凝胶电泳技术简介 一直以来，人们对微生物的认识主要是通过纯培养，或者是利用显微镜直接 进行形态观察，对生态系统中微生物种群多样性及群落结构的研究也是采用经典 的分离培养和鉴定的方法。但是这些方法和技术对于微生物及微生物生态的研究 - 1 1 黑龙江大学硕士学位论文 是远远不够的。微生物形态多样，而且受培养条件的影响，有些微生物的生理生 化特性非常相似，仅凭形态和生理生化特征很难进行正确的检测、鉴定，且传统 的微生物研究方法工作量大，重复性差，要把菌株鉴定到种需要很长时间，且不 能反应菌株问的亲缘关系。据报道，目前自然界尚有8 5 9 9 9 的微生物至今仍 不能纯培养，这就更为研究环境中的微生物存在状况造成了严重障碍。 近些年来，随着生物技术研究的深入，一些分子生物学手段越来越多的应用 在微生物生态学的研究中，以1 6 s r r n a 基因为基础而建立的分子生物学技术正逐 步广泛用于环境微生物群落的分析。这些分子技术主要包括：1 6 s r d n a 基因序列 分析、m 妤d ( 随机扩增多态性d n a ) 、核酸探针检测技术、荧光原位杂交技术、 t g g e ( 温度梯度凝胶电泳) 以及d g g e ( 变性梯度凝胶电泳) 等。其中，p c r d g g e 技术是目前可以探知最为完整的环境微生物菌群结构的分子生物学技术。 1 3 1d g g e 技术的基本原理 变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) 是d n a 指纹 分析法中的一种，最先是用于分析遗传突变的。自1 9 9 3 年m u y z e r 等首次用来研 究自然环境微生物群落的多样性与群落结构之后，该分析方法就越来越广泛地被 用于微生物分子生态学研究，包括土裂5 1 1 、活性污泥、人体和动物肠道5 2 1 、温泉 【5 引、植物根系【5 4 1 、海洋等。目前已经发展成为研究生物群落结构的主要分子生物 学方法之一【5 5 】f 5 6 1 。 该技术的基本原理是：在含有浓度线形递增的变性剂( 尿素和甲酰胺的混合物) 的聚丙烯酰胺凝胶电泳中，可将长度相同的而碱基排列顺序不同双链d n a 分离 【5 7 j 。大小相同而序列有差异的核酸分子，在同一变性剂梯度下的解链程度不同， 从而直接影响核酸分子的形状，造成其电泳迁移率的不同。这些用传统凝胶电泳 技术无法分离的核酸分子在变性梯度凝胶电泳上得到分离。这项技术广泛的用于 环境微生物系统的组成分析中，在样品的并行比较方面发挥着很大的作用【5 引。 双链d n a 分子中a 、t 碱基之间有2 个氢键，而g 、c 碱基之间有3 个氢键 连接，因此a 、t 碱基对对变性剂的耐受性要低于g 、c 碱基对。由于这四种碱基 第1 章绪论 的组成和排列差异，使不同序列的双链d n a 分子具有不同的解链温度。当双链 d n a 分子在含梯度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，因其解链的速度和程 度与其序列密切相关，所以当某一双链d n a 序列迁移到变性凝胶的一定位置，并 达到其解链温度时，即开始部分解链，部分解链的d n a 分子的迁移速度随解链程 度增大而减小，从而使具有不同序列的d n a 片段滞留于凝胶的不同位置，当电泳 结束时就形成相互分开的带谱。理论上认为，只要选择的电泳条件如变性剂梯度、 电泳时间、电压等足够精细，有一个碱基差异的d n a 片段都可被分开1 5 哪。 然而，当不同片段的序列差异发生在最高的解链温度区域时，一旦变性剂浓 度达到片段最高的解链区域温度时，片段会完全解链，成为单链d n a 分子，而单 链d n a 在d g g e 中的电泳行为取决于d n a 分子的大小，与d n a 的碱基序列无 关，因此相同长度的此类p c r 产物具有相同的电泳行为，在d g g e 中不能被完全 分开。为了解决这一难题，通常在