（生态学专业论文）黄花大苞姜的遗传多样性及遗传分化.pdf

s o u t hc h i n an o r m a lu n i v e r s i t y d i s s e r t a t i o nf o rm a s t e rd e g r e e g e n e t i cd i v e r s i t ya n dg e n e t i c d i f f e r e n t i a t i o no fc a u l o k a e m p f e r i a c o e n o b l a l l s j ied e n g t h i sp r o je c tw a ss u p p o r t e db yt h en a t i o n a ln a t u r a ls c i e n c e f o u n d a t i o no fc h i n a ( p r o j e c tn o 3 0 5 7 0116 ) ，n a t u r a ls c i e n c e f o u n d a t i o no fg u a n g d o n gp r o v i n c eo f c h i n a ( p r o j e c tn o 7117 8 6 4 ) a n df o u n d a t i o nf o rt h ea u t h o ro fn a t i o n a le x c e l l e n td o c t o r a l d i s s e r t a t i o no fc h i n a ( p r o j e c tn o 2 0 0 7 8 2 6 ) s u p e r v is o r p r o f y i n g q i a n gw a n g s p e c i a l t y ：e c o l o g y c o ll e g e ：s c h o o lo fl i f es c i e n c e s s u b m it t e dd a t e ： m a y ，2 0 1 0 摘要 摘要 黄花大苞姜的遗传多样性及遗传分化 专业：生态学申请人：邓洁导师：王英强 黄花大苞姜( c a u l o k a e m p f e r i ac o e n o b i a l i s ) 是大苞姜属在中国分布 的唯一代表，为我国华南地区特有的姜科多年生落叶宿根草本植物。 它的分布范围十分有限，主要分布在华南的广东、广西两省。黄花大 苞姜常常在其生境的石壁上形成单种群落，成片生长，植株细弱。在 黄花大苞姜中存在着植物界一种全新的花粉滑动白花传粉机制，该物 种特有的繁育方式使其成为研究遗传多样性和繁育系统之间关系的良 好材料。本文选用了两对叶绿体通用引物( t r n l i n t r o nl c l d 和 p s b j p e t a ) 来检测黄花大苞姜天然群体的遗传多样性及遗传分化情况， 并在此基础上研究了遗传多样性和繁育系统的关系，以及黄花大苞姜 所处生境、种子散布机制与遗传变异的关系。同时初步探讨了黄花大 苞姜的分化中心及可能的迁移路线。 研究结果显示：将t r n l i n t r o nl e l d 和p s b j p e t a 片段组合后，共 检测出l5 种单倍型( h i h l5 ) ，单倍型多样性( h ) 较低，变化范围为0 0 7 4 2 4 2 。核苷酸多样性( 兀) 也位于较低水平，变化范围为0 1 4 9 x10 一。 所有居群的分子方差分析表明6 5 0 2 的遗传变异来自于居群间， 3 4 9 8 遗传差异存在于居群内，居群间的遗传变异远远高于居群内的 变异。黄花大苞姜是狭域分布种，且为自交植物，该研究发现其总遗 传多样性和居群内遗传多样性都位于极低水平( h r = 0 5 2 8 ，h s - - 0 0 91 ) ， 各居群间有显著的遗传分化( g s t = o 8 2 8 ，n s t = o 7 9 0 ) ，推测是由它的分 布特点与自花传粉的繁育系统共同作用的结果。居群间遗传分化系数 n s r ( o 8 6 5 ) 显著大于g s r ( 0 8 2 8 ) ( p 生活型 繁育系统 种子散播 机制；而在种群水平上，这些因素依次为：繁育系统 分布范围 生 活史 分类地位 种子散播机制。从以上分析可以看到，繁育系统和 分类地位对种群水平和物种水平上遗传变异的影响不同，分类地位是 影响物种遗传变异的主要因素，繁育系统是影响种群水平遗传变异的 主要因素。分布地域广、寿命长、基因交流频繁、种子多的物种具有 较高的遗传变异水平，影响种群遗传结构最重要的因素是繁育系统方 式和基因交流程度( h a m r i c k ，19 8 9 ) 。统计表明，自交种和混交种植物 的遗传变异水平最低，而远交、异交遗传多样性水平明显提高，其中 又以远交风媒种最高( h a m r i e k & g o d t ，l9 8 9 ) 。植物的交配系统在维持 华南师范人学硕十学位论文 种群内遗传变异上有相当重要的地位( 王崇云，19 9 8 ) ，张大勇和姜新华 ( 2 0 0 1 ) 认为交配系统对植物种群遗传结构产生的影响比任何其它生活 史因子都更重要，王洪新和胡志昂( 19 9 6 ) 认为对居群内、居群间遗传 多样性的分配唯一肯定起作用的是繁育系统。对遗传多样性影响最大 的内因即交配系统或繁育系统( 胡新生，2 0 0 2 ) 。 1 2 3遗传多样性与繁育系统 从广义上说，植物的繁育系统包括了植物一个种内对下一代个体 的遗传贡献的有关性表达的所有特征( w y a t t 。1 9 8 3 ) ；从狭义上讲，指 控制居群或分类群中异交或自交相对频率的各种生理、形态机制 ( h e y w o o d 。19 7 6 ) 。h e y w o o d 把繁育系统分为有性和无性两大类，王崇 云( 19 9 8 ) 将有性繁殖分为：专性自交、自交异交混合型和专性异交三 种类型。繁育系统是植物内部的遗传机制和外部环境相互作用的一种 表现形式，在决定植物的进化路线和表征变异上起着重要作用( g r a n t ， 19 91 ) 。繁育系统影响着遗传多样性丰富程度，其不同交配类型或受精 方式对群体的基因型产生完全不同的效应。自交导致各种群间的基因 流微弱，增加近亲个体间交配的机会，减少配子间遗传重组的机率， 其种内遗传多样性较低，导致物种不同居群间的分化，增加居群间的 遗传多样性，在不同生境下有利于形成新的( 亚) 种；异交增加物种内 的基因交流，提高物种内的遗传多样性，对环境的适应能力较强。对 于大范围的异交植物来说，种群之间的遗传变异会明显增加( 朱晓琴， 1 9 9 5 ) 。 物种遗传多样性结构主要是通过物种种群内和种群间的遗传分化 来体现的，影响居群结构最重要的因素是繁育系统和扩散方式、基因 交流的程度或者居群的隔离机制( v i g i l a n te ta 1 ，l9 9 l ；陈家宽等，19 9 4 ； 钱迎倩等，19 9 7 ) 。繁育系统对基因流有很大影响，基因流是指遗传物 质在居群内和居群间的移动( w i d e n ，l9 9 2 ) 。一般说来，基因流畅通的 物种，种群间遗传分化小；反之，种群间遗传分化大( 阮成江等，2 0 0 6 ) 。 具有较低水平基因流的物种比具较高水平基因流的物种有更高的遗传 分化，基因流增加了群体内部的遗传变化，这种变化是由于一些个体 从其他群体带来该群体没有或少有的基因，遗传物质从它们的发生地 1 2 第一章文献综述 点分散出去是导致不同居群之问基因流动的基本过程。一些个体从一 个居群迁移到另一个居群且成为繁殖成员时，就把自身的基因带到新 的居群中，使新的居群的基因组成、基因频率等都有较大的变化。基 因流动可以使不同群体基因频率趋同，基因流在居群间流动的水平越 大，居群就越相似，越均匀，不同居群间的区别就越小，基因流控制 着居群相互独立进化的程度( 曲若竹等，2 0 0 4 ) 。植物居群内和居群间基 因流是借助于花粉、种子、孢子、植株个体以及其他携有居群遗传物 质的物体为媒介进行的，其中花粉和种子的扩散是自然植物居群最主 要的基因流( e l l s t r a n d ，19 9 8 ) ，其程度受到传播方式、传播机制以及群 体间地理距离的影响。自然居群的遗传分化被认为是依赖于基因流和 选择作用间平衡关系的动力学过程。因此，基因流的大小也是种群遗 传结构研究的重要内容。 h a m r i e k 等( 19 9 0 ) 研究发现，不同繁育系统类型植物的遗传多样性 水平差别很大：对于自交种，51 以上的遗传变异分布在居群间 ( g s t 0 51 ) ，这样的群体趋向于形成一个内部均一而互相异质的小群 体；而对于异交风媒植物来说，花粉散布的很远，强大的基因流促进 了其居群间的基因交换，只有不到l0 的变异产生于居群间( g s t * 瓣卦 罨* 强 斟蔼舒赫 塑箍汁蔫妨 塑赣滞_井lij荽姝 磷 卜善 丑 簿靴冲崃 汁温 _l(器藉净 珊沸妨 黔毋稚斟 汁酷吣汁荨 笥卡寸 露 e z 六_ n k z l ( 勺 z 六) ( z l ( 孓 z 乔r z l ( 、， 蚕 o | f z o 工 口工、7 j ) ( o 鼍oo田j- ro|oja b口田j-认 po卜oj-a bio四j-协一 01yrf-工oj-uo oqoj-q认 po。|obj5 ro|o口j_ o哪oj-n oq。o田j-u j1田|ojan，】口1oj-岔u _jo。10j一甙a po口oj-昏认 o ) ( o 孓 口王 o 孓n 口趸o o z ) ( 口勺 一oja岔 ofzoj_ 、7o10田j-认q、7乏o。口田j协 鼍jo。工口j-岭、7气oo田j-侥o ，ib。|zoj-aq o勺oj-岭_ o1口口n 一_u。认n，3，enuou小，3a，2llu。认一，l口：enu。u，uu，2_13。认_，_o：enuou，uu艺_13。协，n口：enu。u，n昏，2=u。认一，2u；田u。u，3田，l、i_u。认o，认；enu。u宅认6，n_一u。曲o，4u；啊u。u，3口，n_一u。uu心；啊u。u，2，n_n。u_，u：哪nuol0，3昏之_n。un，20；u。一ouurl_n。un，l心；哪nuolo、uu、，l、i _ 1 3 0 u 田，l l，eaol9，i主 _u。q_n，lna。u一，0_主_uou12：e囊。a吼，ou；z _=051”田n乒。一a_n=n。u，0口：ena040，ouo、i_12。aq1u：u。协q0，2_o。心u1舡：enu。uo、au。210。n协，3舡；enu。uou_、，no。，0a；u030，2一d、 _oo口，l o，enao 1l，3岔亩_=。一，o咕：田a。10，一o；z _lo。=0心：u04，3l，n _o_。a，u：田n lo协a，2，2 1 ou u au u au 一西u 认。协认。 认_ 一 u o q u o u 0 a o o a 协oa o oa u q a o a qa u ua 心a 婚q _ ou o o a u oa a q o o口o 一r 、 第二章研究材料、方法与仪器 2 1 2方法 2 1 2 1植物总基因组d n a 的提取 参照d o y l e & d o y l e ( 19 8 7 ) 的c t a b 法，并进行了适当的改良以除 去大部分的多糖后提取叶片总基因组d n a 。具体实验步骤如下： ( 1 ) 在2 m le p p e n d o r f f 离心管中加入7 8 0 9 l 预处理液( 洗液) 、2 的p 一巯基乙醇和( 2 5 ) p v p ( 聚乙烯吡咯烷酮) 粉。同时放入2 x c t a b 提取液于6 5 预热； ( 2 ) 取o 5 1 o 克硅胶干燥叶片剪碎置于预冷的研钵中，加入适量 石英砂于液氮中迅速用力研磨成粉末； ( 3 ) 在加入c t a b 提取缓冲液前，将研磨好的粉末迅速转移至( 1 ) 步骤的预处理液( 约占管内总体积的1 3 ) 中，2 0 冰上放置5 l0 m i n 。 然后取出8 0 0 0 r p m 离心10 m i n ，弃上清液，加入预热至6 5 的2 x c t a b 提取液7 8 0 9 l 充分混匀，使材料与提取液完全接触，6 5 温浴l h ，其 间每隔l5 m i n 将离心管上下轻微倒置来回摇匀一次； ( 4 ) 取出e p p e n d o r f f 管稍冷却至室温，13 2 0 0 r p m 离心15 m i n ，抽 提上清液( 约6 0 0 9 1 ) 至新的离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇( 体 积比为2 4 ：1 ) 溶液，缓慢翻转离心管5 m i n ，使内含物充分混匀后形成 乳浊液，13 2 0 0 r p m 离心l5 m i n 使分层，吸取上层水相转入另一离心管。 ( 5 ) 重复上一步骤，用氯仿异戊醇再抽提一次； ( 6 ) 在抽提后的水相中加入1 3 体积的5 mn a c i 混匀，再加入等 体积2 0 预冷的无水乙醇，将离心管上下来回轻轻摇匀，置于2 0 的冰箱中放置2 h 或过夜沉淀； ( 7 ) l2 0 0 0 r p m 离心15 m i n ，使d n a 附着离心管管底，弃去上清液， 收集沉淀； ( 8 ) 加入7 0 乙醇5 0 0 1 a l ，清洗沉淀，1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n 以清晰 d n a 沉淀，弃去乙醇收集沉淀。重复上一步骤一次； ( 9 ) 将离心管倒置于铺有吸水纸的工作台上，室温下自然风干约 1 2 小时，视沉淀的多少加入适量的o 1x t e 缓冲液溶解； ( 10 ) 用1 的琼脂糖凝胶检测d n a 的含量和质量，分装后短期使 用置于4 、长期使用置于2 0 储存备用。 2 1 华南师范人学硕十学位论文 2 1 2 2引物的筛选 叶绿体基因具有独立的进化路线，且c p d n a 不同基因片段在不 同植物类群中的突变速率存在差异( b o u s q u e te ta 1 ，19 9 2 ；g a u te ta 1 ， 19 9 2 ；b a k k e re ta 1 ，2 0 0 0 ) ，在不同植物中，通用引物的“通用 程度 有所不同，对不同的植物类群进行研究时最好通过预实验筛选出适合 该类群的基因片段。 为了得到适用于黄花大苞姜的叶绿体片段，广泛搜索文献查找已 报道过的植物叶绿体片段，共收集到来自不同植物的叶绿体引物共5 6 对。由上海生物工程技术有限公司合成，稀释成l0 9 m 。本研究首先 选取地理上两个距离相对较远的居群的个体对5 6 ( 编号为1 5 6 ) 对叶绿 体通用引物进行预实验扩增，从中选出条带清晰单一扩增效果好、易 于进行测序引物进行多态性筛选。然后用这些选出的引物对3 5 个居 群( 每个居群挑一个个体) 进行p c r 扩增，最后从中选取出扩增效果好、 扩增片段合适、变异位点较多的引物进行正式实验。 2 1 2 3 c p d n a - - p c r 扩增及其产物的测序 2 1 2 3 1 c p d n a 片段扩增 每个居群选取5 个个体进行扩增和测序。p c r 反应体系如下： p r i m e rf l “l p r i m e rr1p l 10xb u f f e r ( m g 肿f r e e ) 2 0 1 a l 模板d n a 2 0 6 0 n g 2 5 m mm g c l 2 1 2 1 a l l0 m md n t p s 0 5 9 l t a q d n a 聚合酶( 5 u ) 0 2 0 4 “l 加d d h 2 0 至总体积2 0 i t l 。 反应在p t c 一2 0 0p c r 仪上进行，反应程序如下：先在9 5 条件 第二章研究材料、方法与仪器 下变性5 m i n ，接着9 4 4 5 s ，( 4 8 5 2 ) 4 5 s 退火引物与模板结合，7 2 1 5 r a i n 延伸，循环3 5 次，最后在7 2 条件下8 10 m i n 充分延伸。 16 保存。 2 1 2 3 2p c r 产物测序 扩增产物在5 v c m 电压、1 5 的琼脂糖凝胶( e b ，o 5 肛g m 1 ) 电泳检 测后，经试剂盒e z n a rg e le x t r a c t i o nk i t ( o m e g ab i o t e k ) 纯化送 上海英骏生物技术有限公司在a b i3 7 3 0 自动测序仪上进行测序。 2 1 2 3 3d n a 序列分析比对 所有样本测序所得的序列分别用c h r o m o s 软件进行正反链比对并 手工进行校正。再用c l u s t a lx1 8 1 ( t h o m p s o ne ta 1 ，1 9 9 7 ) 软件对所得 序列进行初步比对，然后适当地剪切使每条序列前后端对齐，将每个 个体各自的引物扩增出的序列片段按先后次序拼接在一起，再进行重 新比对。插入或缺失( i n d e l ) j b 齐并变动一个碱基作为替代处理( c a i c e d o & s c h a a l ，2 0 0 4 ) 。 2 1 2 4数据处理 2 1 2 4 1遗传多样性及遗传分化分析 本研究采用两种遗传多样性参数：单倍型多样性( h ) ，核苷酸多样 性( 兀) 。应用d n a s pv e r s i o n 4 0 ( r o z a se ta 1 ，2 0 0 3 ) 对每个居群的遗传多 样性参数进行估计，序列变异用核苷酸多样性( 兀) 和分离位点的比例 ( 0 w ) 来估算，并估算物种水平上居群间的基因流n m ( h u d s o ne ta 1 ， l9 9 2 ) 。叶绿体基因的遗传多样性凰和所( 分别为居群内和总的遗传 多样性) 以及居群间遗传分化g s t 和s t 值( r a y m o n d & r o u s s e t ，1 9 9 5 ) 等依照p o n s 和p e t i t ( 1 9 9 6 ) 所描述的方法，使用p e r m u t c p s s r2 0 软件 计算。居群分化情况通过居群间每代的分化系数( g s t ) 和基因流( m ) 的l0 0 0 次重复p e r m u t a t i o nt e s t 进行评估，其中n m = 0 5 ( 1 g s t ) g s t 。g s t 值的计算过程只考虑了单倍型频率，而n s t 还考虑了单倍型 之间的差异。如果n s t 显著大于g s t ，则表明亲缘关系相近的单倍型 出现在相同的地区内，有亲缘地理关系的存在( p o n s & p e t i t 。19 9 6 ) 。使 华南师范人学硕十学位论文 用a r l e q u i nv e r s i o n3 0 软件包( e x e o f f i e re ta 1 ，2 0 0 5 ) 通过l0 0 0 次 置换检验进行居群分子方差分析( a m o v a ) ( a n a l y s i so f m o l e c u l a r v a r i a n c e ) 来估算黄花大苞姜在不同水平上( 居群内和居群间以及不同 地理区域间和地理区域内) 遗传变异的分布情况。 2 1 2 4 2 歧点分布分析( m i s m a t c hd i s t r i b u t i o na n a l y s i s ) ； l l 中性检验 ( n e u t r a l i t yt e s t s ) 这两个分析都用来检验物种是否经历过种群扩张过程。两种检验 都是基于i s m 模型( i n f i n i t es i t em o d e l ) ，因此适用于短的d n a 序列。 t a j i m a sd 检验检测的是分离位点的数目( o ) 和核苷酸多态性( 兀) 之间的 关系。当居群经历过瓶颈效应时，d 值可能为显著的正值或负值，当 d 值为不显著的正负值时表明所检测的位点为中性进化( t a j i m a ， 19 8 9 ) 。f u & l i sd + 、f 检测( f u & l i ，1 9 9 3 ) 是总的多态位点与单碱基 突变之间的差异，当这两项检验的d 、f 值处于显著正值或显著负值 时表明居群受到了选择作用。一般认为当居群受到平衡选择( b a l a n c i n g s e l e c t i o n ) 时，d 幸、f 毒为显著正值；居群经历过快速扩张( r a p i dr a n g e e x p a n s i o n ) ，d 幸、f 宰为显著负值。本文从物种水平上对叶绿体基因片 段进行t a j i m a sd 和f u & l i sd 、f 掌检测，以判断是否这些位点符 合中性进化模式，是否经历过瓶颈效应或快速扩张等历史事件。 歧点分布分析指的是单倍型两两之间观察到的碱基差异的数目的 分布，能够推测居群是否经历过扩张的历史事件( s l a t k i n & h u d s o n ， 1 9 9 1 ) 。在居群增长情况下，歧点分布呈现单峰分布；而当居群处于动 态平衡中或处于缓慢的衰退状态时，歧点分布表现出双峰或多峰。若 居群处于扩张状态或经历瓶颈效应的情况会导致失配分布呈现单峰分 布，y 值偏低，p 0 0 5 。本文从物种水平上对 叶绿体基因片段进行歧点分布分析，判断是否物种水平上经历过快速 扩张。 本研究中性检验与歧点分布分析均由d n a s pv e r s i o n 4 0 软件进行 ( r o z a se ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 2 4 第一：章研究材料、方法与仪器 2 1 2 4 3构建单倍型网络图 采用d n a s p 4 0 软件确定单倍型，用p h o t o s h o p 图片处理软件绘制 这些单倍型的地理分布图。叶绿体单倍型之间的网络关系用t c s v e r s i o n1 2 l ( c l e m e n te ta 1 ，2 0 0 0 ) 软件分析，构建单倍型最小跨度网络 图( m i n i m u ms p a n n i n gn e t w o r k ，m s n ) 。网状图更易说明单倍型之间的 关系。 2 1 2 4 4构建邻接树和最大简约树 以苞叶姜( p y r g o p h y l l u my u n n a n e n s e ) 和海南三七( k a e m p f e r i a r o t u n d a ) 为外类群，根据c p d n a 单倍型特征构建系统网络进化树。单 倍型之间的系统关系用p a u p 4 0 b 1o ( s w o f f o r d ，2 0 0 2 ) 进行邻接分析 ( n e i g h b o r - j o i n i n g ，n j ) 和最大简约性方法( m a x i m u m p a r s i m o n y ，m p ) 分 析，邻接法( n j ) 是依据距离最近的距离成对分类单位构建成总距离最 小的系统树，相邻节点连接后构成相应的拓扑树( s a i t o u ，n e i ，19 8 7 ) ； 最大简约法是假定4 种核苷酸可突变为与自身不同的任何一种，这样 对一给定的拓扑结构，可以推断每个位点的祖先状态。在m p 分析中， 系统发育信息由一致性指数( c o n s i s t e n c yi n d e x ，c o ，保持性指数 ( r e t e n t i o ni n d e x ，r i ) 和恢复性指数( r e s c a l e dc o n