（动物遗传育种与繁殖专业论文）貉子生长性状部分候选基因的遗传学研究.pdf

摘要 摘要 貉子的生长性状是受多基因共同调控的，在人和鼠等动物的研究结果表明g h 基因、g h r 基因、i g f - i 基因和i g f i r 基因对生长具有重要的调节作用，因此，本研究将g h 基因、g h r 基因、i g f - i 基因和i g f i r 基因作为影响貉子生长性状的候选基因，以狗g h 基因、g h r 基 因、i g f - i 基因和i g f i r 基因序列为基础，通过p c r 结合测序的方法克隆了部分貉子g h 基 因、g h r 基因、i g f i 基因和i g f i r 基因的外显子序列；以貉子的随机群体为研究材料，采 用p c r - s s c p 的方法检测貉子g h 基因、g h r 基因、i g f i 基因和i g f i r 基因的多态性，并 进行基因多态性与生长等性状的相关分析，根据相关结果选择相关好的位点进行合并基因型 分析。主要研究结果如下： 1 克隆了貉子g 腿基因的全部c d s 序列。 2 在貉子g h r 基因发现两个多态性位点，分别位于g h r 基因的外显子5 和外显子9 ，基因 型与性状间的相关分析结果表明外显子9 的多态性位点g h r 9 对貉子的皮长有显著影响。 3 在貉子i g f 1 基因发现两个多态性位点，分别位于i g f i 基因的外显子3 和3 u t r ，基因 型与性状间的相关分析结果表明外显子3 的多态性位点i g f 3 对貉子的皮长有显著影响。 4 将貉子g h r 9 多态性位点与i g f 3 多态性位点进行合并基因型分析，结果表明合并基因 型对貉子的体长有显著的影响，且合并后的两种纯合子的差要大于单位点两种纯合子的差。 关键词t 貉子；g h 基因；g h r 基因：i g f i 基因：i g f - i r 基因；克隆；多态性；生长性状 东北农业大学农学硕士学位论文 t h eg e n e t i cs t u d yo np a r t i a lc a n d i d a t e g e n e s a f f e c t i n gg r o w t h t r a i to fr a c c o o nd o g a b s t r a c t t h eg r o w t ht r a i to fl a c c ；( o nd o gw a sc o n t r o l l e db ym u l 畦p i l eg e n e s ，t h er e s e a r c hr e s u l t so f h u m a na n dm o u s es h o w e dt h a tg h ，g h 艮i g f ia n di g f i rp l a ya l lr e g u l a t o r yr o l ei ng r o w t ha n d d e v e l o p m e n t , t h e r e f o r e ，t h eg h ，g h r ，i g f - ia n di g f i rg e n ew e r es e l e c t e da st h ec a n d i d a t eg e n e i no u rs t u d y , a n dt h ep r i m e ro fr a c c o o nd o gg h ，g h l li g f ia n di g f i rg e n ew a sd e s i g n e d a c c o r d i n gt ot h ed o gg h ，o h l li g f - ia n di g f i rg e n es e q u e n c e ，p c ra n ds e q u e n c i n gm e t h o d w e r ed e v e l o p e dt oc l o n et h ee x o ns e q u e n c eo fg h ，g h r , i g f - ia n di g f - i rg e n e p c r - s s c p m e t h o dw a sd e v e l o p e dt od e t e c tt h ep o l y m o r p h i s mo fg h ，g m ki g f ia n di g f - i rg e n ei i lt h e r a c c o o nd o gr a n d o mp o p u l a t i o 玛t h e nt h ea s s o c i a t i o na n a l y s i sw a sc a r r i e do u tb e t w e e nt h e p o l y m o r p h i s ma n dg r o w t ht r a i t s ，a n dt h ec o m b i n e dg e n o t y p ea n a l y s i sw a sa l s oc a r r i e do u t , t h e m a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h ec d ss e q u e n c eo fr a c c o o nd o gg h rg e n ew a sc l o n e d 2 t w os n p sw e 陀d e t e c t e di nr a c c o o nd o gg h rg e n e ，w h i c hw e r el o c a t e di ne x o n 5a n d e x o n 9 ，t h ea s s o c i a t i o na n a l y s i sr e s u l t sb e t w e e np o l y m o r p h i s ma n dt r a i t ss h o w e dt h a tt h ee x o n 9 p o l y m o r p h i s mo f r a c c o o nd o gg h r g e n eh a ss i g n i f i c a n te f f e c to ng r o w t ht r a i t s 。 3 t w os n p sw o r ed e t e c t e di l l 均c c o o nd o gi g f - ig e n e ，w h i c hw e r el o c a t e di ne x o r t 3a n d 3 u t r , t h ea s s o c i a t i o na n a l y s i sr e s u l t sb e t w e e np o l y m o r p h i s ma n dt r a i t ss h o w e dt h a tt h ee x o n 3 p o l y m o r p h i s mn 籼瑚nd o gi g f - ig e n eh a ss i g n i f i c a n te f f e c to ng r o w t ht r a i t s 4 t h ec o m b i n e dg e n o t y p e a n a l y s i s r e s u l to fg h r 9p o l y m o r p h i s ms i t ea n di g f 3 p o l y m o r p h i s ms i t es h o w e dt h a tt h ec o m b i n e dg e n o t y p eh a ss i g n i f i c a n te f f e c to nr 乏屺c o o nd o gs k i n l e n g t h , a n dt h ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h eh o m o z y g o u sc o m b i n e dg e n o t y p ew a sm u c hs i g n i f i c a n tt h a n t h ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h eh o m o z y g o u sg e n o t y p eo f s i n g l ep o l y m o r p h i s ms i t e k e y w o r d s ：r a c o o nd o g ；g h ；g h r ；i g f - i ；i g f i r ；c l o n e ；p o l y m o r p h i s m ；g r o w t ht r a i t c a n d i d a t e ：y a n gc h u n s h a n s p e c i a l i t y ：a n i m a lg e n e t i c s & b r e e d i n g s u p e r v i s o r ：p r o f b a ix i u j u a n 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 注! 垫逡直墓他益噩缱剔直明笪：奎拦互窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：桶羞叫 日期：谚年厂月2 密日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘j 允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：瞄卅 日期：力年卵2 驴日 导师 签名：石番砺 日期：酽年r 月硼 引言 i i i 1 引言 1 1 研究背景与科学意义 貉( n y c t e r e u t e sp r o c y o n o i d e sg r a y ) 为食肉目( c a m i v o r a e s ) 、犬科( c a n i d a e ) 、貉属动物。貉 主要分布于中国、俄罗斯、蒙古、朝鲜、日本、越南、芬兰、丹麦等国家。貉在我国的分布 很广，几乎遍及全国各省、区。貉既可以生活在天寒地冻的北方，也可以生活在温暖如春的 南方，习惯上常以长江为界将貉分为南貉和北貉。分布于长江以北各省、区的貉统称为北貉， 分布于长江以南各省、区的貉统称为南貉。2 0 世纪4 0 年代，日本衣川雄曾将中国貉和朝鲜 貉混分为7 个亚种：乌苏里貉、朝鲜貉、阿穆尔貉、江西貉、闽越貉、湖北貉和云南貉。 貉是一种非常珍贵的毛皮动物，具有很高的经济价值，其主要产品是貉皮。貉皮属于大 毛细皮，具有坚韧耐磨、柔软轻便、保温美观等特点，是制作高档裘皮大衣、皮领、皮帽等 的优质原料。另一方面，貉的副产品也具有较高的开发利用价值。第一，貉毛是不可多得的 高级原材料，貉的针毛及尾毛，可以用来制造高级化妆用毛刷、胡刷和毛笔等，而在抽取这 两部分毛以后，并不影响貉皮的使用，也不影响其价值。第二，貉肉以细嫩鲜美、营养丰富 为突出特点，是十分可口的野味，为高档宴席之难得食品，而且由于其营养丰富，含有一些 人体必须的维生素以及氨基酸等营养成分，可以用来制作高级滋补营养品。貉肉还可以入药， 既补充营养，又可调理病情。第三，貉胆具有很高的药用价值，它可以代替珍贵药物一熊 胆入药，滋补身体，尤其是治疗胃肠疾病及小儿痢症更加有效。第四，貉粪是农业上高效优 质的肥料。 我国具有比较丰富的野生貉资源，起初，主要靠人工狩猎捕获野生貉来满足市场对貉皮 的要求，而人工狩猎必然对野生貉种资源造成破坏。一方面，旺盛的需求刺激高强度的猎取， 致使捕猎超过自然野生貉群的承受能力，使其种群难以恢复，种群规模减小、萎缩，尤其可 能造成局部地区貉种群的衰落。另一方面，人工狩猎也可以说是一种选择方式，它可能使貉 种群中的老弱病残等个体有更多机会被猎取逐渐淘汰，当然这种行为也完全可能使其中某一 变种首先灭绝，造成遗传基因的损失。我国人工养貉业近几年也有所发展，通过人工饲养， 可以使貉种群的优良特点得以发挥，而使某些缺点在人为抑制下不能充分表现，从而增强群 体的生存能力。在人工条件下，可以通过育种，培养出新的个体，它们不仅可以继承综合野 生貉的优良种性，而且还可以表现出野生貉原来没有表现出来的好特性，并能遗传下去，逐 渐形成一个优良种系，丰富貉的种质资源。 貉的育种起步较晚，主要是依赖于表型选择，但表型选择对以下特点的性状具有局限性： 第一、对于一些低遗传力的性状，这类性状的的表型选择进展较慢；第二、难以度量的性状， 这类性状度量起来费时、费力；第三、在生长后期才能表现的性状，这类性状只有将动物饲 养到性状表现日龄时才能进行选择，加大了饲养的成本；第四、限性性状，某些性状只在一 个性别中得以表现，因此，只能通过同胞或后裔来估计其表型性状。与表型选择相比，标记 辅助选择( m a s ) 具有一定的优势：第一，可以进行早期选择，从而缩短世代间隔，加快育 种进展。第二，选种时不需要保留专门用于屠宰的群体，从而节省投资和时间。第三，分子 标记不受日粮营养、饲喂状态和饲养环境的影响，从而使选择的准确性大幅度提高。 东北农业大学农学硕士学位论文 随着畜禽基因组研究工作的全面展开，基因的奥秘正在被逐渐揭开，人们可以逐渐从分 子水平上了解数量性状的遗传变异。从发展趋势看，畜禽基因组研究以及建立在此基础上的 分子育种技术将是动物育种中提高选种准确性、加快优良畜禽品种( 系) 培育速度的重要途 径。应用新的理论和技术手段，我们可以逐渐检测影响数量性状的各个基因( 或基因簇) ，尤 其是具有较大效应的基因( 主效基因) ，对于这些基因我们可直接测定其基因型，也可测定与 其紧密连锁的d n a 标记来推断其基因型，从而实现对基因型的直接选择。 生长激素( g r o w t hh o r m o n e ，g h ) 是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋 白质激素，是调节动物生长发育等代谢过程的一个重要内分泌因子，g h 为生物大分子不能直 接透过细胞膜，必须通过与靶细胞表面的g h r 结合发挥作用。胰岛素样生长因子( i n s u l i n - l i k e g r o w t hf a c t o r , i g f ) 是一类多功能细胞增殖调控因子，在细胞的分化、增值，个体的生长、发 育过程中都具有重要的促进作用，其中，i g f - i 具有调控细胞分化和增值，也具有抑制凋亡的 作用。i g f 的生物学功能是通过与特意性的靶细胞表面的受体结合而实现的，目前发现有两 种i g f 受体，i g f i r 和i g f i i r ，其 i g f 对生长过程的影响主要通过i g f i r 介导的。因此，本 研究将g h 基因、g h r 基因、i g f - i 基因和i g f i r 基因作为影响貉子皮长等性状的候选基因， 在乌苏里貉群体中研究这四个基因的变异，并结合数量遗传学和生物统计学的方法分析这些 变异对貉子皮长等性状的影响程度，探讨g h 基因、g h r 基因、i g f - i 基因和i g f - i r 基因是否 为影响貉子皮长等性状的主效基因及能否作为分子标记对貉子的皮长等性状进行标记辅助选 择。 1 2 文献综述 1 2 1 分子育种的主要技术方法 传统的数量遗传学理论认为，数量性状受微效多基因控制，其遗传遵循孟德尔遗传规律。 根据微效多基因假说，数量性状的变异是由很多基因共同作用引起的，由于基因的数目很多， 而每个基因的作用一般都很微小，再加上环境因素的干扰，我们不能对每个基因单独进行分 析。分子生物学的发展，为我们提供了进行数量性状遗传机制研究的新手段，同时促使我们 改变对数量性状的遗传机制的研究策略( 吴常信等，1 9 9 7 ) 。人们在研究基因组结构时发现， 控制生物性状的基因在基因组中的分布并不是随机的，往往功能相关的基因是成簇分布的， 在这个基础上，g e l d e r m a n n ( 1 9 7 6 ) 提出了控制数量性状的数量性状位点( q u a n t i t a t i v e t r a i t l o c i ，q t l ) 的概念。自7 0 年代以来，人们陆续发现了一些对数量性状有明显作用的主基因。 例如，影响鸡体形大小的矮小基因( m e r a t 等，1 9 9 4 ) ，影响猪的瘦肉率和肉质的氟烷基因( s m i t h 等，1 9 7 7 ) ，影响肉牛的肌肉丰满程度的双肌基因( r o l l i n 等，1 9 7 2 ) ，影响绵羊产仔数的f e c b 基因( m u l s a n t 等，2 0 0 1 ) 等。人们将这些基因称为主效基因，这里的主效基因是相对于微 效基因而言的，也就是说它们并不能决定数量性状的所有变异。一般认为如果一个基因的效 应( 两个纯合基因型的基因型之差) 达到o 5 - 1 0 表型标准差时，可将其看做主效基因。分子 遗传标记的出现，可以使人们真正从d n a 水平上对影响数量性状的单个基因或染色体片段 进行分析，并运用统计学手段将影响数量性状的多个基因剖分开，从而对控制数量性状的基 因进行精细的研究。 目前借助分子生物学技术进行q t l 检测的方法主要有两类，一类是基因组扫描法 2 引言 ( g e n o m es c a n n i n g ) ，另一类是候选基因法( c a n d i d a t eg e n e a p p r o a c h ) 。 1 2 1 1 基因组扫描法 基因组扫描法( g e n o m es c a n n i n g ) 也称为标记一q t l 连锁分析( m a r k e r - - q t ll i n k a g e a n a l y s i s ) ，是基于遗传标记座位等位基因与q t l 等位基因之间的连锁不平衡关系，通过对遗 传标记从亲代到子代遗传过程的追踪以及它们在群体中的分离和数量性状表现之间的关系的 分析，来判断是否有q t l 存在，并揭示它们在染色体上的相对位置以及效应大小的方法。因 而这类方法的前提是：要有理想的遗传标记；要有合适的群体用于进行分析；在该群体中存 在分离的q t l ( 张沅，2 0 0 1 ) 。尽管基因组扫描法的成功率较高，理论上可以检测出基因组 中的所有q t l ，但由于建立资源家系的花费较大，而且只有具有中等或更大遗传效应的q t l 才能被检测出来，再加上很难精确定位和不便应用的因素，使得基因组扫描法目前在我国开 展较少。 基因组扫描法的基本步骤包括：1 进行试验设计；2 选择遗传标记；3 收集数据；4 构 建标记连锁图谱；5 q t l 的检测及q t l 参数估计。 1 2 1 2 候选基因法 候选基因法是根据已有的生理生化知识及对复杂数量性状的剖析，来推断哪些基因可能 参与了性状的形成和变异，预先确定一些基因( 称为候选基因) ，通过分子生物学试验检测这 些基因及其分子标记对特定数量性状的效应，筛选出对数量性状有影响的基因和分子标记， 并估计出它们对数量性状的效应值，最后在分子生物学水平证实基因的变异能否带来真实的 表型变异。候选基因的确定还可以借鉴人和小鼠的研究成果，选择在人类或小鼠及其它物种 中发现具有较大效应的突变基因作为候选基因。此外还可以根据标记q t l 连锁分析结果， 在可能存在q t l 的区域去选择那些已经定位的基因，因为这样的基因有较大的可能性成为主 效基因。 应用于候选基因分析的群体应该有充足的d n a 样品和表型信息，以研究候选基因和性 状之间的关系。从理论上讲，任何群体都可以用于候选基因的分析，可以是常规的育种群， 也可以是一个未经过任何选择的地方群体。但是用两个近交系或品系( 种) 杂交所得到的群 体有一定的缺陷，因为在这些群体中，基因之间容易处于高度连锁不平衡状态，这样就很难 判定所发现的性状与候选基因之间是由于候选基因本身引起的，还是由于另一个与候选基因 连锁的基因引起的。 在农业动物经济性状q t l 的检测上，候选基因法是一个强有力的工具( r o t h s c h i l da n d s o l l e r , 1 9 9 7 ) 。候选基因分析法已被广泛应用于牛、猪、羊等家畜重要经济性状的q t l s 检测 上。美国i o w a 大学r o t h s c h i l d 等最早将雌激素受体基因( e s r ) 作为控制猪产仔性状的候选 基因进行了深入研究，研究表明，e s r 中的b 等位基因可提高猪产子数，b b 纯合子与a a 纯合子相比，第一胎每窝多产将近2 3 头仔猪，表现出加性基因效应( r o t h s c h i l d 等，1 9 9 1 ) 。 其它的猪主要经济性状候选基因如促卵泡素基因( f s h 3 ) 、氟烷敏感基因( h a l ) 、脂肪酸结 合蛋白基因( f a b p ) 、猪o b 基因、抑肌素基因( m o y s t a t i n ) 、肌细胞生成素基因( m o y g e n i n ) 及猪生长激素基因( g h ) 等也都得到了较为深入的研究( 曹果清等，2 0 0 2 ) ；将f e c b 基因 作为候选基因，对该基因变异与绵羊多产性状( 排卵和产羔数) 关系的研究已有报道( m u l s a n t 等，2 0 0 1 ；张鸿鸣，2 0 0 2 ：王启贵，2 0 0 3 ) 。 3 东北农业大学农学硕士学位论文 候选基因法分析的步骤： 作为某个性状的候选基因通常是一些已知其生物学功能和核酸序列的基因，它们参与性 状的生长发育过程。这些基因可能是结构基因、调节基因或是在生化代谢途径中影响性状表 达的基因。候选基因法研究要遵循一定的步骤，如候选基因的选择、引物的设计、基因特定 片段的扩增、多态位点的寻找等。 1 候选基因的选择：选择候选基因主要有三个途径。一是根据已知的生物学及生理生化 知识，选择那些在被研究性状的形成途径中起关键作用的基因作为候选基因；二是根据比较 基因组学的方法，选择在人类或小鼠或其它物种中发现的具有较大效应的突变基因作为候选 基因；三是根据标记一q t l 连锁分析的结果，通过位置克隆的办法在可能存在的q t l 的区 域内去选择那些已经定位的基因作为候选基因。 2 引物设计及基因相应片段的扩增：引物设计是候选基因分析法中最重要的一步，引物 设计必须知道候选基因的序列，这通常可以从现有的数据库( 如g e n b a n k ) 中去寻找特定基 因的序列信息。当仅有e d n a 序列可供利用时，外显子的界限通常可以根据比较基因组学的 原理从其它相近的物种通过跨越内含子扩增的方法得到。如果数据库中既无研究品种的基因 序列又无c d n a 序列可供利用时，可根据其它一个或多个品种的序列信息推断出一个一致的 序列，以此设计引物。如果这些物种的序列没有一致性，则需要用特定的技术测定所研究物 种该基因的序列并设计引物。随着各物种基因组测序的完成，我们可以将一些c d n a 序列与 基因组序列进行比对，来获得基因的全部序列，然后根据全基因序列设计引物。 3 候选基因多态性的寻找及大规模基因型分析：在一个基因内部通常会有一些中性的多 态位点，这些位点一般会与那些决定候选基因的功能位点之间存在很强的连锁不平衡，因而， 在候选基因分析时，候选基因内部以及它的调节、扩展区域内的任何多态位点都可利用。候 选基因多态性的寻找及基因型分析有多种方法，目前常用的方法有p c r - r f l p 、p c r - s s c p 和d n a 测序等。 4 选择用于进行候选基因分析的群体：原则上，无论是常规育种的商业化育种群体，还 是一个未经选择的地方品种群体都可用于候选基因的分析。但是用两个近交系或品种杂交所 得到的群体则有一定的缺陷，因为在这些群体中基因之间都处于连锁不平衡状态，这样就很 难判定所发现的性状与候选基因之间的关联是由候选基因本身引起的，还是由于另一个与候 选基因连锁的基因引起的。 5 候选基因与表型性状间的相关分析：在进行候选基因与表型性状间的相关分析时，我 们可以利用线性模型，将候选基因基因型作为固定效应，用最j , , - - 乘分析或广义最小二乘分 析检验候选基因与性状的关系，并估计候选基因效应的大小。 6 连锁关系的验证：候选基因与数量性状的连锁关系通常是在某一群体的特定世代中发 现的。所以，该效应可能是仅仅存在于该群体中，甚至仅仅存在于该世代中。因为当一候选 基因与某个真正影响该性状的q t l 处于暂时的连锁不平衡状态时，这个q t l 与候选基因并 不一定紧密连锁，可能与它相隔一段距离甚至可能在不同染色体上，发生这种情况可能纯粹 是由于机遇造成的，也可能是样本因素的缘故。鉴于连锁不平衡产生的候选基因与影响该性 状q t l 的连锁关系可能只存在于该群体中，而且候选基因效应的产生也可能是因为其等位基 因与研究群体中的特殊遗传背景有交互作用，所以，在某一群体中得到的候选基因效应需要 4 引言 在该群体中经过个或多个后续世代的验证，或在同品种不同群体以及不同品种中进行验证。 1 2 1 3 基因组扫描法与候选基因法的比较 这两种方法各有优缺点。候选基因法采取的是“重点突破”的战略，但在众多的基因中我 们到底要针对哪些基因去研究是解决问题的关键。候选基因法尽管操作简单，但容易遗漏那 些基于我们目前的知识不知道其功能但可能对我们所关注的目标性状有很大影响的基因。因 此，利用候选基因法进行q t l 检测的关键是选择候选基因。基因组扫描法采取的是“全面出 击”的战略，但进行全面的基因组扫描必须有较大的先期投入( 如建立资源群体、大量的微卫 星标记) ；另外，对于用这种方法检测到的q t l ，研究者必须阐明这些q t l s 中到底包含哪 些基因，只有这样才能对q t l 进行有效的操作。 1 2 2 分子遗传标记 无论是候选基因法还是基因组扫描法，都需要借助合适的分子遗传标记来进行分析。一 个理想的d n a 标记应该至少要符合以下几个要求：氖高度多态，即标记座位具有尽可能多 的等位位点；b 分析操作方便，即适合子作大规模的基因型分析，特别是适合自动化分析， 并且测定不受年龄、性别、环境等因素的限制；c 数量多，而且均匀地覆盖整个基因组，d 遗传共显性，即在分离群体中能够区分所有可能的基因型。 1 2 2 1 常用分子遗传标记 目前常用于基因组学研究和动物遗传学研究的分子遗传标记主要有：1 限制性片段长 度多态( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) ；2 d n a 指纹( d n af i n g e r p r i n t , d f p ) ；3 随机扩增多态d n a ( r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m sd n a ，r a p d ) ；4 微 卫星d n a ( m i c m s a t e l l i t ed n a ) ；5 s n p ( s i n g l e n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ) 。s n p 技术是新 近发展起来的，具有广阔应用前景的一种分子遗传标记，所谓s n p 是指基因组中单个核苷酸 变异引起的d n a 序列多态，包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式。本研究所用的 分子遗传标记主要为基于p c r - s s c p 的s n p s 。 1 2 2 2 候选基因的s n p s 检测原理与方法 s h i p s 是指基因组中单个核苷酸变异引起的d n a 序列多态，包括单碱基的转换、颠换、 插入及缺失等形式。s n p s 被称为继第一代遗传作图用分子标记球f l p 、第二代遗传作图分 子标记微卫星( m i c r o s a t e l l i m ) 之后的第三代遗传作图分子标记( 吴昕彦，2 0 0 0 ) 。s n p s 具有理想的分子标记应具有的特性：1 高密度，在人类基因组中估计每3 0 0 - 1 0 0 0 b p 一个， 整个基因组中达到3 x 1 0 6 个，其密度较微卫星更高。鸡的遗传差异图谱研究结果表明，鸡基 因组平均一千个碱基内存在5 个s n p s 位点，这比人类基因组中的s n p 密度高很多。2 遗 传稳定性高，具有较微卫星更高的遗传稳定性。3 易实现自动化分析，由于n n p s 位点只有 两个等位基因( 双等位基因标记) ，在检测时只需“有或无”的方式，无需像微卫星标记那样对 片段的长度做出度量，所以十分容易实现自动化分析。由于具有以上特性，s n p s 在基因组研 究中的应用前景十分广阔。在本研究中主要采取以下3 种方法进行s n p s 的检测和分析。 1 直接测序 在已有的各类方法中，测序是检测突变最准确、最彻底的方法。通过直接钡0 序检测s n p s 的原理是：通过对不同个体同一基因或基因片段进行测序及序列比较，寻找所研究的d n a 片段中存在的所有碱基变异。采用直接测序检测s n p s 还可以同时得到s n p s 的类型、在所研 5 东北农业大学农学硕士学位论文 究片段中的准确位置、s n p s 分型及应用所需要的重要参数等，但其缺点是目前的测序比较费 时、费力，成本较高。 2 p c r - s s c p 技术 p c r - s s c p ( p o l y m o r a s ec h a i nr e a c t i o n - s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m s ) 检测 s n p s 的原理是s n p s 会导致单链d n a 构像的改变，而构像的改变则表现为泳动速度的改变， 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测出来。p c r s s c p 的检测过程十分简单，首先对所研究的 片段进行p c r 扩增；将p c r 产物变性以后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；银染之后即可得到 良好的结果。目前，p c r - s s c p 已发展了荧光标记引物，便于d n a 测序仪自动检测分析。 3 p c r r f l p 技术 p c r - r f l p ( p o l y m o r a s ec h m nr e a c t i o n - r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ) 检测 的原理是d n a 序列的变异可能会导致限制性内切酶酶切位点的改变，用特定的内切酶消化 之后会产生片段长度多态，酶切片段经琼脂糖凝胶电泳就可将其分开。p c r r f l p 是一种方 便、快捷、常用的s n p s 检测技术。首先设计特异引物扩增含有序列变异的基因片段；然后 用适当的限制性内切酶消化；经琼脂糖凝胶电泳之后可直接在紫外灯下观察结果，比较限制 性酶切片段的多态性。 1 2 3 影响貉子生长相关基因的研究进展 1 2 3 1 生长激素基因( g h ) 的研究进展 生长激素( g h ) 是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白质激素，它具有 调节糖类、脂类和蛋白质3 大类物质代谢的重要作用( v a s i l a t o s y o u n k e n , 1 9 9 9 ) 。生长激素的 生物学功能主要有两方面( 1 ) 促生长作用：g h 能直接作用于全身的组织细胞，增加细胞的 体积和数量，还可通过存在于血清的一种多肽一生长素介质的间接作用，促进钙、磷和硫酸 根在软骨中的沉积，加速软骨基质的合成和软骨细胞的分裂，使骨骺部的软骨生长，再钙化 成骨，从而促进骨的生长。( 2 ) 对物质代谢有重要影响：g h 能促进氨基酸，特别是甘氨酸、 亮氨酸进入细胞，加强d n a 合成，刺激r n a 的形成，加速蛋白质合成。g h 能促进脂肪分 解，使脂肪酸进入肝脏，经氧化后提供能量，游离脂肪酸增加还可对葡萄糖氧化产生抑制作 用，从而减少葡萄糖的消耗。生理水平的g h 可刺激胰岛素b 细胞，引起胰岛素分泌，加强 葡萄糖的利用，出现所谓g h 生糖作用。因此，g h 对机体的生长起着关键性的作用( 孙逊等， 1 9 9 9 ) 。 生长激素发挥作用主要有两种途径：一是通过与生长激素受体g h r 结合，刺激局部组 织产生胰岛素样生长因子1 ( i g f i ) ，i g f i 通过旁分泌或自分泌方式作用于肌肉、骨骼等， 促进机体生长发育；二是直接作用于靶器官生长激素受体。 g h 基因由5 或6 个外显子，4 或5 个内含子组成。c d n a 长度一般为8 0 0 1 2 0 0 b p ，g h 的信号肽和成熟肽分别为1 6 2 7 和1 8 6 1 9 1 个氨基酸。不同纲动物闻在基因长度，外显子 数目和大小，内含子大小，碱基组成，5 端和3 端非编码序列，局部碱基序列，g h 的氨基 酸数目和序列等方面存在着很强的同源性。很多哺乳动物人( d e n o t o 等，1 9 8 1 ) 、大鼠0 3 a r t a 等，1 9 8 1 ) 、小鼠( d a n i e l 等，1 9 8 5 ) 、猪( s e e b u r g 等，1 9 8 3 ) 、鸡( 1 a m b 等，1 9 8 8 ) 、鸭( c h e n 等，1 9 8 8 ) 和火鸡( f o y e r 等，1 9 9 0 ) 等的g h 基因c d n a 序列都已被发表，人( d e n o t o 等， 1 9 8 1 ) 、大鼠( a n d r e a 等，1 9 8 1 ) 、猪f v i c e 等，1 9 8 7 ) 和鸡( t a n a k a 等，1 9 8 8 ) 等的全序列也已 6 引言 鲁昌皇皇詈皇鼍量葛鲁鼍iii i 一一 i|_ _ 一_ n 一i i 鼍詈鲁皇毫詈詈寡置 相继被发表。狗的g h 基因c d s 全长6 5 1 b p ，被定位在狗的9 号染色体上，由5 个外显子和 4 个内含子构成。 有关猪、牛、鸡等g h 基因的多态性及多态性与生长等性状的相关研究已有报道。 k i r k p a t r i c k 等( 1 9 9 1 ) 。首先扩增出p g h 基因+ 4 8 ( + 8 8 9 ) 位长约8 4 2 b p 的片段，在1 7 头无相 关汉普夏和约克夏公猪中检测p o h 基因5 端和第二内含子存在r f l p s ，且5 端的等位基因 频率存在品种间差异。c a s a s - c a r r i l l o ( 1 9 9 7 ) 等报道纯种约克夏猪的一个家系中r f l p s 与眼肌 面积显著相关，与生长速度和背膘厚度相关不显著。牛g h 基因的研究比较早，1 9 7 6 年w a l l i s 等即发现在第1 2 7 位存在变异，f a l a k i 等( 1 9 9 4 ) 用传统r f l p 在h o l s t e i n - f r i e s i a n 奶牛中发现 g h 基因t a q i 多态性，其等位基因e 与低产奶量、低乳脂率、低乳蛋白相关 1 2 3 2 生长激素受体基因( g h r ) 的研究进展 1 9 8 7 年l e u n g 等人从兔肝脏中提取纯化出生长激素受体基因( g h r ) ，通过s d s p a g e 显 示该蛋白分子量为1 3 0 k d ，氨基酸序列分析表明g t - i r 上有泛素与其共价结合，他们根据氨基 酸序列首次从兔的肝脏c d n a 文库中克隆出g h rc d n a 。由兔g h rc d n a 推导成熟的g h r 由 6 2 0 个氨基酸组成，分子量为7 0 k d ，比通过s d s - p a g e 显示的g h r 分子量小，这可能是因进 行s d s p a g e 检测时g r 有泛素及糖基结合所致。对纯化g 汲眭i c d n a 推导出的氨基酸序 列分析表明，g h r 是单链跨膜糖蛋白，其胞外区、跨膜区及胞内区分别由2 4 5 、2 5 及3 5 0 个氨 基酸组成。随后人们相继克隆出了人、猴、大鼠、小鼠、牛、猪、绵羊鸡以及家鸽的g h r e d n a 。运用g 己基因的点突变( p o i n t m u t a t i o n s ) 等方法，现已基本阐明g h r 在细胞膜上的空 间结构。g h r 胞外区有5 个保守的糖基化位点，这是与配体结合的部位。胞外区特定的位置 有7 个半胱氨酸，其中有6 个形成二硫键，起着维持g h r 胞外区段特定空间结构的作用。在胞 外区接近细胞膜的位置有w s x w s 样基序，即由唧，s e r - x x x - t r p s e r 等5 个氨基酸残基组成的 保守序列( 其中) ( ) o ( 代表任意氨基酸) ，这一结构可能在g h 与g h r 结合过程中起着稳定空间构 象的作用，这对于g h 与g h r 结合及其后的信号转导都是非常重要的。在胞内区，人们发现 了两段保守序列，靠近细胞膜的一段序列框l ( b o x l ) l 妇8 个氨基酸组成，富含脯氨酸，另一段 序列框2 ( a o x 2 ) 含1 5 个氨基酸，距b o x l 3 0 个氨基酸残基，如这两段保守序列中的某一个氨基酸 发生突变g h 将会失去促进生长的作用，表明b o x l 、b o x 2 在g 己介导的信号转导过程中起着 关键作用( 图1 1 ) 。 大多数哺乳动物的g h r 基因由l o 个外显子和9 个内含子组成，在人的肝脏中，外显子1 长 度不一，调控转录的起始；翻译起始位点位于外显子2 上，该外显子编码5 非翻译区( 5 l r m ) 最 后的l l b p 的氨基酸残基，1 8 个氨基酸的信号肽和胞外区起始的5 个氨基酸残基；外显子3 7 编 码胞外结构域：外显子8 编码胞外结构域的最后3 个氨基酸残基，一个2 4 个氨基酸残基的跨膜 结构域和胞内区开始的4 个氨基酸残基；外显子9 和l o 则编码胞内结构域和3 ，u t r 。山羊和牛 g h r 基因都位于2 0 号染色体的长臂q 1 7 带上，并且也与p r l r 位于同一区域狗的g h r 基因c d s 全长1 9 1 7 b p ，定位子狗的4 号染色体上，由9 个外显子和8 个内含子构成。 7 东北农业大学农学硕士学位论文 图卜1 生长激素受体结构模式图 f i g 1 - 1t h e s t r u c t u r eo f g r o w t hh o r m o n e r e c e p t o r 近年来，人们在牛、羊g h r 许多位点上发现不同个体、不同品种间存在丰富的多态性。 m o i s i o ( 1 9 9 8 ) 等从g h r 基i 困c d n a 3 侧翼区选择了一条3 0 3 b p 片段( 3 0 b p 的编码区和2 7 3 b p 的非 编码区) 进行y p c r 扩增，发现g h r 基因的侧翼区有3 1 1 b p 、3 2 0 b p 、3 2 5 b p 三种长度的变异和 一个碱基替代多态性。g e 等( 2 0 0 0 ) 在山羊第十外显子内发现了4 个s n p s ，分别位于7 6 b p ( t p c ) ，2 0 0 b p ( g p a ) ，2 2 9 b po v c ) 和2 5 7 b p ( a p g ) 处，其q b 2 0 0 b p 和2 5 7 b p 处的s n p s 引起了氨 基酸的替代，a l a 厂1 r 和s e r g l y ；另外两个为沉默突变。m a j 等( 2 0 0 5 ) 用r f l p 方法对牛g h r 基 因5 端进行了多态性分析，用t s e i 和s a u 9 6 1 酶切后发现了两个单核苷酸多态( s n p s ) ，两处都发 生了c t 替代，经研究发现，s a u 9 6 i 基因型与l i n e 1 的插入或缺失有绝对的关系。 关于g h r 基因的遗传多态性与生产性能的相关分析已有很多报道。f a l a k i 等( 1 9 9 6 ) 报道 在用来编码细胞内部分c 端的d n a 序列中发现了9 个r f l p t a q i 基因型，并且该位点的多态性 与意大利荷斯坦奶牛的乳蛋白百分含量相关。s b l o t t 等( 2 0 0 3 ) 报道在h o l s t e i n f r i e s i a n 牛 g h r 基因部分编码区和内含子内发现了7 个s n p s ，其中，第八外显子中的s n p 导致了受体跨 膜区的f 2 7 9 y 氨基酸的替换，从而影响牛的产奶性状。l d is t a s i o ( 2 0 0 5 ) 等研究了g h r 基因 的第十外显子2 5 7 b p 处的单核苷酸多态与1 4 个产肉性状和4 个肉质性状的关系，发现g h r a 基 因型对肉品质有不利影响。a n d r z e jm a j 等( 2 0 0 6 ) 研究了5 u t r 的4 个s n p s 与波兰黑白花牛产 肉性能的相关性，进行了单个和合并基因型的分析，结果发现，单个基因型对生产性状没有 影响，合并基因型分析发现其多态性对饲料利用率、屠体重影响差异显著。 1 2 3 3 类胰岛素样生长因子1 基因( i6 f - i ) 的研究进展 i g f i 是由7 0 个氨基酸组成的单链碱性多肽，分子量为7 6 4 8 7 k d ，等电点为p h 8 6 。i g f i 的一级结构由4 个结构域构成，即b 域，c