（微生物学专业论文）核仁蛋白dnt1在裂殖酵母rdna沉默中功能的初步研究.pdf

文摘要 中文摘要 真核生物基因组中包含多个r d n a 拷贝，以串联重复序列的形式存在，成簇排列形 成一个或多个核仁组织区。核仁是r r n a 合成、加工和核糖体亚单位装配的场所。r d n a 重复序列的稳定性和完整性对于维持一定水平的r l a 合成、核糖体装配和蛋白质合成 是非常重要的。理论上，r d n a 作为一种重复序列，相当不稳定，彼此之间很容易发生 同源重组。姐妹染色单体间发生不均等交换，会导致r d n a 越来越短，影响细胞生长和 其它功能。然而，细胞在进化过程中，产生了保护r d n a 重复序列稳定性和完整性的内 在机制，可能是通过抑制同源重组和外源基因启动子的转录来实现的。 最近对粟酒裂殖酵母( f i s s i o ny e a s t ，& 历切j 钟c 向册所w 船阳历抛) 中新核仁蛋白d n t l 的研究表明其参与调控r d n a 沉默( r d n as i l e n c i n g ) 。所谓r d n a 沉默是指由r n a 聚 合酶p o li l 驱动转录的外源基囚插入到r d n a 区时，外源基囚的表达受到抑制的现象。 并且，d n t l 是p c s l m d e 4 复合体中的p c s l 在核仁中的正确定位所必需的。人们已经知 道p c s l m d e 4 在芽殖酵母( b u d d i n gy e a s t ，勋c c 办舢朋伦卵c p 增v 括豇把) 中的同源复合体 c s m l l r s 4 是维持r d n a 沉默所必需的。由于d n t l 与芽殖酵母的t o f 2 有一定的同源性， t o f 2 又同c s m l 、l r s 4 及其核仁沉默与末期退出调控复合体( r e g u i a t o ro fn u c l e o l a r s i l e n c i n ga n dt e l o p h a s ee x i t ，趾n tc o m p l e x ) 相互联系共同调控r d n a 沉默及其i 司源重 组，我们推测在裂殖酵母中可能也存在一个类似的复合体参与这一调控。 对于d n t l 的前期研究工作还发现，d n t l 是r n a 聚合酶l 大亚基n u c l 专一地定位 在核仁所必需的，前期证据指向这种情况似乎也适用于上游激活因子r m 5 。同时n u c l 和r m 5 也是d n t l 专一地定位在核仁所必需的，它们。町能不是简单的上下游关系。新近 研究结果表明，n u c l 和i h 5 是集缩素( c o n d e n s i n ) 有丝分裂中期富集在r d n a 区所必 需的，而早先就有芽殖酵母中集缩素参与调控r d n a 沉默的报道，因此我们也推测在裂 殖酵母中d n t l 可能通过影响集缩素调控r d n a 沉默。 另外，有趣的是，在裂殖酵母中存在芽殖酵母中未曾发现的r n a i 系统。人们已经 有证据显示裂殖酵母中的r n a i 系统直接或间接地参与调控r d n a 重复序列的稳定性和 完整性及其沉默。我们感兴趣于d n t l 和l a i 在调控r d n a 沉默上是否有相互联系。 摘要 在本论文中，我们主要采用遗传学、细胞生物学和分子生物学方法，研究d n t l 在 调控裂殖酵母r d n a 沉默中的可能机制。遗传学实验结果表明，p c s l m d e 4 复合体不同 于其在芽殖酵母中的同源体，不参与调控r d n a 沉默，显示出这两种亲缘关系较远的酵 母在进化上保守而又分化的两面性。裂殖酵母集缩素亚基类似于其在芽殖酵母中的表 现，参与了r d n a 沉默的调控。此外，集缩素有丝分裂中期在r d n a 区的富集依赖于 d n t l ，而调节集缩素亚基在有丝分裂中期在r d n a 区富集的其它蛋白因子的突变体，包 括n u c l 、l h 5 、c u t l 5 、c u t l 7 和k 1 等也都表现出r d n a 沉默的解除，也就是说它们 都能够参与调控r d n a 沉默。所以我们推断，d n t l 是通过调节集缩素在有丝分裂中期 r d i n a 区的富集调控r d n a 沉默。本论文还发现d n t l 独立于r n a i 系统中的a 9 0 1 和 d c r l 调控r d n a 沉默，显示出裂殖酵母调控r d n a 沉默的复杂性和多样性。 关键词：d n t l ；集缩素；r d n a 沉默 i i a 卜j t r a c t a b s t r a c t l na l le u k a r y o t e s ，r d n ai so 唱锄i z e da so n eo rm o r ea n a y sc o n t a i n i n ga n y w h e r ef r o m l0 ，0 0 0r 印e a t i n gu n i t s ，w h i c hc a nf o r mo n eo rm o r en u c l e o l iw h e r er i 酬as y n t h e s i s ， p r o c e s s i n g 明da s s e m b l yi n t or i b o s o m e so c c u r t h ei n t e g r i 够o fr d n ai si m p o r t a n tf o rc e l l g r o 叭ha n ds u r v i v a l a ss u c hal a 唱ea n dr e p e t i t i v el o c u s ，i t st h o u 曲tt ob eu n s t a b l e ，u n e q u a l r e c o m b i n a t i o ne v e n t so c c u 盯i n ga n dm i g h ta a e c tc e l ls u n ，i v a l h o w e v e r ，c e l l sh a v et h e r e f o r e e v 0 1 v e dm e c h a n i s m st 0p r o t e c tt h es t a b i l i 够a n di n t c g r i 妙o fr 【) n aw h i c hm i g h t 衄o u g h i n h i b i t i n gh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o na n dr e p r e s s i n gt r a n s c r i p t i o nf i r o mf o r e i g np r o m o t e r s r e c e n t l y ，an e wn u c l e o l a rp r o t e i nd n t lw a sf o u n dp a r t i c i p a t e i n gi nr d n as i l e n c i n g ，a p h e n o m e n o nt h a tr n ap o li i t r a n s c r i b e dg e n e sa r er e p r e s s e dw h e ni n t e g r a t e di n t or d n a r e g i o n s d n t lw a sa l s or e q u i r e df o rn u c l e 0 1 a rl o c a l i z a t i o no fp c s1 t h e i rh o m o i o g si nb u d d i n g y e a s tc s m la n dl r s 4w e r er e q u i r e df o rr 【) n as i l e n c i n g c s ml ，l r s 4a n dr e n tc o m p l e x ， t o g e t h e rw i t ht b f 2f o m l e dap m t e i nb r i d g et or e g u l a t er d n as i l e n c i n g 锄dh o m o l o g o u s r c c o m b i n a t i o ni nb u d d i n gy e a s t ，d n t1h a p p e n e dt ob eh o m o l o g o u st o1 b f 2t os o m ee x t e n t s o w ep r e d i c t e dt h a tt h e r em i 曲tb eas i m 订a rr e g u l a t i n gc o m p l e xi nf i s s i o ny e a s t d n t lw a sa l s of o u n dt ob er e q u i r e df o rm a i n t a i n i n gt h ee x c l u s i v en u c l e o l a rl o c a l i z a t i o no f t h e l a 唱e s ts u b u n i to fr n ap o l y m e r a s ein a m e dn u c la n dm i g h ta l s or e q u i r e df o r 锄u p s t r e a m a c t i v a t i n gf a c t o r ( u a f ) f o r 砌v ap o l y m e r a s ei i n v o l v i n gi nt r a n s c r i p t i o no fr i b o s o m a li 斟a ( r i 之n a ) c a l l e dr m 5 ，v i c ev e r s a an e wp a p e rr e p o r t e dt h a tn u cla n dr m 5w e r er e q u i r e d f o rc o n d e n s i na c c u m u l a t i o na tr d n a si nm i t o t i cm e t a p h a s e i n t e r e s t i n g l y ，t h e r eh a se v e rb e e n r e p o r t e dt i l a tc o n d e n s i nw a si n v o l v e di nr d n as i l e n c i n gi nb u d d i n gy e a s t t h e r e f o r ed n t l m i g h tp a r t i c i p a t ei nr d n as i l e n c i n gt h m u g hc o n d e n s i n i a b s t r a c t t h em o s ti n t e r e s t i n g l y ，u n l i k eb u d d i n gy e a s t ，t h e r ew a si 乇n a ii n 行s s i o ny e a s ta si nh i g h e r e u k a 呵o t e s p e o p l eh a v ei ( n o w nt h a tr n a ir e g u l a t e dr d n as i l e n c i n gd i r e c t l yo ri n d i r e c t l y ， p r o t e c t e dt h es t a b i l i 妙a n di n t e g r i t yo fr d n a i n t h i sp a p e r ，t a k i n gt h ea d v 锄t a g eo fg e n e t i c ，c e l la n dm o l e c u l a rb i o i o g i c a lm e t h o d s ，、e f o u n dt h a tu n l i k et h e i rh o m o l o g si nb u d d i n gy e a s t ，p c sla n dm d e 4w e r en o tr e q u i r e df o r r 【) n as i l e n c i n g a se x p e c t e d ，c o n d e n s i ns u b u n i t sw e r e i n v o l v e di nr d n as i l e n c i n m o r e o v e r ，c o n d e n s i na c c u m u l a t i o na tr d n a si nm i t o t i cm e t a p h a s er e q u i r e dd n tl ，m u t a n t so f o t h e rp r o t e i n sw h i c hw e r e r e q u i r e df o rc o n d e n s i na c c u m u l a t i o na tr d n a si n m i t o t i c m e t a p h a s ea l s ol e a d e dt od i s l l j p t i o no fr d n as i l e n c i n g t h e r e f o r ew ec o n c l u d e dt h a td n t l m i g h tp a r t i c i p a t e di nr d n as i l e n c i n gt h r o u 曲c o n d e n s i n w ea l s of o u n dt h a td n t lr e g u l a t e d r 【烈as i l e n c i n gi nt h ep a t h w a yi n d e p e n d e n to fa g o1a n dd c r l ，s h o w i n gt h ec o m p l e x i t ya n d d i v e r s i 妙o fr 【) n ar e g u l a t i o ni nf i s s i o ny e a s t k e yw o r d s ：d n t l ；c o n d e n s i n ；r d n as i i e n c i n g 1 v 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成果。本人 在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均在文中以适当 方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为( 专母目鬯周期悯经 ) 课题( 组) 的研究成果，获得( 细腮局蔑目俩控) 课题( 组) 经费或实验室的资助， 在( 细明同奠日：溺控) 实验室完成。( 请在以上括号内填写课题或课题组 负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特别声明。) 声明人( 签名) ：蓖翠莲 2 d d q 年5 月弓1 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办法等 规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交学位论文( 包 括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书馆及其数据库被查 阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国博士、硕士学位论文共 建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和摘要汇编出版，采用影印、 缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文，于 年月日解密，解密后适用上述授权。 ( ) 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“”或填上相应内容。保密学位论文应是已经 厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密委员会审定的 学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为公开学位论文， 均适用上述授权。) 声明人( 签名) ：黄翠莲 2 吁年5 月弓1 日 1 1 裂殖酵母简介 前言 1 前言 粟酒裂殖酵母( & 办泐舳c 幽舢所朋s 阳历沈) 最初是从东非粟啤酒中分离出的，因 此而得名。它是一种单细胞真核生物，以均等分裂的方式产生子代细胞，俗称裂殖酵母 ( f i s s i o nv e a s t ) 。其基因组大小为1 3 8m b ，包含有三条染色体，大约5 ，0 0 0 个基因，其 中1o 是孤儿基因( o r p h 锄s ) ，在进化上与芽殖酵母( b u d d i n gy e a s t ，s 缸c 办伽脚w 邸 c p 旭v 括砌) 亲缘关系较远【l 】。得益于其独特的优点，如易培养，细胞周期短，易分离突 变体，易进行遗传学、生物化学及分子生物学操作等，长期以来，被广泛用作细胞周期 研究的模式材料，也在其它相关领域如微管形成、减数分裂分化、细胞形态发生与极性、 压力胁迫机制和d n a 损伤修复等方面极大地丰富了人们的知识。2 0 0 1 年，裂殖酵母领 袖人物p a u ln u r s e 因其在细胞周期调控方面的杰出贡献，与l e eh 帅e l l 和t i mh u n t 共享了诺贝尔生理学或医学奖【2 】o 裂殖酵母是继芽殖酵母之后第六种被全基凶组测序的 真核生物【3 1 ，人们发现了6 2 种高度保守并且仅在真核生物中存在的基因，它们被认为 是构建真核细胞所必需的，因而提出了从原核生物进化到真核生物所需时间远远长于从 单细胞真核生物进化到多细胞真核生物所需时间的观点。测序结果也证实裂殖酵母三条 染色体的着丝粒分别约为3 5 、6 5 和11 0k b ，比芽殖酵母大3 0 0 到1 0 0 0 倍，人们还不 清楚为什么它会如此之大。- 它的着丝粒含有两种不同的结构域【4 增被认为是一种特例， 但人们逐渐意识到它可能代表了高等真核生物的着丝粒结构。对于裂殖酵母的研究将更 有利于帮助人们了解高等真核生物。 1 2r d n a 沉默( r d n as i l e n c i n g ) 1 2 1r d n a 区是基因组内一个特殊的区域 核糖体d n a ( r i b o s o m a ld n a ，r d n a ) 是指编码核糖体r n a ( r i 喇a ) 的基因。 在真核生物基因组中，r d n a 是一个特殊的区域，具有以下特点： ( 1 ) 包含多个r d n a 拷贝，以串疑重复序列的形式存在，成簇排列。理论上r d n a 前言 作为一种重复序列，相当不稳定，彼此之间很容易发生同源重组，姐妹染色单体间发生 不均等交换，会导致r d n a 越来越短，影响细胞生长和其它功能。然而，细胞在进化过 程中，产生了保护r d n a 重复序列稳定性和完整性的内在机制【5 1 。 ( 2 ) 能够形成一个或多个核仁组织区。核仁是r r n a 合成、加工和核糖体亚单位装 配的场所| 6 】。 ( 3 ) 细胞内6 0 的转录发生在r d n a 区，其中由r n a 聚合酶p o l i 转录2 8 s 、1 8 s 和 5 8 s ，由r n ap o l i i i 转录5 s 川。 ( 4 ) r d n a 在很大程度上是单向复制的，复制方向与r r n a 转录的方向相一致【8 】o ( 5 ) 类似芽殖酵母，裂殖酵母中r c i n a 区形成异染色质区，插入到r d n a 区的由l a p o l i i 介导转录的外源基冈的表达受到抑制，即r d n a 沉默现象 9 1 2 】。 ( 6 ) 至少在酵母里，有丝分裂和减数分裂过程中，相比于基因组其它位点的染色 体区域，r d n a 分离要来得晚【1 3 j ，需要不同于其它区域的独特的机制来实现这一如此庞 大区域的有效分离”1 们。 在裂殖酵母中，r d n a 以7 0 1o o 份拷贝存在于基因组中，大部分聚集在三号染色体 的两端，每个串联重复单位约1 0 4k b 【17 。1 9 1 ，见示意图1 1 。 c h r o m o s o m e l 卜一3 5m b 一 t e l 3 lt o n a c e n 3r d n at e l 3 r l 图1 1 裂殖酵母r d n a 所在位置示意图 f i g 1 1l o c a t i o no fr d n a j nn s s i o ny e a s t 【2 0 】 1 2 2 什么是r d n a 沉默 所谓r d n a 沉默是指在芽殖酵母和裂殖酵母中，当由r n a 聚合酶p o li i 驱动转录的 2 外源基因插入到r d n a 区时，外源基因的表达受到抑制的现象目。如图i 2 所示，将埘叩 和舢4 + 基因整合到带有不同基因缺陷背景苗株的f d n a 医，在不同培养基相同位置上， 依次滴加i o 倍梯度稀释的裂殖酵母细胞，使起始细胞数为】0 5 ，精后一个浓度细胞数目 为1 0 个，通过其在不同培养基p 的生长情况考察以和聊的表达。其中f o a 为含 有5 一氟乳清酸( 5 一f l u o m o r 毗i ca c 5 一f o a ) 的选择培养基，用于反向筛选w d 针的菌株 即能够表达枷4 的菌株无法在f o a 平板上生长；a a 为丰富培养基；a a l e u 和a a u m 分 别代表了缺失了亮氨酸( 1 e u c l n e ) 和尿嘧啶( 唧i l ) 的选择培养基。在野生型细胞中， 没有任何沉默因子缺陷的情况下，整合到r d n a 区的埘和“m 针的表达受到抑制，表 现为其在选择培养基上低浓度下无法生长。当存在某些沉默因了缺陷时，如曲p 凹，这 样的突变体又能在选择培养基上生长良好，说明l e 和r 口抖的表达抑制被解除，暗 示丁曲面参与调控r d n a 沉默。这种沉默不是完全的，而是有泄漏( 1 e a l ( a g e ) 的，表现 为野生型细胞并不是完全无法在选择培养基上生长，高浓度状态下仍然可以生长。它可 能是保护r d n a 重复序列稳定性和完整性的内在机制抑制同源重组的副产物。 圈1 2 裂殖酵母r d n a 沉默 f 唔1 2 r d n a s i i e n c i “g - r 璩s i o oy 哪 1 1 2 3 r d n a 沉默研究进展 1 2 31r d n a 沉默在芽殖酵母中的研究进展 在芽殖酵母的r d n a 区，类似丁异染色质区端粒和交配型基因区的转录沉默，能够 阻遏插入到其中的外源启动子驱动的基因的表达川。这种转录沉默的机制在端粒和交配 ：兰 前言 型区研究得比较清楚。在r d n a 区，已知主要由核仁沉默与末期退出调控复合体( r e g u l a t o r o f n u c l e o l a rs i l e n c i n ga n dt e l o p h a s ee x i t ，r e n t ) 起作用，它包括三种蛋白s i r 2 、n e t l 和 c d c l 4 。其中s i r 2 是一种依赖于n a d + 的组蛋白去乙酰化酶，在进化上十分保守，从果 蝇到人类中都可以找到同源蛋白。它是一种沉默信息调节因子，在调控r d n a 区、端粒 区( t e l o m e r e ) 、交配犁基因区( m a t i n g t y p el o c i ) 基因沉默以及细胞进程等过程中起作 用。n e t l 定位在核仁中，为s i r 2 结合到r d n a 所需。c d c l 4 是一种蛋白磷酸酶，通过与 n e t l 结合定位于核仁中，这种结合抑制了c d c l 4 逸出核仁，直到分裂后期的晚期r e n t 复合体由于磷酸化解体时，c d c l 4 才从核仁中释放出来，调控细胞退出有丝分裂【2 2 ，2 3 1 。 如同前面所述，理论上r d n a 作为一种重复序列，相当不稳定，彼此之问很容易发 生同源重组，姐妹染色单体问发生不均等交换，会导致r d n a 越来越短，影响细胞生长 和其它功能。如果在人体内，这种重组可能会导致多种疾病，比如癌症和亨廷顿舞蹈症 等。对芽殖酵母菌的突变体研究显示了一种惊人的r d i n a 不稳定性，当酵母菌细胞经历 多次分裂之后，它会将多余的r d n a 序列以环状d n a 的形式凸出于染色体上。这些染色 体外的r d n a 缩环( e x t r a c h r o m o s o m a lr d n ac i r c l e s ，e r c ) 是在细胞分裂前与母细胞染 色体一起复制的，但在分裂之后，它们却一直存在于母细胞内。这样一来，r d n a 缩环 就在母细胞内不断积累，最终导致了母细胞的死亡。这或许是因为母细胞会消耗太多的 能量复制这些e r c ，以至于无法复制其基凶组【2 4 】。一系列证据提示细胞在进化过程中， 产生了保护r d n a 重复序列稳定性和完整性的内在机制，可能是通过抑制同源重组和外 源基冈启动子的转录来实现的，也就是说细胞内r d n a 区内同源重组和外源基冈启动子 的转录的抑制似乎享有一套共同的机制和系统，为一个机制的两个不同结果。例如在芽 殖酵母中r d n a 的重组水平受s i r 2 负调控，而s i r 2 义参与了交配型基因区、端粒基因区 和r d n a 基因区沉默；j 护列的突变体则表现出其r d n a 区对微球菌核酸酶、d a m 甲基化 酶和补骨脂素交联( p s o r a l e nc r o s s 1 i n k i n g ) 的敏感性发生变化。这些证据支持了沉默机 制产生染色质结构改变同时影响重组的模型。在这一模型的指导下，h u a n g 等【2 3 睬用亲 和纯化结合高度敏感的质谱，分析了芽殖酵母中阻遏r d n a 区同源重组的蛋f 1 相互作用 网络( 图1 3 ) ，提出了沉默蛋白因子与粘连素环( c o h e s i nr i n g ) 结合共i 一限制r d n a 序 列在姐妹染色单体问的不均等交换的模型( 图1 4 ) ，较好地解释了抑制同源重组和r d n a 沉默之间的相互联系。 4 侈o 斌 阉、- 一、：舀。遣& 图1 3 芽殖酵母中沉默蛋白因子相互作用网络 f 逛1 3s u m m a r i e so f t h ep m 悖i n - p r o t e - i t 洲t i o nn e 咖r k o fs i k n c i “g f a c t o r s i n b u d d i g y e a s t f 2 3 i 图1 4 芽殖酵母中抑制r d n a 区同源重组沉默因子与粘连素环相互作用模式图 f 嘻1 4 m o d d f o r 8p r o t e 抽b r i d g e t h a t i n h i h 舐撇o m b i n a t i o nb y 呲q u a i c r o s s o v e r w i t h i nr d n a i nb u d d i “g y e a ” 1 2 3 2r d n a 沉瞅在裂殖酵母中的研究进展 在裂殖酵母中，t h o n 等【1 研究发现，含染色质调节结构域( c i i r o m o d o m a m ) 的四 种蛋白c h p 2 、s w l 6 、c l r 4 和c h p l 参与调控r d n a 沉默，其中s w i 6 是一种异染色质蛋白， 与哺乳动物细胞中异染色厦蛋白h p l 同源，c l r 4 是一种组蛋白甲基转移酶，催化核小体 组蛋白h 3 第9 号位点耩氨酸( k 9 ，甲基化，形成s w i 6 结合位点，这种结合为异染色质 i i 言 装配和延伸所必需。s h 吼k a r a n a r a y 锄a 等【2 5 】发现芽殖酵母s i r 2 在裂殖酵母中的同源蛋白 s p s i r 2 和s i r 2 一样，能够影响h 3 k 9 甲基化、s w i 6 定位和h 3 k 9 、k 1 4 去乙酰化，参与 调控r d n a 沉默；s p s i r 2 同芽殖酵母的s i r 2 一样，也是一种功能广泛的沉默因子，参与 除r d n a 区外多种位点的基因沉默。两种酵母参与基因沉默的蛋白因子存在很大差异， 而s i r 2 与s p s i r 2 可能有共同的去乙酰化底物，在两种亲缘关系相距较远的酵母中具有较 高的保守性【2 6 】。b i e r l i n g 等【2 7 】研究发现，c l r 2 也能影响r d n a 区基因沉默，它可能作用于 组蛋白去乙酰化酶的上游进而影响转录水平的基因沉默。 r n a i 是由双链r n a 启动的序列特异性的转录后基因沉默现象，在真核生物中普遍 存在，是生物体在进化中形成的一种内在基因表达的调控机制。芽殖酵母中目前尚未发 现l 酬a i 系统，有趣的是，裂殖酵母中存在类似于高等生物的r n a i 系统。在i a i 中有 多种酶参与，其中最关键的是双链r n a 特异性核酸内切酶( d s r n a s p e c i f i c e n d o n u c l e a s e d i c e r ) ，能特异性地结合并剪切d s r n a ，将d s r n a 裂解成小干扰r n a ( s m a l l i n t e r f e r e n c er n a 。s i r n a ) 。除d i c e r 之外，r n a l 衣赖性r n a 多聚酶( r n a d e p e n d e n tr n a p o l y m e r a s e ，r d r p ) 、a t p 和解旋酶等亦参与r n a i 作用。其作用过程包括三个阶段【2 8 3 3 】： ( 1 ) 启动阶段：长d s r n a 进入细胞后，首先被d i c e r 酶特异性地裂解成2 1 2 5 n t 的正义和反义序列的s i r n a 。s i i a 是r n a i 的中间效应子，序列结构与作用的靶m l 州a 具有同源性。 ( 2 ) 效应阶段：效应阶段是指s i r n a 可使细胞内的同源性m r n a 发牛有效地降 解，进而使相应的基因呈现表达抑制，形成转录后基冈沉默现象。这一过程是s i r n a 在解旋酶的作用下解链而形成正义链和反义链，其中的反义链可指导形成一种核蛋白复 合物，称之为i a 诱导的沉默复合体( r n a i n d u c e ds i i e n c i n gc o m p l e x ，砌s c ) 。刚s c 中结合的r n a 是s i r n a ，蛋白成分包括核酸内切酶、外切酶、解旋酶及同源r n a 链 搜索活性等。砌s c 在s i r n a 的引导下，序列特异性地剪切靶m r n a 中的s i r n a 互补 区。 ( 3 ) 倍增阶段：s i r n a 抑制基因表达具有倍增放大机制。s i r n a 一方面可引导s c 特异性剪切一源单链m r n a 使m r n a 降解，另一方面还可作为引物与靶向m r n a 结 合，在r d r p 的作用下合成新的d s r n a ，新合成的d s r n a 再次经d i c e r 酶切割，形成 新的0 、j a ，并作用于靶m r n a 。如此反复、倍增，从而抑制相应基因的表达，故少 6 前言 量s i r n a 就可高效触发基因干扰效应。 在裂殖酵母基因组中，d i c e r ( d c r l ) ，r n a 依赖的r n a 聚合酶( r d p l ) 和a r g o n a u t e ( a 9 0 1 ) 都只有一份拷贝，为异染色质装配所必需。其中r d p l 能够指导合成d s r n a ， 再由d c r l 加工形成s i 砌、j a 。砌t s ( r n a i n d u c e di n i t i a t i o no ft r a n s c r i p t i o n a lg e n e s i l e n c i n g ) 复合体由c h p l 、a g o l 、t a s 3 和s i r n a s 组成，它能够识别d n a 重复元件作为 异染色质装配靶点，聚集在染色质周围，通过c h p l 的染色质调节结构域与甲基化的 h 3 k 9 结合，促进r n a i 其它因子如r d p l 的结合，使得r n a i 机器作为异染色质的稳定成 分，介导异染色质的装配【3 4 】。v o l p e 等【3 5 】发现整合到着丝粒区的报道基因的表达总是被 抑制，称为“着丝粒沉默”( c e n t m m e r i cs i l e n c i n g ) ，它是由于着丝粒区核小体组蛋白h 3 k 9 甲基化后引起染色质凝集所致，并证明与r n a i 相关基因的缺失( 如卿脚，咖脚和 砌脚) 可以使组蛋白h 3 k 9 的甲基化水平消失，带来着丝粒沉默现象的消除。基于现 有的结果，人们认为在着丝粒区，d n a 条链连续表达合成r n a ，而另一条链则间断 表达，两条链的转录本互补形成双链r n a ( d o u b l es t r a n dr n a d s r n a ) 然后通过r n a i 机制形成s i r n a ，s i r n a 引导甲基转移酶c l r 4 到序列同源的着丝粒区，使组蛋白甲基化， 甲基化的组蛋白募集异染色质蛋白s w i 6 ，使它们在着丝粒区富集，最终导致染色质结构 改变，从而调节基凶活性【3 6 1 。 c a m 等【2 0 】发现刚t s 和r n a i 除了能够消除着丝粒区的基因沉默外，还能解除r d n a 沉 默，并且，r n a i 各组分的缺失突变体和c 咖列突变体还表现出r d n a 区的有丝分裂重组率 的显著增加。这就暗示了l a i 在r d n a 区的异染色质装配中的潜在功能，r n a i 促进了 r d n a 沉默，并对保持基因组r d n a 的稳定性和完整性起重要作用。目前r n a i 组分在调 控r d n a 沉默与抑制r d n a 区的同源重组中的具体细节还不清楚，但是上述这些结果暗示 了r d n a 沉默与r d n a 区的同源重组抑制是相互偶联的，这也为r d n a 沉默和抑制同源重 组为同一机制的两个不同结果的论断提供了又一有力证据。s u g i y 锄a 等【3 7 】报道了转录水 s f 沉默调节因子s h r e c 复合体直接或间接地参与了r d n a 区的基因沉默。与芽殖酵母相 比，裂殖酵母显示出该区域所受调控的复杂性和多样性。 7 * ； 1 3集缩素( c o n d e n s i n ) 1 3 1 羹缩素的组成 染色体集缩是有丝分裂细胞的一个主要事件【翊，发生于姐妹染色单体分离之前 依赖于d n a 拓扑异构酶i i 和集缩素0 9 删。d n a 拓扑异构酶i i 和集缩素正常行使功能是保 证染色体有效分离，细胞正常分裂产生有功能子细胞的关键。如果d n a 拓扑异构酶i i 和集缩素功能异常，就会导致染色体无法集缩，不能正常分离，而胞质分裂继续进行， 将细胞一分为二，出现所谓的“c u i ，的表型h ”。集缩素在进化上十分保守，从酵母、爪 蟾到哺乳动物细胞都有发现【4 l 。在裂殖酵母中，集缩素是由五个亚基组成的蛋白复台 体，包括两个s m c ( s 呻c 恤m j m a i n k n a n c eo f c h r o m o s o m e s ) 亚基( 图l5 ) ：c u t 3 ( 与芽 殖酵母s m c 4 同源) 和c u 1 4 ( 与芽殖酵母s m c 2 同源) ，以及三个非s m c 亚基：c n d l 、 c n d 2 和c n d 3 形成1 3 s 复台体觚州。s m c 蛋白在结构上十分保守，含有段很长的 c o i l 耐一c o i l 结构域和个带h i n 神的中央区域，n 和c 末端含有a _ 作用球状结构域，在 真核生物中以异源二聚体的形式结合其它非s m c 亚基。 、， _ f ，、： 鲁 图1 5 裂殖酵母集缩素装配假说 f i 9 1 _ 5 a h y p o t h 雌i s f o r c o n d e n s i na s 蛐b i y i 6 鹏i o y e 髂t m 前言 1 3 2 集缩素的功能 1 3 2 1 集缩素与染色体分离 有丝分裂过程中染色体的集缩依赖于集缩素，裂殖酵母集缩素五个亚基对于染色 体集缩都是必需的，并且对于细胞生存也都是必需的【4 5 1 。其温度敏感突变体( t e m p e r a t u r c s e n s i t i v em u t 锄t s ，t s ) ，在限制性温度条件下，有丝分裂细胞出现染色体集缩缺陷，染色 体异常分离m 4 5 删。目前，人们还不知道集缩素在裂殖酵母染色体集缩中的确切作用机 制，可能与d n a 拓扑结构的改变有关。 1 3 2 2 集缩素与d n a 复性( d n a 代n a t u r a t i o n ) s u t a n i 等【4 2 】研究发现裂殖酵母中集缩素c u t 3 和c u t l 4 两个亚基具有体外促进d i n a 复性反应的能力，即能够将单链d n a 转变成双螺旋d n a ，活性比来源于细菌的同类蛋 白r e c a 高7 0 倍，并且突变蛋白中此活性也表现出对温度敏感。由于这种复性能力具有 改变超螺旋的潜在能力，暗示了集缩素在改变d n a 高级结构从而影响染色体集缩方面 的功能。s a k a i 等【5 0 】发现，非s m c 亚基构成的三聚体可能在体内通过与s m c 异源二聚体 的结合调节s m c 复性单链d n a 的活性，从而在染色体集缩方面具有功能。 1 3 2 3 集缩素与d n a 修复 裂殖酵母集缩素非s m c 亚基c n d 2 ，与果蝇中的b a r r c n 【5 l 】蛋白和芽殖酵母中的 b m l 【5 2 】同源。s u t 锄i 等【4 5 】对于分离到的一个c 以2 a 啊甜( c 刀以一j ) 温度敏感型突变体进 行研究发现，该突变体无法修复辐射造成的d n a 损伤，也无法从羟基脲( h y d r o x y u r e a ， h u ) 造成的s 期滞留巾回复。c d s l 是一种间期检验点激酶，在羟基脲处理下其活性的 消失标志着间期缺陷，而这种缺陷在册以一j 突变体和带有集缩素其它亚基缺失的突变体 中都町以观察到。在没有羟基脲存在的限制性温度条件下，c 门以j 突变体出现了依赖于 c d s l 和a t m 类r a d 3 而不是c h k l 的g 2 期检验点滞留，先于有丝分裂染色体集缩缺陷。 c u t 3 和c u t l 4 的温度敏感突变体只表现有丝分裂缺陷，无间期缺陷，可能是由于c u t 3 和c u t l 4 突变位点位于c o i l e d c o i l 区只影响s m c 的成熟，而c 膨陀j 突变位点则影响了非 9 s m c 亚基与s m c 亚基球状结构域相互作用的伞酶复合体。这种间期和有丝分裂的缺陷 暗示了非s m c 亚基与s m c 亚基球状结构域相互作用产生了复合体全酶活性1 5 3 1 。c h e n 等 【5 4 】采用酵母双杂交方法筛选分离能够与c u t 3h i n g e 结构域有相互作用的潜在蛋白，发现 了c t 订( c u tt h r e e i n t e r a c t i n g1 ) 蛋白，它为细胞生存所必需，与人类c 1 d 同源，c 1 d 与 人类基因组d n a 紧密结合，能够激活d n a 蛋白激酶。c t 订是间期生长所必需的，有趣 的是，过量表达c t i l 能够拮抗册龙j 对温度、紫外辐射和羟基脲处理的敏感性。在羟基 脲处理下，c t 订在核染色质中积累，与染色质结合的量显著增加。它是第一个被发现能 与s m c 的h i n g e 结构域相互作用的蛋白，支持了集缩素在d n a 损伤中具修复功能的论断。 此外，它还能拮抗其它s m c 蛋白的t s 表型，似乎支持了c t 订的部分功能是上调 ( u p r e g u ia t e ) 集缩素全酶复合体。 1 3 2 4 集缩素与剂量补偿效应及基因沉默 许多物利- 以染色体依赖的方式决定性别，如哺乳动物中，含有y 染色体发育为雄性， 不带有y 染色体则发育为雌性。在线虫( 白p 即。砌a 6 咖括p 砌哪珊) 中，是通过计算x 染色 体的数目以剂量补偿的方式决定性别，x o 发育为雄性，x x 则发育为雌雄同体。剂量补 偿效应不仅决定了性别，也决定了x 染色体连锁基因的表达，因此在x x 的雌雄同体线 虫中，每条x 染色体 二基因的转录水平只有一半。这种剂量补偿效应复合体类似于爪蟾 中的1 3 s 集缩素复合体( 图1 6 ) 【5 5 1 。其中s m c 蛋白d p y - 2 7 和m i x 1 分别与x c a p c 和 x c a p e 相似( x c a p c 和x c 人p e 分别相当裂殖酵母的c u t 3 和c u t l 4 【4 5 】) 而d p y - 2 6 与 x c a p h( 与裂殖酵母c n d 2 序列高度同源【4 5 】) 有限地相似，d p y - 2 8 则很像x c a p d 2 ( 与裂殖酵母c n d l 序列高度同源【4 5 】) ，剂量补偿效应复合体中没有发现x c a p g ( 与