基于整合药理学策略的元胡止痛方研究进展

基于整合药理学策略的元胡止痛方研究进展 摘要中药方剂是中医临床治疗的主要形式和手段，探索中药方剂的化学物质实体与机体生命活动的交互规律，是中药研究的关键科学问题之一。目前，中药研究存在整体与局部脱节、宏观与微观脱节、体内过程与活性评价脱节，整合药理学的提出，为解决中药研究“碎片化”问题提供了一条切实可行的途径。近年来，该课题组采用整合药理学策略，对元胡止痛方进行了系统研究，建立了“化学指纹-代谢指纹-网络靶标”和“肠吸收-活性评价-数据挖掘”2个研究模式，从计算、体外和体内多个层次建立了该方剂的化学成分与生物活性之间的交互规律，为该方剂的质量控制、药效物质基础及其药理作用机制提供了依据，该文对相关研究进展进行综述。 关键词元胡止痛方;整合药理学;体内过程;活性评价;关联规律 Research of Yuanhu Zhitong prescription based on strategy of integrative pharmacology MA Yan， ZHANG Ying-chun， TAO Ye， CHEN Xiao-meng， WANG Peng， XU Hai-yu*， YANG Hong-jun* （Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China） AbstractChinese medicinal formulae （CMF） were usually used in the clinics of traditional Chinese medicines （TCM）， which were critical for modernization of Chinese medicine to shed light on the interaction between CMF and biological organisms. However， correlation between system and part， macroscopic actions and microcosmic mechanism， ADME process and pharmacologic actions were usually neglected. The put-forward of integrative pharmacology provided a feasible approach to solve the problem of the fragmentation of TCM. For the past years， we applied the strategy of integrative pharmacology to study Yuanhu Zhitong prescription（YZP） systematically， and established two modes， chemical fingerprints-metabolism fingerprints-network targets and intestinal absorption-activity evaluation-data mining， to establish the interaction rule between the chemical composition and biological activity from multiple levels， such as the calculation and in vitro/vivo， which provided proof for the quality control， pharmacodynamic material basis and pharmacological action of YZP. In this paper， we summarized the related progresses of the research of YZP. Key wordsYuanhu Zhitong prescription; integration pharmacology; ADME process; activity evaluation; association regularity doi：10.4268/cjcmm20150612 中药方剂是中医临床治疗的主要形式和手段，探索中药方剂的化学物质实体与机体生命活动的交互规律，是揭示中药方剂治疗原理、挖掘中医原创思维科学价值的基本路径，也是中药现代研究的关联科学问题。为此，本课题组提出了整合药理学的概念及其研究思路1-2，整合药理学是一门中药学、化学、药代动力学、药理学、计算科学等多学科融合的交叉学科，强调宏观与微观、整体与局部、体内ADME过程与活性评价、虚拟计算与实验验证的整合，旨在研究多成分药物与机体相互作用及其整合规律和作用原理，即从计算、体外、体内多成分多层次建立中药方剂“化学成分群-ADME过程-生物活性”之间关联并对其结果进行整合，避免当前研究“碎片化现象”，从而有利于中药的现代化和国际化。 近年来，本课题组以元胡止痛方为范例，采用整合药理学研究策略，建立 “化学指纹-代谢指纹-网络药理学”和“肠吸收-活性评价-数据挖掘”2个研究模式，从体内和体外2个层次，定性、定量地描述成分与活性之间的关联，并深入解析元胡止痛方的物质基础移行规律、多靶点整合作用机制、多成分组合与药效活性的关联关系，实现基于活性成分的质量控制、临床适应症的优化，具有较强的理论和实践意义（图1）。 1元胡止痛方的中医概述及其问题分析 元胡止痛方（片）是临床常用中成药，其疗效确切，为中国药典2010年版3收载品种，并收载于国家第一批非处方药目录、国家中药保护品种和国家基本药物目录等。由延胡索（醋制）与白芷2味中药组成，主要功能为理气、活血、止痛，临床主要用于气滞血瘀引起的胃痛、胁痛、头痛及痛经等。中医学认为该方剂通过理气、活血的作用从根本上治疗气滞血瘀证，同时其止痛作用减轻患者的疼痛，对气滞血瘀引起的疼痛具有标本兼治的作用。方中延胡索为君药， 味辛、苦、性温，归肝、脾经，具有活血散瘀、理气止痛之功效;白芷性温，气芳香，味辛、微苦，归胃、肠、肺经，具有散风除湿、通窍镇痛、消肿排脓之功效，用于治疗感冒头痛、眉棱骨痛、鼻渊等，特别是阳明经头痛。此外，白芷作为风药，善用之不仅可用于外感，与行气止痛药延胡索联用有助于“肝主疏泄”功能的恢复，有效地针对偏头痛产生的病机，即气机升降失常引起的脑之络脉失和，气血逆乱。使脉络调和，气血条畅，消除气滞血瘀证产生的根源，从而治疗疾病以求“本”。2药相使配伍，增强元胡止痛效应缓解病情以治“标”。本课题组已通过文献总结，对该方剂治疗偏头痛进行“病证-方药-成分-活性”关联性探讨分析4。 目前，元胡止痛方在以下2个方面受到广泛的关注。质量评价：现在该方剂在市场上有片剂、胶囊剂、丸剂等，260余家药厂具有该药的生产批文，如何保持该产品的质量稳定性;该产品的临床适应症重新定位：临床上，该产品用于气滞血瘀型的胃痛、胁痛、头痛及痛经等，从现代医学角度，其治疗病症过于宽泛，如何对其进行临床重新定位，提高临床疗效。针对这2个问题，本课题组应用整合药理学研究策略，通过“化学指纹-代谢指纹-网络药理学”和“肠吸收-活性评价-数据挖掘”2个研究模式进行有效成分辨识和作用机制的探讨。 2基于“化学指纹-代谢指纹-网络靶标”三维模式的元胡止痛方的成分群与活性质检关联性研究 近年来，系统生物学和网络药理学从整体角度观测机体疾病发生、发展以及药物治疗的分子机制，被广泛应用到中医药研究，中药方剂的复杂性，在体内经过ADME过程达到靶器官、靶组织、靶分子而发挥疗效。为此，本课题组提出了基于体内ADME过程与网络药理学的中药现代研究思路1，即通过“化学指纹-代谢指纹-网络靶标”三维模式的进行中药方剂的成分群与活性之间关联性研究。围绕元胡止痛方，采用试验与计算相结合策略，即干湿结合，定性地描述该方剂“化学指纹-代谢指纹-网络靶标”之间的关联，使该体系具有系统性与全面性。 2.1化学指纹研究延胡索的主成分为以叔胺、季胺类为主的生物碱如延胡索甲素、乙素、丑素等5，还含有大量的淀粉，少量黏液质、多糖6、树脂、挥发油、无机微量元素，以及亚油酸、亚麻酸、延胡索酸等物质7;白芷的主要化学成分为挥发油和香豆素类，香豆素主要有氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、白当归素、白当归脑等8;挥发油以十八碳醇、甲基环硅烷、正十二醇、十四碳烯、环十二烷等为主，还有佛手酚、棕榈酸、豆甾醇、-胡萝卜苷等水溶性成分9。目前元胡止痛方制剂（包括元胡止痛片、元胡止痛胶囊、元胡止痛滴丸等）的质量控制主要使用HPLC，UPLC，RP-HPLC，毛细管电泳等方法测定其中延胡索乙素、欧前胡素、异欧前胡素等单个或几个成分的含量10-13。 在前期基础上，本课题组进行元胡止痛方的化学指纹图谱和多指标含量测定研究。张迎春等14首次用超高效液相串联四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）分析6个不同厂家15个批次的元胡止痛片，建立17个峰18个化学成分的指纹图谱，并罗列出15个常见的成分，分别为原阿片碱、-别隐品碱、黄连碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、紫堇碱、巴马汀、黄连素、白当归脑、去氢紫堇碱、氧化前胡素、欧前胡素、珊瑚菜内酯、异欧前胡素、蛇床子素。以共有峰面积进行聚类分析，结果表明，来源于同一个厂家不同批次的样品聚为一类，不同厂家的产品可聚在不同类别。另外，进行元胡止痛片的多指标含量测定研究15，通过RRLC-QQQ，在9 min内快速鉴定和定量分析元胡止痛片中17个活性成分，分别为东莨菪内酯、原阿片碱、-别隐品碱、延胡索乙素、黄连碱、四氢小檗碱、紫堇碱、小檗碱、白当归脑、白当归素、花椒毒素、佛手柑内酯、茴芹内酯、氧化前胡素、欧前胡素、蛇床子素和异欧前胡素，所建立的分析方法具有较高的灵敏度和准确度。并对15个批次的样品进行分析，以17个化合物的含量进行聚类分析，结果与元胡止痛方指纹图谱研究一致。所以，从化学质量控制，可以区分不同厂家的产品，保持产品的稳定性，但是难以判断产品质量的好坏与优劣。需要指出的是，研究还发现各批次元胡止痛片中延胡索乙素的含量均符合标准，但其他成分的含量差异较大，从另一侧面反映出传统质量标准以单一成分含量质控中药材或中药复方的弊端。由此可见，后期还需要进行生物活性评价研究，特别是通过数据建模的方法构建成分与活性之间的关联，为包括元胡止痛片在内的中药复方质量控制的标准提供新的依据和思路。 2.2代谢指纹研究中药方剂主要是口服制剂，在体内经过胃肠道菌群代谢、吸收、分布、代谢和排泄过程（ADME 过程），到达靶标器官、靶组织，与分子靶标网络相互作用而发挥治疗作用，开展体内代谢研究十分重要。在吸收方面，通过RRLC-Q-TOF对12批次元胡止痛片进行吸收指纹研究，获得34个共有峰，并且对其中17个成分进行定量研究，获得了17个成分的吸收量-时间曲线，计算成分的吸收率，通过吸收动力学探讨成分的吸收机制，其中延胡素乙素、白当归脑和白当归素3个成分存在明显的主动吸收机制16-17。在血清药物化学研究方面，陶野等18应用RRLC-ESI-Q-TOF技术识别口服元胡止痛方提取物后的移行成分， 21个入血成分和17个入脑脊液成分，通过比对对照品及推测确证其中的16个入血成分和12个入脑脊液成分（表1），表明某些原型成分或代谢产物能吸收入血并透过血脑屏障而发挥药效。同时考察了复方中含量较高的3个单体化合物口服给药后的代谢产物，结果显示延胡索乙素分别通过2次脱甲基化作用、脱甲基化并羟基化作用、羟基化并脱甲基化作用代谢成6个代谢产物;原阿片碱通过脱甲基化和羟基化作用代谢成2个产物;紫堇碱分别通过羟基化并酮化、羟基化并脱水作用产生5个代谢产物，这些代谢物均可在口服复方提取物的血浆样本中被检测到。同时，通过RRLC-ESI-Q-TOF建立了原阿片碱、-别隐碱、延胡索乙素、紫堇碱、四氢小檗碱和白当归素这6个成分的体内分析方法，并在大鼠体内进行体内药代动力学研究，获得相关药代动力学参数， 该6个成分的Tmax在3.55.0 h，达峰浓度Cmax在214.6858.3 g?L-1。 黄斌等28应用此方法对元胡止痛方不同时间点的肠吸收液进行血管舒张活性评价，结果表明，随着吸收时间的延长，化学成分的含量增加，其活性也明显增强，存在显著的量-效关系和时-效关系。此外，许海玉等16搜集5个厂家共12批元胡止痛片，用RRLC-Q-TOF-MS获得含药肠吸收液的成分库并构建其肠吸收液指纹图谱，分别考察这12批次元胡止痛片肠吸收液对胸主动脉血管舒张活性，一方面，化学成分分析结果表明同一厂家的产品能聚为同一类，而不同厂家的产品往往不能，所以成分分析能用于区分不同厂家的产品，评价产品质量稳定性等;另一方面，活性评价结果表明化学成分相似度高的产品，血管活性比较接近，化学成分相差比较大的产品其活性也相差较大，活性评价结果可能为产品质量好与坏以及产品等级划分等提供依据。该研究为元胡止痛方制剂的质量控制提供新的依据，也为中药复方基于某一药效的质量评价提供新的思路。 3.2数据挖掘建立成分与活性之间关联中药有效成分群和活性之间关联性研究，即中药“组效关系”，是中药的关键问题和难点问题之一29。中药数据具有多目标、离散性、非线性和小样本这4 个主要特点，因此，常规数学建模方法（方差分析、线性相关法、多元线性回归等）难以进行有效的构建，现常用于中药方剂成分与活性之间关联性研究的数据挖掘方法有关联规则30、人工神经网络31、LARS回归32、灰色关联分析33等。其中基于熵的神经网络方法克服了传统神经网络方法对小样本过拟合的缺陷，LARS 回归方法对于离散型和小样本的数据求解优于传统的多元线性回归方法。 在元胡止痛方的吸收成分与血管活性之间关联性建立时，采用灰色关联分析，该方法能通过对灰色系统中有限数据序列的分析，寻求系统内部诸因素之间的关系，挖掘出其中的隐性规律。采用灰色关联分析建立元胡止痛方中34个吸收成分与血管舒张活性之间关联，该模型建立时平均偏差率为9.81%，对未知样品预测时的平均偏差率为4.16%，说明该模型具有较好的准确度，其中GRG0.85的成分为7 个，被认为关键药效成分，并对其中2个成分（原阿片碱、别隐品碱）开展了相关试验验证，证实具有舒张血管活性16。并在网络靶标预测中25，这2个成分能潜在作用于Ca2+通道，其舒张血管作用可能与此有关联，但仍需进一步验证。另外，邓瑞选取不同产地川白芷并构建其指纹图谱，采用分光光度法测定PLA2水解底物产生游离脂肪酸的量，间接反映药物对PLA2活性的影响，通过对数据进行灰色关联分析，挖掘川白芷中多种香豆素抑制PLA2生物效应强弱34。 综上所述，以整合药理学策略为基础，从“化学指纹-代谢指纹-网络靶标”、“肠吸收-活性评价-数据挖掘”2个方面入手，定性、定量地描述元胡止痛方成分与药理活性之间的关联，辨识其成分库（表1，图2）以及验证药理活性，并从中可推断，元胡止痛方中部分原型成分，如原阿片碱、-别隐品碱、四氢小檗碱、紫堇碱、小檗碱、脱氢紫堇碱等多为延胡索生物碱成分，可直接经肠道吸收、入血并透过血脑屏障;另外，在体内检出的非原型成分，如白当归素、补骨脂素等多为白芷中香豆素类化合物，说明该类成分可能通过体内代谢转化过程而发挥药效。 4配伍及其协同作用研究 元胡止痛方中延胡索为君药，与白芷相使配伍，增强药理效应。在小鼠的醋酸扭体试验和热板试验中，朱央央等35发现单味延胡索提取物和单味白芷提取物均有较好的镇痛效果，但复方醇提物的镇痛效果更好;以延胡索乙素的高低作为镇痛活性的标准，研究者将总生物碱、总香豆素、挥发油分别配伍给药，发现香豆素和（或）挥发油能增强血浆中dl-THP的浓度且与镇痛效应成正比例关系36;另外，在不同部位，挥发油与延胡索乙素在吸收和分布等方面均存在协同作用37-38。但是，到目前为止，元胡止痛方的配伍增效及其分子机制尚不清楚，有待于进一步研究。 5展望 纵观元胡止痛方的研究现状，整合计算预测与试验验证，整合体内过程与体外活性，从计算、整体、组织、靶分子等水平上阐释元胡止痛方的化学成分及体内ADME过程、分子生物网络和药理效应。同时本文还强调元胡止痛方中各类成分的体内协同作用。但目前的研究仍比较基础，今后可延续整合药理学的策略，即将体内药代动力学与药效学评价相结合，加强多组学融合和数据挖掘，建立药代标志物与生物标志物之间组效关系，构建多成分的PK-PD模型。 中药方剂的研究可以借鉴元胡止痛方基于“化学指纹-代谢指纹-分子网络-活性评价”的模式，基于整合药理学的策略，从计算层次、体外试验层次和整体动物水平上，实现多学科、多层次、多环节的整合，系统而全面地揭示中药方剂的物质基础及其药理效应，为中药的质量评价、药效物质基础、临床应用及中药新药开发等提供思路，促进中药的现代化和国际化。 参考文献 1许海玉，黄璐琦，卢鹏，等.基于体内ADME过程和网络药理学的中药现代研究思路J.中国中药杂志，2012，37（2）：142. 2许海玉，杨洪军.整合药理学：中药现代研究新模式J.中国中药杂志，2014，39（3）：357. 3中国药典S. 2010：525. 4陶野，杨洪军，林朔，等. 元胡止痛方“病证-方药-成分-活性”关联性探讨J. 世界科学技术中医药现代化，2012，14（5）：2054. 5金国章.中药延胡索研究中的新发现M.上海：上海科学技术出版社，2001：6. 6Tao Y W， Tian G Y. Studies on the physicochemical properties， structure and antitumor activity of polysaccharide YhPS-1 from the root of Corydalis yanhusuo WangJ. Chin J Chem， 2006， 24（2）： 235. 7贺凯，高建莉，赵光树.延胡索化学成分、药理作用及质量控制研究进展J.中草药，2007，38（12）：1909. 8周爱华，李强，雷海民.白芷化学成分研究J.中草药，2010，41（7）：1081. 9卢嘉，金丽，金永生，等.中药杭白芷化学成分的研究J.第二军医大学学报，2007，28（3）：294. 10柯仲成，程子洋.HPLC法测定元胡止痛栓中延胡索乙素含量J.辽宁中医药大学学报，2013，15（3）：47. 11何丹，杨林，张景京.UPLC法测定元胡止痛胶囊中欧前胡素和异欧前胡素的含量J.分析试验室，2013，32（10）：87. 12朱央央，余伯阳.RP-HPLC测定元胡止痛方中延胡索乙素和欧前胡素的含量J.中成药，2004，26（6）：455. 13魏惠珍，饶毅，王义明，等.毛细管电泳法测定元胡止痛片和元胡止痛口服液中延胡索乙素的含量J.药物分析杂志，2002，22（4）：2724. 14Xu H Y， Zhang Y C， Tao Y， et al. Study of chemical fingerprint for Yuanhu Zhitong tablet by UPLC/Q-TOF-MS J. J Liq Chromatogr Relat Technol， 2012， 36：807. 15Zhang Y， Xu H， Chen X， et al. Simultaneous quantification of 17 constituents from Yuanhu Zhitong tablet using rapid resolution liquid chromatography coupled with a triple quadrupole electrospray tandem mass spectrometryJ. J Pharma Biomed Anal， 2011， 56： 497. 16Xu H Y， Li K， Chen Y J， et al. Study on the absorbed fingerprint-efficacy of Yuanhu Zhitong tablet based on chemical analysis， vasorelaxation evaluation and data miningJ.PLoS ONE， 2013， 8（12）： e81135. 17Zhang Y， Xu H， Chen X， et al. Study on the application of intestinal absorption in vitro coupled with bioactivity assessment in Yuanhu Zhitong preparationJ. J Med Plants Res， 2012， 6（10）：1941. 18Tao Y， Xu H Y， Wang S S， et al. Identification of the absorbed constituents after oral administration of Yuanhu Zhitong prescription extract and its pharmacokinetic study by rapid resolution liquid chromatography/quadrupole time-of-flight J. J Chromatogr B， 2013，935：1. 19Hopkins A L.Network pharmacology：the next paradigm in drug discoveryJ. Nat Chem Biol，2008，4：682. 20Hopkins A L. Network pharmacologyJ. Nat Bioteeh， 2007，25： 1110. 21刘建林，彭成，潘媛，等.元胡止痛胶囊对偏头痛模型大鼠的影响J.中药药理与临床，2013，29（4）：11. 22陈岳涛，曹蔚，谢艳华，等.元胡止痛片及其主要成分对大鼠实验性痛经的影响J.陕西中医，2013，34（1）：111. 23龙全江，徐雪琴，王晓阁.延胡索化学成分、药理作用与产地加工技术研究概况J.甘肃中医学院学报，2014，31（5）：78. 24朱艺欣，李宝莉，马宏胜，等.白芷的有效成分提取、药理作用及临床应用研究进展J.中国医药导报，2014，11（31）：159. 25Xu H Y， Tao Y， Lu P， et al. A computational drug-target network for Yuanhu Zhitong prescriptionJ. Evid Based Complement Alternat Med， 2013， doi： 10.1155/2013/658531. 26Li T J， Wang S， Meng X S， et al. Metabolomics coupled with multiv