（基础兽医学专业论文）高产胞外多糖乳酸菌的筛选及培养基优化方法的研究.pdf

河南农业大学2 0 0 9 年硕士学位论文 摘要 乳酸菌胞外多糖( l a c t i ca c i db a c t e r i ae x o p o l y s a c c h a r i d el a be p s ) 是乳酸菌在生长代谢 过程中分泌到细胞壁外常渗于培养基的一类多糖类化合物，分为荚膜多糖与粘液多糖，是微 生物代谢次产物，分子量多在4 0 1 0 4 6 0 x1 0 6 i ) a 。l a be p s 具有增加酸乳的粘度、流变 性、防止乳清析出、增强凝乳强度、改善酸乳品质等特性。因此研究l a be p s 具有重要的 理论意义和实践意义。 本课题主要以市售酸奶、泡菜为研究对象，经过乳酸菌的筛选、分离、鉴定共得到8 株杆菌，4 株球菌。应用形态学特征、生理生化特征以及糖发酵试验等方法鉴定，结合伯 杰氏细菌鉴定手册和乳酸菌分类鉴定，将菌株鉴定为乳杆菌属( 其中德式乳杆菌保加 利亚亚种( l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i is u b s p , b u l g a r i c u s ) 2 株，嗜酸乳杆菌( l a c t o b a c i l u s a c i d o p h i l u s ) 3 株，植物乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ) 3 株；) 和乳球菌属( 其中嗜 热链球菌( & t h e r m o p h i l u s ) 3 株，乳酸乳球菌乳脂亚种( 巴l a c t i ss u b s p c r e m o r i s ) l 株。) ，共2 个属5 个种。通过苯酚一硫酸法检测鉴定菌株发酵液中的胞外多糖的产量，测 定培养基的粘度，进一步筛选得到胞外多糖产量高的g 1 德式乳杆菌保加利亚亚种，对其进 行培养基优化试验。 在优化培养基时，分别对碳源、氮源、碳氮比进行单因素水平优化。其中以葡萄糖作为 碳源g 1 菌株e p s 产量最高，可达1 3 6 5 8 m g l ，培养基粘度为2 6 8 5 7 m p a ，s ；以胰蛋白胨作 为氮源时g l 菌株e p s 产量最高，可达1 4 0 3 m g l ，培养基粘度为2 7 1 7 9 m p a s ，；碳氮比为 3 - 1 时，胞外多糖产量最高，可达1 3 7 2 4 m g l ，培养基粘度为2 7 1 7 9 m p a s 。 在单因素优化水平的基础上对影响e p s 产量的培养温度、培养时间、初始p h 值以及葡 萄糖添加量进行四因素三水平正交实验。结果表明：培养时间为1 7 h 、培养温度3 3 ，初始 p h 值为6 0 ，葡萄糖添加量为3 的发酵条件为g l 菌株产胞外多糖量的最佳发酵工艺条件， e p s 产量可达1 2 6 7 6 m g l ；其中培养温度对g 1 菌株胞外多糖的产量影响最大，其次为初始 p h 值，葡萄糖的添加量对g 1 菌株胞外多糖的产量影响最小。 为了避免培养温度、培养时间以及初始p h 值三种主要因素的交互作用，运用响应面法 进行b o x - b e h n k e n 设计优化分析。优化的结果为；培养温度为3 9 1 ，培养时间1 4 2 h 初 始p h 值6 9 ，e p s 产量可达1 5 4 2 5 m g l ，优化后g l 德式乳杆菌保加利亚亚种e p s 产率提高 1 7 8 。 关键词：乳酸菌；胞外多糖；分离鉴定；条件优化；响应面法； 河南农业大学2 0 0 9 年硕士学位论文 s c r e e n i n go fh i g he x o p o i y s a c c h a r i d e s p r o d u c i n g l a c t i ca c i db a c t e r i aa n ds t u d i e do p t i m i z a t i o no fm e d i u m s u p e r v i s o r ：r e s e a r c h e r l iw e n x i a n m a s t e rc a n d i d a t e ：l i uy a n a b s t r a c t ：l a c t i ca c i db a c t e r i u me x o p o l y s a c c h a r i d e si sp r o d u c e dw i t hl a c t i ca c i d b a c t e r i ag r o w i n ga n dp e n e t r a t e si n t oc u l t u r em e d i u m i ti sa m y l o s ec o m p o u n do f s u b m e t a b o l i s ma n dd i v i d e di n t oc a p s u l ea n dm u c u sa m y l o s e t h em o l e c u l a rw e i g h t o f e x o p o l y s a c e h a r i d e si sb e t w e e n4 0 x 10 4a n d6 0 x1 0 6 d a l a e ta c i db a c t e r i a e x o p o l y s a c c h a r i d e sh a ss o m ec h a r a c t e r i s t i c so fe n h a n c i n gy o g h u r tv i s c o s i t ya n d r h e o l o g y , p r o h i b i t i n gw h e yl o s s ，i m p r o v i n gy o g h u r tt a s t ea n di n c r e a s i n ge l a b b e r i n t e n s i t y i ti sv e r ym e a n i n go f t h e o r ya n dp r a c t i c et os t u d y i n gl a b e p s t w e l v es t r a i n sw e r eo b t a i n e db y s c e e n i n g ，i s o l a t ea n di d e n t i f yl a c t i ca c i d b a c t e r i u mf r o my o g h u r ta n ds a u e r k r a u tf r o mm a r k e t b a s e do nr e s u l t so ft h e c h a r a c t e r i s t i c so f m o r p h o l o g y ，p h y s i o l o g ya n db i o c h e m i s t r y , s u g a rf e r m e n t a t i o n ，w e w e r ea s c r i b e dt o2g e n u so fl a e t o b a c i l l u s ，l a c t o c o c c u s ，c o n t a i n i n gw i t h5s p e c i e s a c c o r d i n gt ob e r g y sb a c t e r i a li d e n t i f i c a t i o nm a n u a la n dc l a s s i f i e di d e n t i f i c a t i o no f l a c t i ca c i db a c t e r i u m ( 2s t r a i n sa r el a e t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i is u b s p b u l g a r i e u s ，3s t r a i n sa r e l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ，3s t r a i n sa r el a e t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ) ；( s t r a i n sa r es t h e r m o p h i l u s ，ls t r a i ni sl c l a c t i ss u b s p c r e m o r i s ) b yu s i n gt h em e t h o do f p h e n o l h 2 s 0 4t od e t e c tt h ea m o u n to fe x o p o l y s a c c h a r i d e si nc u l t u r em e d i u m ，a sw e l l a st h ev i s c o s i t yo ft h em e d i u m ，w es c r e e n i n go u to fa h i g h e ry i e l do f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d es t r a i n s ，n a m e l yg 1t e s tf o rm e d i u m o p t i m i z a t i o n w es t u d i e dt h ec a r b o n ，n i t r o g e n ，c a r b o na n dn i t r o g e nr a t i oi nt h em e d i u mt o i n f l u e n c i n gt h ey i e l do fe x o p o l y s a c c a r i d e so f0 1w h e nw eo p t i m i z a t et h em e d i u m t h es t r a i n sh a v eah i g h e s ty i e l do fe p sa b o u t1 3 6 5 8 m g l ，v i s c o s i t ya b o u t 2 6 8 5 7 m p a sw h e ng l u c o s ea st h ec a r b o ns o u r c e ；t h es t r a i nl a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u s m a x i m u mv i s c o s i t yo ff e r m e n t a t i o nm e d i u ma b o u t2 71 7 9 m p a sw h e nt r y p t o n ea sa n i t r o g e ns o u r c e ，a sw e l la st h ec o n t e no fe p sa t t a i n t 14 0 3 m g l ；t h es t r a i n so f l a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u se x t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d ep r o d u c t i o ni nt h eh i g h e s t ，u pt o 13 7 2 4 m g | l 。v i s c o s i t ya b o u t2 71 。7 9 m p a 。sw h e nc a r b o na n dn i t r o g e nr a t i oi s3 ：1 w ed e p l o y e do r t h o g o n a le x p e r i m e n tt oo p t i m i z i n gt h ei n f l u e n c i n gf a c t o ro fe p s p r o d u c t i o ni n c l u d et e m p e r a t u r e ，i n c u b a t i o nt i m e ，i n i t i a lp hv a v u l ea n dt h ea m o u n to f g l u c o s ei nt h em e d i u m ，a n dt od e t e r m i n et h ei m p a c to fm a j o rf a c t o r s r e s u l ts h o w e d ：i t 河南农业大学2 0 0 9 年硕士学位论文 i st h eb e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rt h el a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u st op r o d u c i n ge p s t h a tc u l t i v a t et e m p e r a t u r ei s4 0 ，f e r m e n t a t i o n17h o u r s ，t h ei n i t i a lp h6 0 ，3 o fi t s a d d i n gg l u c o s e ，ay i e l d o fe p sa b o u t l 3 8 7 6 m g l ；c u l t i v a t et e m p e r a t u r ei st h em o s t i m p a c tt op r o d u c i n ge p so fl a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u s ，f o l l o w e db yc u l t u r e t i m e ，w h i l e t h ea m o u n to fg l u c o s eh a dt h el e a s ti m p a c tt oy i e l do fe p s 。 i no r d e rt oa v o i dt h ei n t e r a c t i o no fc u l t i v a t et e m p e r a t u r e ，t i m ea n di n i t i a lp h ，w e u s e db o x b e h n k e nd e s i g na n dr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i st oo p t i m i z a t i o nt h e c u l t i v a t i o nc o n d i t i o n t h er e s u l ti n d i c a t e st h a tt e m p e r a t u r ec u l t i v a t e3 9 1 。c u l t u r e t i m e1 4 。2 h ，t h ei n i t i a lp hv a l u eo f6 9 ，t h ey i e l do fe p so fl a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i i s u b s p b u l g a r i e u si s1 5 4 2 5 m g l , t h ey i e l do fe p se l e v a t e11 2 a f t e ro p t i m i z a t i o n k e y w o r d s ：l a c t i ca c i db a c t e r i a ，e x o p o l y s a c c h a r i d e s ，i d e n t i f ya n di s o l a t e ，c o n d i t i o n so f o p t i m i z a t i o n ，r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y 4 5 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 高产胞外多糖乳酸菌的筛选及培养基优 学位 硕士 文题目 化方法的研究级别 学生 刘燕 学科 基础兽医学 导师 李文献 姓名专业姓名 学位论文 否 如需保密，解密时间年月 日 是否保密 研究生签名：亩i 鬃、导师签名：f 尹 日期：砂7 年护6 月日日期：弘哆牮6 月f 日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本 和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发 表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离开 河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单位为 河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农业大学 所有，否则，承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。i 三_ 习 研究生签名：书f 抵导师签名：首吖学院领导签名；霉要璺二f 日期孔叼垒f o g 旁念日日期：沙释彰均世日 日期：年l 月日 致谢 本研究是在导师李文献研究员的悉心指导下完成的。导师在论文 的选题、试验方案、试验设计等过程中，无不倾注了大量的心血和智 慧。三年来，导师在学习、工作和生活上无微不至的关怀，让我终生 难忘；导师渊博的知识，丰富的经历，严谨的治学态度，高屋建瓴的 科学思维和勇于开拓及敬业精神使我受益匪浅。在论文付梓之际，谨 向恩师致以最崇高的敬意和衷心的感谢! 衷心感谢河南花花牛乳业有限公司研发部王少武经理以第二导 师的身份给于的无微不至的指导和关怀! 衷心感谢河南花花牛乳业有限公司研发部李红工程师在论文试 验过程中给于的帮助与指导! 衷心感谢河南花花牛乳业有限公司研发部的李永军、马伟华、张 伟丽、周霞、冯利青提出宝贵的建议! 感谢同级硕士研究生张志强、刘涛、李平、贾海丽、王静、臧猛、 武宇晓、台玉磊、晁立刚、武波波等在试验和生活中给予的大力帮助。 另外研究生处及牧医工程学院的各位领导、老师三年来对我学习 和生活给于的关怀，在此一同深表谢意! 最后，特别感谢我的家人的理解和支持，他们的支持和鼓励，使 我得以专心地学习，也是我成长和进步的动力! 谨以此文献给所有关心和爱护我的老师、同学、朋友和家人! 河南农业大学2 0 0 9 年硕士学位论文 1 文献综述 1 1 乳酸菌胞外多糖( l a c t i ca c i db a c t e r i ae x o p o i y s a c c h a r j d el a be p s ) 简介 乳酸菌是历史悠久的工业生产菌，被广泛用于乳制品、蔬菜和肉类制品的加工，尤其 在各种酸乳和干酪等发酵乳制品生产中，对其风味、质构和提高产品的营养保健特性发挥着 极其重要的作用，这些功能主要是通过其代谢过程中形成的e p s 物质来完成的l i j 。 l a be p s 是乳酸菌在合成代谢过程中分泌到细胞外常渗于培养基的一类糖类化合物， 有的依附于微生物细胞壁形成荚膜，成为荚膜多糖；有的进入培养基形成粘液，成为粘液多 糖【3 l ，它们都是微生物代谢次产物，分子量多在4 0 1 0 6 o 1 0 6 之间。乳品专家a y t a m i m e 认为，要生产出风味和稳定性好的高质量酸乳，分解代谢不是成功发酵的唯一重要因素，合 成代谢途径在形成有利于改善酸乳质构和人体健康作用的多糖及其他化合物中。起到重要作 用t 4 。l a be p s 可赋予发酵乳制品特殊的质构和风味，起到食品添加剂的作用，而广泛被用 于各种食品的增稠、稳定、乳化、胶凝及持水【5 】；胞外多糖还具有生物活性如免疫活性、抗 肿瘤和抗溃疡，可应用于医药领域，因此研究l a be p s 具有重要的理论意义和实践意义。 1 2 乳酸菌e p s 的分类、化学组成和结构 1 2 1 乳酸菌胞外多糖的分类 来自乳酸菌的胞外多糖( e p s ) 按合成位点和合成模式不同可以分为硬类：同源多糖和 异源多糖。( 1 ) 同源多糖：含有四个亚基，即( a ) a - d 葡聚糖，主要由葡萄糖残基以酗l ， 6 键连接，同时在3 位有不同程度的分支，在2 位和4 位很少有分支：( b ) b d - 葡聚糖， 由葡萄糖以8 - 1 ，2 键形成分支；( c ) 果聚糖，主要由以1 3 - 2 ，6 键连接的d 一果糖分子组成； ( d ) 其他的，像聚半乳糖，它是由结构一致的重复单体以不同的糖苷键连接组成的h 。( 2 ) 异源多糖：由嗜温和嗜热链球菌乳酸菌所产生，重复单元主要含有d 一葡萄糖、d - 半乳糖、 l 鼠李糖、甘露糖等，有些含有n _ 乙酰葡粮胺，卜乙酰半乳糖胺，或者葡糖醛酸哺1 。 1 2 2 乳酸菌胞外多糖的化学组成 长期以来研究者对l a be p s 化学组成未达成一致。s u n d m a n m l 和n i1 s s o n h l 两人首先研 究了这种粘性物质的本质，发现它是一种蛋白质样的物质，后来一些作者提出在乳发酵过程 中产生的粘性特征是由于产生了糖蛋白或碳水化合物一蛋白质的复杂化合物的结果阻m 1 。另 外一些人从碳水化合物富集的发酵液中经进一步分离纯化得到了胞外聚合物。最后研究者认 为，从l a b 中分离得到的胞外聚合物是a 一和b 一连接的糖重复单元所组成的多糖，并且这 些聚合物有很多不同的类型。然而每个单体的组成似乎是相似的，一般都含有d - 半乳糖， d 一葡萄糖和l - 鼠李糖，但比例不一样。& h e 脚o p h j u sb t c 和& t h e 册o p h i l u s4 8 0 产生的 胞外多糖不含鼠李糖，l b p a r a c a s e j3 4 - 1 的e p s 只含有半乳糖，其他的残基，像s n 一甘油 一3 一磷酸、n - 乙酰一氨基糖和磷酸基、乙酰基也会出现。 e p s 较难分离和纯化，特别是当用复杂的培养基时，一种菌株可能不止分泌一种多糖， 2 河南农业大学2 0 0 9 年硕士学位论文 也许可以解释过去观察到的一部分多糖的化学组成有矛盾。例如，g r o b b e n 等人研究了用不 同的发酵条件和分离技术从同一菌株得到不同的化学组成的胞外多糖。m a r s h a l l 等人分离 得到两种不同的e p s ，它们的单糖组成和分子量都不相同。从德式乳杆菌保加利亚亚种 ( 扛d e l b r u e c k i is u b s p b u l g a r i c u s ) 和嗜热链球菌( 置t h e n s o p h i l u s ) 的同一株菌株中 分离得到了低分子量和高分子量两种e p s ，但是它们的单糖组成是相同的。因此培养基和发 酵条件可能只是影响单糖组成和糖苷键变化的各种因素之一u 。 1 2 3 乳酸菌胞外多糖的结构 乳酸菌胞外多糖( e p s ) 的分子量在4 0 x1 0 4 到6 0 1 0 6 d a 之间。分子量是决定e p s 功 能的一个因素。然而多糖在溶液中的物理学和流变学特性却与其三维结构和空间构象密切相 关。同时，除了分子形状，也有其他因素，像形成分子间相互连接的势能，可能对完全理解 它的溶液行为更为重要，因为多糖分子的长链要进行拓扑学的重新安排，从无序的随意缠绕 到形成有利于分子间的相互作用和缔合的更有序的构象。 多糖的二级和三级构象主要取决于它的基本化学( 一级) 结构，相关的一级结构的微小 变化就可能对它的构象和多糖的特性产生巨大的影响。一种乳酸菌异源多糖( 由 sh e r m o p h i l u s 产生) 的重复单体的结构首先被d o c o 等人鉴定出来，其它含有支链的乳酸 菌e p s 的重复单体的结构最近已经通过酸水解、甲基化分析、高碘酸盐氧化、乙酰解、酶分 解、s m i t h 降解、1 d 和2 d h - n m r 光谱等方法阐明。重复单元大多是从双糖到七糖变化。但是， 从已知的基本单元的结构中没有发现共同的特征，这就给研究e p s 的结构和质地的特性之间 的关系带来了问题。一些酶对多糖的结构有专一的作用，可以用来裁剪多糖分子的化学结构， 从而改变其化学性质。 1 3 乳酸菌胞外多糖的生物合成机理 1 3 1 乳酸菌胞外多糖的生物合成 微生物胞外多糖的生物合成因菌种不同而发生在生长的不同阶段和环境条件下。按合成 位点和合成模式的不同，微生物胞外多糖的合成分为位于细胞壁外的同源多糖的合成和位于 细胞膜上的异源多糖的合成。同源多糖的合成不依赖c 5 5 - 1 i p i d - p p 的合成模式，异源多糖 的合成则依赖c 5 5 - 1 i p i d - p p 的合成模式。 同源多糖的合成体系包括糖基供体( 蔗糖) 、糖基受体及葡聚糖蔗糖酶( e c 2 4 1 5 ) 。 葡聚糖的合成属单链反应机制，葡聚糖蔗糖酶是一个糖营转移酶( 蔗糖一6 一葡萄糖基转移酶) ， 它将供体( 如蔗糖) 的糖苷基因转移到受体即正在延长的葡聚糖主链上，蔗糖可启动其自身 的多聚化反应，并不需要葡萄糖作为启动子。葡聚糖的合成特点是以蔗糖为唯一底物，合成 所需的能量来自蔗糖的水解而不是糖基核苷酸，不需脂载体和独立的分支酶，产物分子量大。 异源多糖的合成体系包括糖一核苷酸、酰基供体、脂中间体、酶系统及糖基受体五个因 子。在细胞膜上合成多糖需要的活性前体即各种高能态的单糖，这些高能态的单糖主要是糖 基一二核苷酸，所有含葡萄糖的多聚物( 除糖原外) 均以u d p 一胪葡萄糖为供体：乙酸、丙酮 3 河南农业大学2 0 0 9 年硕士学位论文 酸、3 一羟基丁酸等的活性形式是酰基，为胞外多糖的合成所必需。异戊二烯脂中间体整合的 重复单元，在原核细胞多糖合成中起作用的是焦磷酸异戊二烯脂；酶系统包括己糖激酶、糖 基一核苷酸合成及转移酶、糖基转移酶、聚合酶等。异源多糖的合成始于e p s 前体( 糖核苷 酸) 在胞内合成，之后糖核苷酸在液态载体中形成重复的单元，最后一步将重复单元从细胞 膜运输到细胞外。使之聚合成几百到几千个重复的单元，形成e p s u 引。 乳酸菌胞外多糖合成可能有三种形式：( 1 ) 加速扩散，( 2 ) 活性传递，( 3 ) 基因转移。 底物进入细胞，通常先被磷酸化，用于能量代谢或同化为细胞内多糖、脂多糖以及胞外多糖 等，在这些产物的合成中，底物的竞争受到细胞自己的调节控制。葡聚糖和果聚糖分别由外 源或自身分泌的糖基转移酶、葡聚糖合成酶、果聚糖合成酶合成，一旦被合成，它们可将细 胞外的蔗糖转化成e p s 和杂多糖。用于葡聚糖和果聚糖链延长的能量由水解多糖得来。相比 之下，但多糖的合成包含几步生化并与生成活化糖的关键。在磷酸葡萄糖异构酶的作用下， 葡萄糖- 1 - 磷酸与u t p 发生反应生成u d p - 葡萄糖，它可以用来合成新生态的e p s 的重复结构 或转化成u d p - 半乳糖或d u d p 一鼠李糖u 羽。 1 3 2 乳酸菌胞外多糖的遗传基因调控 由各种l a b 生物合成e p s 的基因分析已取得很大的进步。用来转移和控制糖基转移酶、 聚合酶、脱磷酸酶和蛋白质的基因密码，已经被破译，根据获得的基因信息，e p s 的初步代 谢工程试验已初步取得进展比1 。 对乳酸菌胞外多糖的生物合成的基因调控研究表明，嗜温乳酸菌产胞外多糖的特性受大 小不一定各种质粒的控制，在某些条件下( 高温、频繁传代) 产胞外多糖的特性容易丢失。 v e d a m u t h u 和n e vill e 发现乳酸乳球菌乳脂亚种淞产胞外多糖特性受一个1 8 5 - m d a 的质 粒的控制，该质粒还具有抗噬菌体的特性；v e s c o v o 等n 引入发现干酪乳杆菌干酪亚种产胞外 多糖的特性受4 5 - m d a 的质粒的控制；目前遗传特性研究的最为清楚的是源于乳酸链球菌 n i z ob 4 0 的质粒p n z 4 0 0 0 ，它是以含有多个功能性基因的复合质粒( 4 0 k b ) ，其中与胞外多 糖合成有关的1 4 个基因构成一个1 2 k b 的操纵子l 墉1 。 嗜热乳酸菌通常不含质粒，其产胞外多糖的特性与质粒无关。有关其产胞外多糖生物合 成的遗传调控研究甚少。肠膜明串菌中的葡聚糖蔗糖酶属诱导酶，而该酶在链球菌 s s a n g u i s 和突变链球菌中属于结构酶，其分泌不受蔗糖诱导。 1 4 研究乳酸菌e p s 的方法学 乳酸菌e p s 的生物合成和分泌发生在不同的阶段，多糖的数量和类型都受生长条件的限 制。然而，已经报道的关于影响乳酸菌产胞外多糖的物理和化学因素不一致。由于早期在原 始的m r s 培养基中或合成培养基中，没有发现e p s ，所以把牛奶作为研究培养基，也可以用 乳清为基础培养基。最近，人们研究了半合成和完全合成的培养基。由于一个含有碳水化合 物、矿物质、氨基酸、维生素和核苷酸碱基化学成分明确的培养基更适合用于研究营养物质 对乳酸菌生长、代谢途径和e p s 生物合成的影响，例如e p s 的产量、质量和所产e p s 组成。 4 河南农业大学2 0 0 9 年硕士学位论文 而且大多数调查者把注意力集中在粘度的测量上，因为它是用于指示液体培养基中产量的一 种传统的方法。 1 4 1 菌株对e p s 产量的影响 通过对近二十年来有关乳酸菌胞外多糖的研究结果进行分析n 蜩，发现不同乳酸菌的胞 外多糖产量各不相同，见表1 。 表1 不同乳酸菌产胞外多糖的量表 t | a b l t h ea m o u n to f d i 伍c i e n te p s 由表l 可看出不同乳酸菌所产胞外多糖的量不仅不同，并且产e p s 的量也相差很大。 据c e m i n g 等【2 0 j 报道，嗜热链球菌的产量是4 5 3 4 0 m g l ，德式乳杆菌保加利亚甄种的产量 为5 5 - - 1 5 0 m g l 。同时研究表咧3 1 ，非适宜生长条件下不同乳酸菌细胞合成胞外多糖的量在 4 5 m g l 3 5 0 m g l 之间；适宜生长条件下胞外多糖的生成量在1 5 0 m g l 6 0 0 m g l 之间。当 一株产胞外多糖的s t h e r m o p h i l u s 和一株不产胞外多糖的l b d e l l b r u e c k i is u b s p b u l g a r i c u s 一起在乳中培养时胞外多糖的产量可达8 0 0 m g l ，远远高于单株菌培养时胞外多 糖的产量，因此可通过双株或多株菌种混合培养来提高胞外多糖的产量。 p h i l i p p e 等【2 l 研究发现，在提供足够的蔗糖的情况下，由内分泌酶聚合而成的同源多糖的 产品如葡聚糖可达几克每升，由嗜热链球菌发酵所得的e p s 的浓度在乳中可达3 0 0 0m e , l 。 有人研究发现【2 1 1 利用一种产e p s 的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株和一种不产e p s 的 唾液链球菌嗜热亚种菌株组合生成的酸奶品质较好，他们通过实验还发现，不同的菌株以组合 的形式生产酸奶，产生e p s 的单糖组成往往不同，这可能是因为不同的菌株分泌和参与e p s 生物合成的酶组成及协调性不同所致，这种特性不但影响e p s 的合成量，而且也影响e p s 的 单糖组成。 目前很少看到有关菌株诱变后产胞外多糖的情况报道，因此有必要对诱交等方面处理 对胞外多糖产量的影响进一步研究。 ，4 2 培养基对e p 8 产量的影响 乳酸菌e p s 的生物合成量除受遗传因素即菌株自身因素的影响外，还受到培养基的组 成、p h 值、培养温度、碳源、氮源等因素的影响。 5 河南农业大学2 0 0 9 年硕士学位论文 1 4 2 1 培养基中碳源、氮源对e p s 产量的影响 顾笑梅等考查了含不同糖类的培养基对菌株z 2 2 2 产e p s 产量的影响【2 2 l ，结果表明不同 碳源对z 2 2 2 菌株产胞外多糖量有显著的影响，其中葡萄糖为碳源的菌株的胞外多糖产量最 高，这结果与国外m a c o c l o 等1 2 3 l 的有关研究报道一致。而e g a n c e l 等在1 9 9 4 年对唾液链球 菌嗜热亚种发酵产胞外多糖的研究中发现，以蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖为碳源的培养基中， 乳糖的e p s 生成量最大。e m o z z i 等在1 9 9 7 年研究干酪乳杆菌的e p s 生物合成时发现，合 成培养基中加入半乳糖有利于e p s 的生物合成1 2 4 1 。 适当地添加葡萄糖或乳糖碳源有利于e p s 的合成。c e m i n g 等【2 5 l 研究了半乳糖、葡萄糖、 乳糖、蔗糖、麦芽糖和蜜二糖对干酪乳杆菌c g il 产胞外多糖的影响，发现该菌的最适碳源 为葡萄糖。顾晓霞报道在l c x 基本液培养基，添加葡萄糖和或乳糖都有利于唾液链球菌湿 热亚种的生产和e p s 的合成【2 6 1 。 氮源的改变不仅影响e p s 的产量而且影响分子量。b z i s u 和e s h a h 在研究发酵条件对 嗜热链球菌产e p s 影响时发现在r _ m s 培养基中添加适当的乳清蛋白浓缩液时有利于e p s 产量的提高f 2 7 l 。b a nd e g e e s t 报道当必需氮源的浓度升高时所得e p s 的分子量减小【z 引。 1 4 2 2 培养基中碳源及氮源配比对e p s 产量的影响 早期研究认为酪蛋白和乳清蛋白的存在与乳酸菌e p s 的产量和生长没有特定的关系。 人们向脱脂乳添加水解酪蛋白来促进l b d e l b r u e e k i is u b s pb u l g a r i c u s 的生长，提高e p s 的产 量。c e m i n g 掣2 0 j 发现酪蛋白可促进l b d e l b r u e c k i is u b s pb u i g a r i c u s 产生e p s ，但不能促进 其生长。有研究表明，与脱脂乳相比，在超滤后的脱脂乳培养基中添加质量分数1 的酪氨酸， e p s 产量明显提高。同时高产e p s 还须有平衡的碳源氮源的比例。 1 4 2 3 培养温度对e p s 产量的影响 温度对乳酸菌e p s 合成的影响因菌株、培养条件不同而有差异。s u t h e r l a n d 曾提出， 在低于乳酸菌生长的最适温度下细胞生长慢，细胞壁的合成也慢，从而使较多的磷酸类异 戊的产量增加，k i m m 二烯用于e p s 的合成【5 1 ，可以促进乳酸菌保外多糖e l 等【2 9 1 人对德氏 乳杆菌保加利亚亚种研究表明，该菌合成e p s 的最适发酵温度为3 8 。该值比其最适生长 温度4 0 c - 4 3 c 略低。m o z z i 等脚1 研究发现在3 0 时德式乳杆菌保加利亚嗜酸乳杆菌和嗜 热乳杆菌产e p s 的量达到最大，g a m a r 等。q 研究发现当温度在2 5 - 3 7 c 变化时，在开始的 5 h 内，可提高乳杆菌鼠李糖亚种c 8 3 产e p s 的量。顾瑞霞等对唾液链球菌嗜热噩种研究表 明，3 7 c 该菌的e p s 产量最大，温度高于4 7 c 时该菌的e p s 合成能力迅速消失。k o j i c 等阱1 研究干酪乳杆菌c g l l ( l a c t o b a e i l l u sc a e s ic g i1 ) 产胞外多糖的情况时发现，与2 5 的 培养温度相比，在3 0 c 的培养条件下干酪乳杆菌c a ；l l 产生的胞外多糖量明显降低，约降低 了5 0 9 6 左右。他们认为，较低的培养温度能够提供乳酸菌胞外多糖的产量。但是，两批样温 度如果过低，乳酸菌的生长速度就会减慢，导致细胞生长量降低。从而使胞外多糖的产量有 所降低。 6 河南农业大学2 0 0 9 年硕士学位论文 但并不是所有的乳酸菌低温培养产e p s 的量都高于最适温度培养时产e p s 的量， g r o b b e n 等汹发现德式乳杆菌保加利亚亚种n c f b 2 7 7 2 在脱脂乳及限制培养基上产胞外多糖 的最适温度( 4 5 4 8 ) 高于生长最适温度( 3 7 4 2 ) 。 i 4 2 4 p h 值对e p s 量的影响 资料表明在p h 值6 5 7 0 时细菌产e p s 最高，因为异戊二烯酯的运载最适p h 值在 6 5 7 0 之间，p h 值的降低使多糖的合成因失去中间受体而受阻。但是绝大多数乳酸菌产胞 外多糖的最适p h 值低于上述值。v a nd e nb e r g 等p 4 1 研究温度和p h 值对清酒乳杆菌0 一l 产胞 外多糖的影响，发现该菌产胞外多糖的最适p h 值为5 8 。k i m m e l 等【2 9 】研究发现德式乳杆菌 保加利亚亚种在半限制培养基上生长产胞外多糖的最适p h 值为5 0 。m o z z i p 0 1 的研究发现在 3 0 和p h 6 0 时，l i c a s e ic r l 8 7 产e p s 产量最大。 另外，培养基初始p h 值对乳酸菌生物合成e p s 也有影响。顾瑞霞啪1 对唾液链球菌嗜热 亚种l c x 2 0 0 1 研究发现，在初始p h 值为6 5 时，e p s 产量较大，在低的p h 值。比如p h 为 5 。0 时，菌体生长较慢，其e p s 的合成也较低。大量的研究表明，选择适合的起始p h 值， 并在培养过程中适时调节控制p h 值是提高e p s 产量的重要方法，如何选择和控制p h 值也成 为一个关键点。 1 5 乳酸菌e p s 的生理功能特性研究 乳酸菌胞外多糖不仅具有多种生理学活性功能，而且还具有重要的工艺学功能，对酸乳、 干酪及绝大多数发酵乳制品的流变、质构、口感以及风味具有重要的影响，归纳起来，乳酸 菌e p s 具有以下功能： 1 5 1 乳酸菌e p s 的生理学功能 自1 9 8 2 年报道乳酸菌e p s 具有抗肿瘤作用1 以来，乳酸菌e p s 引起了许多学者的注意。 从目前报道的研究结果来看。乳酸菌e p s 主要有一下几方面的功能。 a 改善菌株对肠道粘膜的吸附。像普通多糖一样e p s 可以改善人体肠道环境，减少便 秘，同时乳酸菌e p s 还可以提高益生菌株对肠道的非特异性黏附，促进益生菌的生长，优化 肠道微生态系统。 b 抗肿瘤作用。k i t a z a w a 等渊报道，向荷瘤( s a r c o m a - 1 8 0 ) 鼠腹腔中注入乳酸杆菌乳 油亚种k v s 2 0 含有e p s 的菌株冻干物后，产生了抗癌效果，而注射仅含菌体的荷瘤鼠没有此 效果。 目前认为乳酸菌e p s 抗肿瘤作用的机理有一下几个方面； ( 1 ) 影响血液供应，鉴于细菌素能引起肿瘤细胞组织缺血性坏死，曾经设想多糖的抗 肿瘤作用可能影响肿瘤的血液供应； ( 2 ) 对细胞体积和空胞化的影响，多糖分子可以从腹膜吸附进入血液循环，然后活化 多糖分子，其活化的部分扩散回到腹膜腔内以直接影响肿瘤细胞。多糖分子或其一部分可 以刺激某种器官或组织( 如肾上腺和网状内皮系统) ，再分泌一种物质攻击肿瘤细胞： 7 河南农业大学2 0 0 9 年硕士学位论文 ( 3 ) 细胞膜接触抑制的功能，d e a e 右旋糖苷，对于腹水肿瘤细胞，在体内和体外试 验表明有抑制效应。肿瘤细胞表面具有很强的负电荷，d e a e 右旋糖苷可以结合这些负电荷， 使细胞表面被“中和”，有利于细胞与细胞间的接触，接受信号以停止分裂。 c 对免疫系统的促进作用 g o m e z 等人 3 6 1 从青春双歧杆菌培养物的上清液中分离得到的e p s 显示出较高的淋巴 应答内部促进作用。多糖免疫活性的提高，是通过t 细胞诱导的。多糖通过刺激细胞因子 的产生和竞争性拮抗存在于肿瘤患者体内的免疫抑制因子等途径，增强机体的抗肿瘤能力。 多糖还能促进特异性和非特异性免疫反应。k i t a z a w a 纠”】认为，由保加利亚乳杆菌o l l 1 0 7 3 r - 1 所产生的e p s 由中性和酸性多糖组成，其中酸性多糖具有促进幼鼠b 淋巴细胞有 丝分裂的作用：f o r s e n 等 3 7 1 则认为乳酸菌e p s 可以促进t 淋巴细胞的增值。 d 对细胞体的保护作用和降低血清胆固醇的作用细菌的荚膜和黏液多糖的生理功 能主要是防护作用，保持适当的水分，吸收金属离子，并可能抑制溶菌酶和防御噬菌体的进 攻。发酵乳所形成的多糖具有降低血清胆固醇的作用【圳。 1 5 2 乳酸菌e p s 的工艺学功能 目前，乳酸菌在世界范围内得到广泛的应用。采用不同的发酵剂和加工技术可以得到 各种风味、质构和营养保健特性的乳制品。现在人们更喜欢消费润滑、粘稠的酸乳制品，虽 然通过提高乳成分含量或添加增稠剂可以改善或达到以上效果，但考虑到产品的成本以及消 费者不希望食用高脂肪和含有添加剂的制品等原因，以及乳酸菌e p s 在改善酸乳制品的粘 度、质构和口感上具有很大的应用开发潜力，加之乳酸菌e p s 具有多种生理学特性，所以， 研究乳酸菌e p s 的工艺学功能具有重要的意义。 a 改善乳制品的流变学特性。乳酸菌e p s 一个重要的工艺学特性就是天然增稠作用， 而这种作用对发酵乳制品的感官特性和内在质量的稳定性都是很重要的。由产粘杆菌菌株与 非产粘球菌菌株混合发酵形成的酸乳与非产粘菌株形成的酸乳相比口感滑润、粘度增加；搅 拌后前者的粘度仍然较高( 1 7 0 - - 一2 3 0 m p a s ) ，而后者的粘度仅为7 0 m p a s 3 9 。由产粘菌株