CRISPR-Cas 9.ppt

CRISPR-Cas9,靶向基因操作技术,名词解释,1CRISPR：clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences成簇的、规律间隔的短回文重复序列2Cas：CRISPR-associatedCRISPR相关基因3靶向：对特定目标(分子、细胞、个体等)采取的行动。如外源基因在宿主细胞基因组DNA预期位置上的定向插入；药物分子对效应靶组织或细胞的定向传送或作用。,CRISPR-Cas系统的发现,1CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。2CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫,而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了CRISPR介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（spacer）来实现的。,CRISPR-Cas概述,CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术,CRISPR-Cas概述,CRISPR-Cas主要由两部分组成,识别,切割,CRISPR结构,CRISPR是一个特殊的DNA重复序列家族,广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats)组成,重复序列的长度通常2148bp,重复序列之间被2672bp间隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行识别。,Cas家族,Cas（CRISPRassociated）：存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guideRNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。,Cas分类,因为Cas基因多样性异常丰富，简单的分类很难区分那些同源但功能并不相关的Cas蛋白30多个研究小组共同提议，考虑多个因素，包括保守性的Cas蛋白之间的进化关系及Cas基因操纵子的组成方式等，将CRISPR/Cas的免疫机制分为相对独立的层次：第一个层次主要是对外来信息的处理和加工，形成免疫记忆，也就是新的间隔序列的获得，主要由通用的核心蛋白Cas1和Cas2参与完成；第二个层次主要为初级CRISPRRNA成熟以及识别和降解入侵的外源遗传物质按照该分类标准可以将CRISPR/Cas系统分为：Type、Type、Type三种不同类型,Cas9,Type系统的主要特征是包含一个标志性的Cas9蛋白(分子质量很大的多功能蛋白)参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA或是外源质粒。Cas9蛋白包含两个功能结构域，一个在N端，有类似于Ruc核酸酶的活性，一个在中部有类似HNH核酸酶的活性。嗜热性链球菌具有典型的TypeCRISPR/Cas系统，它的CRISPR/Cas系统编码tracrRNA(trans-activatingcrRNA)，其指导RNase和Cas9完成前体crRNA的成熟。随后tracrRNA还能与成熟的crRNA的重复序列配对形成RNA二聚体，进而和Cas9蛋白结合成核糖核蛋白复合体，发挥识别和降解入侵的外源DNA功能36,CRISPR-Cas9原理,此系统的工作原理是crRNA（CRISPR-derivedRNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activatingRNA）结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（shortguideRNA），足以引导Cas9对DNA的定点切割。作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifyingfactor），能够共定位RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的Cas9（Cas9nuclease-null）融合，并表达适当的sgRNA，可靶定任何dsDNA序列，而sgRNA的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9的结合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。,应用,基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。22013年1月份，美国两个实验室在Science杂志发表了基于CRISPR-Cas9技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的RNA将Cas9核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过RNA注射的方式将CRISPR-Cas系统导入小鼠受精卵比DNA注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组DNA进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的RNA序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用CRISPR-Cas技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关G蛋白偶联受体Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。2CRISPR-Cas技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES细胞打靶和TALEN等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔,技术优缺点,优点：