（生物化学与分子生物学专业论文）孤雌生殖卤虫卵母细胞中休眠卵发育相关基因的分离分析.pdf

摘要 卤虫( a r t e m i a ) ，也叫盐水丰年虾( b ri n es h ri m p ) ，属于节肢动物门 ( a r t h r o p o d a ) 、甲壳纲( c r u s t a c e a ) ，鳃足亚纲( b r a n c h i o p o d a ) 、无甲 目( a n o s t a c e a ) ，卤虫科( a r t e m i d a e ) 、卤虫属( a r t e m i a ) ，广泛分布于 内陆盐湖中。卤虫是目前已知耐盐范围最宽的多细胞动物。卤虫的胚胎具 有两种发育方式：一种是卵生( o v i p a rit y ) ，产生休眠卵( d i a p a u s ec y s t ) ， 此时胚胎停滞在原肠胚时期，休眠胚胎被厚厚的外壳包被，具有极低的代 谢活性和很强的抗逆性，只有经历特殊的环境条件才能继续发育；另一种 是卵胎生( o v o v i v i p a r i t y ) ，直接产生无节幼体( n a u p l i u s ) 或先产生有 薄外壳包被的卵并发育成无节幼体。 为了探索卤虫休眠生殖发育方式调节的分子机制，我们运用消减杂交 方法从卤虫( a r t e m i ap a r t h e n o g e n e t i c a ，尕海湖) 的将要经历休眠生殖 方式的卵母细胞中克隆了大量基因的c d n a 主要研究结果可以分为以下三 部分：1 ) 、为了开发全长e d n a 消减杂交技术，我们首先改进了一种基于 p c r 的双链e d n a 合成方法，使合成的双链e d n a 中全长e d n a 的比例增加， 同时系统分析了p c r 抑制性作用( p c r - s u p p r e s si o ne f f e c t ，p s e f f e c t ) 的各影响因素，并利用p s - e f f e c t 对小分子抑制作用更强的特点选择性的 富集双链e d n a 中大分子；2 ) 、开发了双链特异性d n a 酶介导的e d n a 均一 化消减杂交( d u p l e x - s p e c i f i cn u c l e a s e - m e d i a t e dn o r m a l i z a t i o na n d s u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ，d n s h ) ，模型实验表明该方法能够使只占m r n a 总含量0 0 0 0 1 的差异表达的基因能够被有效富集，并且能够得到其全长 e d n a ；3 ) 、运用d n s h ，使将要卵胎生的卤虫卵母细胞去消减将要卵生的卵 母细胞，分离并分析了将要产休眠卵卤虫侧囊中卵母细胞的6 9 2 个e d n a 克隆，其中有3 2 3 个与g e n b a n k 上已有的序列具有相似性。这6 9 2 个e d n a 共组装成6 0 0 个e d n a 重叠群( c o n t i g ) ，其中单一的( s i n g l e t o n ) 有5 2 9 ， 占了大部分。我们选择了其中4 4 个功能各异的基因( 来源于5 6 个克隆) 进行荧光定量p c r 分析，它们之间的m r n a 水平差异最大达到约1 5 ，0 0 0 倍。 这其中，1 1 个基因( 2 1 个克隆) 的表达量在将产休眠卵的卤虫卵母细胞中 i i i 显著性上调( p 0 0 5 ) ，另有7 个基因( 9 个克隆) 的表达量显著性下调 ( p 0 0 5 ) 由此表明卤虫的生殖方式在卵母细胞中就已经决定了 总之，我们成功运用消减杂交在卤虫的卵母细胞中分离和分析了大量 功能和表达量各异的基因的c d n a ，表明将要经历不同胚胎发育方式卤虫的 卵母细胞中就已经有大量不同功能基因差异表达，这也说明了卤虫的胚胎 发育方式在之前的卵母细胞中就注定了。本研究结果为更深入的探索卤虫 休眠卵的生殖发育研究提供了宝贵的信息。 关键词：卵母细胞；卤虫；胚胎发育；消减杂交；荧光定量p c r ；p c r 抑制 性作用；休眠卵 i v a b s t r a c t a n e m i a ( a r t h r o p o d a ，c r u s t a c e a ，b r a n c h i o p o d a ，a n o s t a c e a ，a r t e m i d a e ，a r t e m i a ) ， c o m m o n l yk n o w na sb r i n es h r i m p ，i sw i d e l yd i s t r i b u t e di ni n l a n ds a l tl a k e s t h e yc a n w i t h s t a n dt h ew i d e s ts a l i n i t yr a n g eo fa n yk n o w nm e t a z o a n e m b r y o so fa r t e m i a u n d e r g oe i t h e ro v i p a r o u sd e v e l o p m e n t ，p r o d u c i n ge n c y s t e dg a s t r u l a e ( c y s t s ) ，o r o v o v i v i p a r o u sd e v e l o p m e n t ，p r o d u c i n gs w i m m i n gl a r v a e ( n a u p l i i ) t h ec y s t se n t e r d i a p a u s e ，as t a t eo fg r e a t l yr e d u c e dm e t a b o l i ca c t i v i t ya n de x t r e m es t r e s sr e s i s t a n c e t ob e r e ru n d e r s t a n dt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fd i a p a u s e r e g u l a t i o n ，w e a n a l y z e dt h eg e n ee x p r e s s i o no fo o c y t e si nt h eo v i d u c t so fa r t e m i ap a r t h e n o g e n e t i c a ( g a h a il a k e ，c h i n a ) b yan o v e ls u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o nm e t h o d t h em a i nr e s u l t s a r el i s t e db e l o w ：1 ) i nt h ea i mo fd e v e l o p i n gaf u l l l e n g t he d n aa p p r o a c h ，w eh a v e i m p r o v e dap c r - b a s e dd o u b l e - s t r a n d e de d n as y n t h e s i sm e t h o d ，m e a n w h i l ew eh a v e s y s t e m l ya n a l y z e dt h ep c r - s u p p r e s s i o ne f f e c t ( p s e f f e c t ) a n du t i l i z e dt h ep s - - e f f e c tt o o v e r c o m et h eb i a s e da m p l i f i c a t i o no fs h o r t m o l e c u l e so fp c r ；2 ) ad u p l e x - s p e c i f i c n u c l e a s e m e d i a t e dn o r m a l i z a t i o na n ds u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ( d n s h ) m e t h o dw a s d e v e l o p e d ，b yw h i c hf u l l l e n g t he d n ao ft h ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e sa ta r a r e l e v e lo fc o n s i s t i n go n l y0 0 0 01 o ft h et o t a lm r n ac a nb es u f f i c i e n t l ye n r i c h e d ；3 ) o o c y t e sf r o md i a p a u s er e p r o d u c t i o n - d e s t i n e da r t e m i aw a ss u b t r a c t e db yt h eo o c y t e s f r o mn a u p l i ir e p r o d u c t i o n - d e s t i n e da n e m i au s i n gd n s h ，at o t a lo f6 9 2e d n ac l o n e s w e r ea n a l y z e di nw h i c h3 2 3m a t c h e dg e n b a n ke n t r i e s t h e6 9 2c d n a sw e r e a s s e m b l e di n t o6 0 0c o n t i g s ，m o s to fw h i c hw e r es i n g l e t o n s ( 5 2 9 ) r e a l t i m ep c r a n a l y s i so f4 4e d n a s ( r e p r e s e n t i n g5 6c l o n e s ) r e v e a l e dt h a tt h e i rm r n al e v e l s d i f f e r e dt oam a x i m u mo fa b o u t15 ，0 0 0f o l d a m o n gt h e m ，11 ( 21c l o n e s ) w e r e s i g n i f i c a n t l y ( p 0 0 5 ) u p r e g u l a t e da n d7 ( 9c l o n e s ) d o w n r e g u l a t e d i na r t e m i a o o c y t e st h a ts u b s e q u e n t l ye n t e rd i a p a u s e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h er e p r o d u c t i v e p a t h so fa p a r t h e n o g e n e t i c aa r ea l r e a d yd e t e r m i n e da tt h es t a g eo fo o c y t e s - f i l l e d o v i d u c t s v i ns u m m a r y ，w eh a v es u c c e s s f u l l yd e v e l o p e dan o v e ls u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n a p p r o a c h ，d n s h ，t os t u d yt h ed i f f e r e n t i a lt r a n s c r i p tp r o f i l e si na p a r t h e n o g e n e t i c d i a p a u s e - - d e s t i n e do o c y t e sr e l a t i v et on a u p l i i - - d e s t i n e do o c y t e sa tt h ef i l l e do v i d u c t s t a g e o u rr e s u l t ss h o w e dt h a tm a n yg e n e sw h o s ep r o d u c t sc o m m o n l yr e g u l a t e m e t a b o l i s m ，g r o w t h ，t r a n s c r i p t i o na n ds t r e s st o l e r a n c ea r ea l r e a d yd i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e db e t w e e nd i a p a u s e - a n dn a u p l i i - d e s t i n e do o c y t e s w ec o u l dc o n c l u d et h a t t h er e p r o d u c t i v ep a t h so fa p a r t h e n o g e n e t i c aa r ed e t e r m i n e da ta ne a r l ys t a g eo ft h e o o c y t e si no v i d u c t s k e yw o r d s ：o o c y t e ；a r t e m i a ；e m b r y od e v e l o p m e n t ；s u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ； r e a l - t i m ep c r ；p c r - s u p p r e s s i o ne f f e c t ；d i a p a u s e v l 前言 20 0 年前，比肩牛顿、爱因斯坦的伟人达尔文( c h a rl e s d a r w i n ) 诞生了。他于1 5 0 年前在巨著o nt h eo r i g i no f s p e c i e s ( 中文物种起源) 中用自然选择详细阐述了进化论。进化论 使自然和社会科学都受到深远的影响。进化让物种之间具有共 性和差异，了解生物适应不同环境的机制，对我们了解自然和 生物与自然的关系都有着重要的作用，同时也有可能运用到生 物医学上。 卤虫( a r t e m i a ) 是一种广泛分布于内陆盐湖中的小型甲壳 动物，对盐浓度有着极高的耐受范围。卤虫可以直接产出无节 幼体，也可以在一定的产出休眠卵。卤虫的休眠卵停滞在原肠 胚期，约含4 0 0 0 个细胞，其中部分为多核细胞，休眠卵的代谢 活动几乎停止。一般情况下，卤虫的休眠卵不会发育成个体， 只有经过一系列的环境刺激才能打破期休眠状态，激活的休眠 卵在合适的环境下才能继续孵化成无节幼体。卤虫的休眠卵具 有极强的抗逆性，它们能够经受反复的脱水水化、冻溶等自 然环境的刺激而存活数年。这部分地解释了从几亿年前的恐龙 时代起，卤虫能够存活至今并保持形态几乎不变。 目前，卤虫胚胎的休眠发育机制尚不清楚。了解它的机制， 有助于我们研究休眠卵的抗逆机制，同时也能够对其它物种包 括蚊子的休眠机制研究提供线索。 i i d n s h o r f 本文主要缩略词表 d u p l e x s p e c i f i cn u c l e a s e - m e d i a t e dn o r m a li z a t i o n 双链特异性d n a 酶介 a n ds u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n 导的均一化消减杂交 o p e nr e a d i n gf r a m e 开放阅读框 a fa l k a li n ep h o s p h a t a s e a m pa m p i c i l l i n d e p c d i e t h y p y r o c a r b o n a t e p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n hh o u r m i nm i n u t e s e cs e c o n d i t r i n v e r t e dt e r m i n a lr e p e a t s r a c er a p i da m p li f i c a ti o no fc d n ae n d s i p t g i s o p r o p h y l t h i o d d - g a l a c t o s i d e x g a i5 - b r o m o 一4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y l d g a l a c t o p y r a n o s i d e d m s o d i m e t h y ls u l p h o x i d e s d s - p a g e 删l v s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s is m e l o n e ym u r i n el e u k e m i av i r u s r tr e v e r s et r a n s c r i p t a 8 e r e v e r s et r a n s c r i p t i o n t d tt e r m i n a ld e o x y n u c l e o ti d y lt r a n s f e r a s e i 碱性磷酸酶 氨苄青霉素 焦碳酸二乙酯 聚合酶链式反应 小时 分钟 秒 末端反向重复序列 快速扩增e d n a 末端 异丙基_ b d - 硫代半 乳糖瞽 5 一澳- 4 - 氯一3 一吗i 哚一 侈- d - 半乳糖营 二甲基亚砜 十二烷基硫酸钠聚丙 稀酰胺凝胶电泳 莫洛尼氏鼠白血病病 毒 逆转录酶逆转录 末端脱氧核糖核苷酸 转移酶 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或疾写过的研究成果，也不包含为获得浙鎏太堂或其 他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名戴惠刍缝字日期：加刁年厂月厂。日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解浙塑太堂有权保留并向国家有关部门 或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授媸 些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入非盈利性数据库进行检索 和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 学位论文作者签名：载 签字日期：伊。c 7 年f 月f 位日 导师签 褂帆呷细沪日 致谢 时间匆匆，五年的博士生生涯一晃就要结束了。流逝的时 光让人淡忘，内心深处的记忆，却也因而更加清晰。在此论文 完成之际，衷心地感谢所有关心、支持和帮助过我的老师和朋 友。 本论文是在导师杨卫军教授的悉心指导下完成的。杨老师 使我从对大学学业的迷茫中步入了严谨而富于挑战的科研环 境。杨老师提供给我的相对自由的环境，让我明白了科学精神 的不可或缺的四部分：探索、怀疑、实证、理性。科学精神将 使我受用一生。在此谨向杨卫军老师致以最诚挚的感谢! 实验室的老师、师兄弟、师姐妹不仅在科研上给予我很多 的帮助，而且在生活上也给予我无私的关心和照顾，他们是杨 帆老师，刘军、银国利、曹俊霞、冯琛卓、丁霞、朱晓静、杨 劲树、李晔博士，戴洁琼、陈齐、刘玉磊、许华腾、k h a li dm a h m o o d 、 陈佃福、曾庆国、王墨染、马文明、钱叶青、陈苏、代莉、赵 杨、李冉、鹿博、周蓉、俞炎琴、马宇光等博士生和硕士生， 以及在实验室实习的所有本科生。非常感谢大家，希望在未来 的征程中我们能够继续互相帮助，共同前进。 最后，必须特别感谢我的家人，我所走的路，无处不是家 人的辛苦。 戴忠敏 2 0 0 9 4 25 1 绪论 处于休眠状态的生物一般都具有很低的代谢率和很高的抗逆性，从而使它们 能够经受寒冷、食物短缺，干燥等许多极端自然环境的考验，等到条件合适时又 继续繁衍，这使得休眠作为一种适应自然环境的成功进化策略广泛存在于生物 界。休眠卵是一种比较普遍的休眠方式，对休眠卵的形成、维持以及滞育后发育 的研究有利于我们对这种进化机制的了解和利用。 1 1 卤虫休眠生殖相关研究 卤虫( a r t e m i a ) ，俗称盐水丰年虾( b r i n es h ri m p ) ，属于节肢动物门 ( a r t h r o p o d a ) 、甲壳纲( c r u s t a c e a ) 、鳃足亚纲( b r a n c h i o p o d a ) 、无甲目 ( a n o st a c e a ) 、卤虫科( a r t e m i d a e ) 、卤虫属( a r t e m i a ) ，广泛分布于内陆盐湖 中，是目前已知耐盐范围最宽的多细胞动物。卤虫属由多种卤虫组成，包括两性 生殖( b is e x u a l ) 和无性生殖( a s e x u a l ) 种。无性生殖卤虫也叫孤雌生殖 ( p a r t h e n o g e n e s is ) 卤虫，其种群中几乎全部是雌体，那些稀少的雄体称为罕 见雄体( r a r em a l e ) 。不论是两性生殖还是孤雌生殖的卤虫，它们的胚胎都有两 种发育方式：卵生( o v i p a r it y ) ，产生休眠卵( d i a p a u s ec y st ) ；卵胎生 ( o v o v i v i p a r i t y ) ，直接产生无节幼体( n a u p li u s ) 或先产生有薄外壳包被的卵 并很快发育成无节幼体【1 ，2 】。图1 - 1 和图1 - 2 显示了卤虫a r t e m i a 厂r a n c i s c a n a 的两种发育方式。如图1 - 2 所示，卤虫的两种胚胎发育方式可以通过显微镜下雌 性卤虫的形态上不同加以区分：在早期包括卵母细胞时期可以通过泌壳腺的颜色 不同区分，泌壳腺为棕褐色的卤虫将进行休眠胚胎发育，而泌壳腺为白色或无色 的卤虫则将进行卵胎生；而后期则可以通过卵壳的颜色不同区分，卵壳为棕褐色 的卵将进入休眠卵，而卵壳为白色或无色的卵将继续发育成无节幼体【1 ，2 】。此 外，n a m b u 等人的研究表明，光照周期和温度是决定卤虫胚胎发育方式的主要因 素，当光照时间较短和温度较高时，产休眠卵的比例较高，反之则较低【3 】。然 而，两种不同胚胎发育的卤虫在卵母细胞中是否已经有差异，以及决定卤虫胚胎 发育方式的分子机制目前都还不清楚。 c 兽 n u l u f a v o u r a b l e c o n d i t i o n s d e v e k m i n g n a u p l i l ( i n s t a rn l l a d a e o n s t a r 哪 ! l r 必ll 思赫 图1 - 1 卤虫彳，r a n s c i s c a n a 的不同发育方式卤虫卵母细胞受精后经历卵胎 生或卵生，分别产下无节幼体( 图左侧) 或停滞在原肠胚时期的休眠卵，( 图上 侧) 。休眠卵被激活后可以发育成幼虫，然而当条件不合适时，已经开始发育的 休眠卵又会进入滞育阶段( 图右侧) ( 引自文献【1 】) f i g u r ei - 1a i t e r n a t i v ed e v e l o p m e n t a lm o d e so fzf r a n c i s c a n a f e r t i1i z e d a r t e m i a o o c y t e sm a yu n d e r g oo v o v i v i p a r o u sd e v e l o p m e n t ， w h e r e i n f r e e - s w i m m i n gn a u p l i i ( f i r s t - i n s t a rl a r v a e ) a r ep r o d u c e d ( 1 e f ts i d eo f d i a g r a m ) a 1t e r n a ti v e l y ，o v i p a r o u sd e v e l o p m e n to c c u r s a n dg a s t r u l a e e n c y s t ，l e a v et h ef e m a l e ，a n de n t e rd i a p a u s e ，a f t e rw h i c ht h e ya r eo f t e n d e s i c c a t e d ( t o po fd i a g r a m ) u p o na c t i v a t i o nc y s t sd e v e l o pi n t ol a r v a e ， b u ti fu n f a v o r a b l ec o n d i t i o n sp r e v a iig r o w t hi sa r r e s t e da n dc y s t sb e c o m e q u i e s c e n t ( r i g h tsi d eo fd i a g r a m ) ( d i a g r a mf r o ml i a n ga n dm a c r a e 1 】) 卤虫的休眠卵停滞在原肠胚期，由厚厚的无细胞外壳包被，大约含有4 0 0 0 个细胞，其中部分为多核细胞【4 】。如图一所示：休眠卵需要一定条件才能被激 活，被激活的休眠卵在条件不合适时，维持发育停滞状态，而遇到合适的条件会 进入滞育后发育过程，但是这种过程在最初阶段是可逆的，滞育后发育的休眠卵 2 p r e f e r t i l i z a t j o n 0 52s s o 5 5 图l 一2 卤虫j ，3 c 如甜册的卵胎生和卵生发育。样品经多聚甲醛固定后用光 照显微镜观察。在卵母细胞受精之前，雌虫将要卵胎生( a ) 或卵生( a ) 。( b - f 和b - f ) 卵母细胞或胚胎将要发育成幼虫( g ) 或休眠卵( g ) 。e ，胚胎；g ， 肠；0 ，卵母细胞：l p ，侧囊；o v ，卵巢：s h ，泌壳腺；u ，子宫。( 引自文献 1 】 f i g u r e 、一2o v o v i v i p a r o u sa n do v l p a r o u sd e v e l o p m c n ti n f r a n c i s c a n 0 s a m p l e sw e r ef i x e di np ar a f o r m a l d e h y d ea n de x a m i n e db yl i g h tm i c r o s c o p y f e m a l e sw i t ho o c y t e s p r o g r a m m e d t od e v e i o po v o v i v i p a r o u s l y ( a ) a n d o v l p a r o u s i y ( a ) w e r ep h o t o g r a p h e dj u s tb e f o r ef o r t i i i z a t i o l l ( bfa n d b - f ) r e p r o d u c t i v eo r g a n sw i t h e i t h e ro o c y t c so i - e m b r y o sd e s t i n e dt o b e c o m en a u p l i i ( g ) a n dc y s ts ( g ) e ，e m b r y o ；g ，g u t ；0 ，o o c y t e ；l p ，l a t c r a l p o u c h ；o v ，o v ar y ；s h ，s h e l l g l a n d ；u ，u t e r u s ( d i a g r a mf r o ml i a n ga n d m a c r a e 1 ) 如果再遇到不合适的条件，发育又会停滞，重新进入终止状态。同样令人惊奇的 是卤虫的休眠卵具有极低的代谢活性，能够耐受许多极端环境刺激，包括自然环 境中反复无常的脱水水化循环，极端的热或冷处理 5 】，以及数年的缺氧【6 - 8 】。 休眠卵的抗逆性可能主要由下列因素决定：a ) 具有只通透挥发性溶质的坚硬的 几丁质外壳【4 】；b ) 海藻糖大约占休眠卵干重的1 5 【8 】，海藻糖是一种非还原 性二糖，对很多蛋白具有热稳定性【9 】，研究表明，海藻糖也能够单独或与小分 子热休克蛋白( s h s p ) p 2 6 协同作用而稳定细胞，减小哺乳动物细胞在脱水和水 化过程中的凋亡【10 - 1 2 】；c ) 含有大量的s h s p 如p 2 6 【13 】，a r h s p 2 1 和 a r h s p 2 2 【1 4 - 1 6 】，以及铁蛋白类似物a r t e m i n 【1 7 ，1 8 】，转染并表达p 2 6 或 a r t e m i n 的哺乳动物细胞对热和双氧水具有更高的耐受性，不容易凋亡【1 8 ，1 9 】。 在卤虫彳f r a a c i s c a n a 中，a r t e m i n s h s p 都只在休眠发育的胚胎中表达，表达 量都在休眠胚胎发育过程中上升，并在休眠卵滞育后发育过程中下降 1 5 ，1 6 ，1 8 ， 2 0 】。q i u 等人研究卤虫受精后两天的胚胎中发现一个转录辅助因子p 8 的也是在 休眠发育的胚胎中特异性地表达 2 1 】。然而，这些分子伴侣以及p 8 本身的转录 调控目前都并不清楚【2 l 】。 综上所述，为了更好地了解卤虫的休眠发育调控，我们需要研究卤虫卵母细 胞中是否已经有与休眠相关的基因的差异表达，这可能可以用来揭示是否进入休 眠发育的决定时期。同时这些差异表达的基因有可能是卤虫休眠卵中起重要作用 的休眠相关蛋白s h s p s ，海藻糖等的上游基因，起到调控其它休眠相关蛋白及海 藻糖合成酶等基因的表达的作用。而分离和分析差异表达基因需要用到消减杂交 等方法。 1 2 实验方法的选择 生物体不同组织或细胞间，以及同一组织或细胞在不同发育时期、不同应激 条件下会选择性地表达一部分基因，这些表达量或表达时期不同的基因称为差异 表达基因( d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e ) 克隆和鉴定差异表达基因能够有 力地推动生物个体的发育、分化、癌变等过程的机理的研究目前筛选差异表达 4 基因的方法主要有：差异显示( d i f f e r e n t i a ld i s p l a y ，d d ) 【2 2 】、代表性差异 分析( r e p r e s e n t a t i o n a ld i f f e r e n c ea n a l y s i s ，r d a ) 【2 3 】、基因表达系列分 析( s e t i a la n a l y s iso fg e n ee x p r e s s i o n ，s a g e ) 【2 4 】、抑制性消减杂交 ( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ，s s h ) 【2 5 】和生物芯片 ( m i c r o a r r a y ) 。生物芯片目前只适用于基因表达信息较多的少数几种模式生物 的基因表达分析，而且也存在着灵敏度不高的问题。除生物芯片外，上述的这些 方法都分别具有一些缺点：d d 一次最多只能获得少数几个基因的c d n a 部分序列， 而且假阳性率较高；r d a 不能有效地将非目的分子消减掉，假阳性率也较高，而 且更利于表达量高的基因的富集，容易丢失低表达量的基因的信息；s a g e 需要大 量地测序，分析大量的序列信息，而且获得的序列长度目前最长也只有十几碱基 对( b p ) ，后期的研究仍要大量的工作；s s h 相对r d a 要高效，而且也能对表达量 不同的c d n a 的含量有一定均一化作用，但抑制性p c r 的强弱受多种因素控制【2 6 】， 另外s s h 也容易丢失低表达量的基因的信息。此外，上述的这些方法都不能得到 全长的e d n a ，这样在序列比对时也容易丢失信息；对于需要深入研究的基因，得 到全长c d n a 也是必需的。因此，为了研究非模式生物的基因表达，我们仍然需要 一种能够富集差异表达基因的方法，这种方法不但能够从少量样品中均一化丰度 不同的差异基因，而且可以得到全长e d n a 。 消减杂交常常需要大量的样品，当样品不容易大量取得时，我们需要扩增样 品的e d n a ，而一般p c r 在扩增多重样品时，对其中的小分子总是更容易扩增。这 就要求我们克服p c r 的这个缺点s i e b e r t 等人发现利用末端反向重复序列 ( i n v e r t e dt e r m i n air e p e a t s ，i t r ) 引起p c r 的抑制性作用( p e r - s u p p r e s si o n e f f e c t ) 可以减少p c r 的单引物扩增【2 7 】，此后p c r 抑制性作用被用来扩增e d n a 末端【2 8 】，s h a g i n 等人更是发现p c r t 均抑制性作用对大分子和小分子的作用不同， 可以通过引物浓度和i t r 的g c 含量来控制p c r 抑制性作用的强弱来调节大分子和 小分子的扩增效率【2 9 】。因此，进一步地分析利用p c r 抑制性作用的相关影响因 素有利于我们利用p c r 抑制性作用来克服p c r 在扩增多重样品时对小分子的偏好 性。 1 3 展望 5 对卤虫卵母细胞休眠发育相关基因的分离分析可以让我们确定卤虫的胚胎 的休眠发育是否在早期就已经决定，让我们初步了解什么基因在卤虫的休眠发育 过程中起作用，这有助于我们研究卤虫休眠卵发育的分子机制，也有助于我们更 好地了解生物界普遍存在的其它生物的休眠机制研究。同时新的消减杂交方法也 可以为我们找到更多的休眠相关的基因。 6 1 0 1 1 1 2 参考文献 l i a n g ，p a n dt h m a c r a e ，t h es y n t h e s i so f as m a l lh e a ts h o c k z a l p h a - c r y s t a l l i np r o t e i n 伽 a n e m i aa n di t sr e l a t i o n s h i pt os t r e s st o l e r a n c ed u r i n gd e v e l o p m e n t d e v b i o l ，1 9 9 9 2 0 7 ( 2 ) ：p 4 4 5 5 6 m a c r a e ，t h ，m o l e c u l a rc h a p e r o n e s , s t r e s sr e s i s t a n c ea n dd e v e l o p m e n ti na r t e m i a f r a n c i s c a n a s e m i nc e l ld e vb i o l ，2 0 0 3 1 4 ( 5 ) ：p 2 51 - 8 n a m b u ，z ，s t a n a k a , a n den a m b u ，i n f l u e n c eo f p h o t o p e r i o da n dt e m p e r a t u r eo n r e p r o d u c t i v em o d ei nt h eb r i n es h r i m p , a n e m i a f r a n c i s c a n a je x pz o o l o gac o m pe x pb i o l ， 2 0 0 4 3 0 1 ( 6 ) ：p 5 4 2 - 6 d r i n k w a t e r , l e ，c l e g g ，j s ，e x p e r i m e n t a lb i o l o g yo f c y s td i a p a u s e , i na r t e m i ab i o l o g y r a b r o w n e ，s o r g e l o o s ，ea n dt r o t m a n ，c n a ，e d i t o r 1 9 9 1 ，c r cp r e s s ：b o s t o n p 9 3 11 7 c l e g g ，j s ，t r o t m a n ，c n a ，p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l a s p e c t so f a r t e m i ae c o l o g y ，i n a r t e m i a ：b a s i ca n d a p p l i e db i o l o g y ，t j a b a t z o p o u l o s ，b e a r d m o r e ，j a ，c l e g g ，j s 。 s o r g e l o o s ，p ，e d i t o r 2 0 0 2 ，k l u w e r a c a d e m i cp u b f i s h e m ：d o r d r e c h t p 1 2 9 1 7 0 c l e g g ，j s ，s a j a c k s o n ，a n dv i p o p o v , l o n g - t e r ma n o x i ai ne n c y s t e de m b r y o so f t h e c r u s t a c e a n ，a r t e m i a f r a n c i s c a n a ：v i a b i l i t y , u l t r a s t r u c t u r e , a n ds t r e s sp r o t e i n s c e l lt i s s u er e s ， 2 0 0 0 3 0 1 ( 3 ) ：p 4 3 3 - 4 6 c l e g g ，j s ，p r o t e i ns t a b i l i t yi na r t e m i ae m b r y o sd u r i n g p r o l o n g e da n o x i a b i o lb u l l ，2 0 0 7 2 1 2 ( 1 ) ：p 7 4 - 8 1 c l e g g ，j ，e m b r y o so f a n e m i a f r a n c i s c a n as u r v i v e f o u r y e a r so f c o n t i n u o u sa n o x i a ：t h ec a s e f o rc o m p l e t em e t a b o l i cr a t ed e p r e s s i o n je x pb i o l ，19 9 7 2 0 0 ( p t3 ) ：p 4 6 7 7 5 c a r n i n c i ，p ，e ta 1 ，t h e r m o s t a b i l i z a t i o na n dt h e r m o a c 玎v a t i o no f t h e r m o l a b i l ee n z y m e s 砂 t r e h a l o s ea n di t sa p p l i c a t i o n f o r 历ps y n t h e s i so f f u l ll e n g t hc d n a p r o en a t la c a ds c iu s 八 19 9 8 9 5 ( 2 ) ：p 5 2 0 - 4 w o l k e r s ，w e ，f t a b l i n ，a n dj h c r o w e ，f r o ma n h y d r o b i o s i st o f r e e z e - d r y i n go f e u k a r y o t i c c e l l s c o m pb i o c