（法医学专业论文）基于ldr对高度降解和微量dna检材的snps分型研究.pdf

中文论著摘要 基于l d r 对高度降解和微量d n a 检材的 s n p s 分型研究 背景- - 匕j 目的r一尿口y 最近二十年来法医物证学最引人注目的变革，就是d n a 分析技术的应用及 发展。对于高度降解检材和微量检材，如何从中获取可靠的、足量的遗传学信息， 来进行法医学个体识别和亲权鉴定，一直是法医物证学面临的重大挑战。 随着降解d n a 分析技术的不断发展，如何评价、比较不同方法的检验效能 的问题，逐渐引起法医学者的关注；要实施此类研究，首先需要制备出特定片段 长度的降解d n a 标准样品。迄今，已提出了几种降解d n a 的人工制备方法，包 括超声振荡、d n a 酶消化以及其它理化措施( 改变环境温度、湿度、自然放置等) ， 但是，这些方法目前均未被广泛接受。因此，本文尝试探讨高度降解检材的人工 制备方法。 随着相关研究的不断深入，尽可能缩短靶d n a 片段的扩增子长度，已经成 为降解d n a 分析的基本策略，目前m i n i s t r p c r 和m i n i s e q u e n c i n g 是其代表技 术。但是，现有的m i n i s t r p c r 和m i n i s e q u e n c i n g 技术要求降解d n a 片段的长 度不得小于1 0 0 b p - - 一2 0 0 b p 。一旦基因组d n a 发生了非常严重的降解，片段小于 1 0 0 b p 的情况下，如何获得足量、可靠的遗传学信息来进行法医学鉴定呢? 对此 问题，目前尚无确切的解决方法。 当前，对于微量检材或低拷贝数检材( 1 0 wc o p yn u m b e r ，l c n ) 的d n a 分 析，主要有两种检测策略：一是增强p c r s t r 分型法，主要是增加p c r 反应循 环次数，提高s t r 位点扩增成功率( 检测信号多寡) 和产物量( 检测信号的强弱) ， 而后进行d n a 分析；二是首先进行l c n 检材的全基因组扩增或者巢式p c r 扩增， 以获取足量的d n a 模板，而后进行d n a 分型。但是，由于l c n 检材所含d n a 模板量过少，受随机效应的影响，采用上述两种策略，均会出现“额外”等位基因、 影子带( s t u t t e r 带) 、等位基因丢失等一些难以避免的问题，s t r 分型结果通常具 有不可重复性，并难以评价其有效性，无法得到可靠的法医学鉴定结论。 近年来，基于连接酶检测反应( l d r ) 的s n p s 分型技术快速发展，为降解 检材和微量检材的法医学d n a 分析提供了新的契机。首先，l d r 探针与模板d n a 互补结合的序列不需过长，只要满足以下两个条件即可：( 1 ) 能够有效识别待测 靶位点，( 2 ) 不影响连接酶的识别与结合所需片段长度，所以，l d r 探针长度不 超过数十个碱基。再者，对于双链d n a 的单链切口，d n a 连接酶的识别与连接 反应具有高度严谨性。因此，从理论上说，只要d n a 片段不小于3 0 - 5 0 b p ，即 可采用l d r 技术进行s n p 分型检测，这一特性尤其适用于高度降解d n a 分析。 所以，本文尝试l d r p c r 策略来检测高度降解d n a 。 再者，锁式探针( p a d l o c kp r o b e s ) 可识别靶位点并形成包含单链切e 1 的局部 双螺旋结构，经l d r 反应可生成环状模板，l d r 反应的高度严谨性保证了等位 基因识别的准确性；同时，超分支滚环扩增反应具有极强的扩增效能，可极大地 放大l d r 检测信号。将二者结合起来，对l c n 检材的分析效能将得以极大提高。 所以，本文拟丌发l d r h r c a 策略来检测l c n 检材。 材料与方法 枸橼酸钠抗凝人未梢静脉血样品1 2 份，男女各6 份，由中国医科大学法医 学院法医血清学教研室提供。采用酚一氯仿法提取基因组d n a 。 分别使用超声法和d n a s ei 酶切法处理高分子量基因组d n a ，于不同时间段 取样，电泳和或p c r 扩增检测d n a 片段长度，人工制备不超过l o o b p 的高度降 解d n a 检材。 使用a m p f ls t r l d e n t i f i l e r p c ra m p l i f i c a t i o nk i t 对降解d n a 检材进行复 合s t r 分型检验。选择4 个待测s n p s 位点( r s l 7 7 5 0 3 0 3 、r s 2 3 0 7 6 4 7 、r s 2 3 0 7 5 5 7 和r s l 7 2 5 0 9 9 2 ) ，并构建各位点的l d r 探针；首先采用l d r 反应，识别降解检材 各待测位点的基因型；而后采用p c r 反应，扩增连接后l d r 探针，根据p c r 产 物电泳结果判断各位点基因型。 使用稀释法制备d n a 浓度梯度样品：2 0 0 、1 0 0 、5 0 、4 0 、3 0 、2 0 、1 0 p g d 。 使用a m p f ls t r l d e n t i f i l e r p c ra m p l i f i c a t i o nk i t 对微量检材进行复合s t r 分 2 型检验。选择r s l 7 7 5 0 3 0 3 位点，并构建一对等位基因特异性锁式探针( c p p 和 a p p ) ；首先采用l d r 反应，识别待测位点的基因型；而后采用h r c a 反应，扩 增环化锁式探针，根据电泳结果判断各位点基因型。 结果 1 、超声法处理基因组d n a ，可重复性不佳，d n a 片段分布范围表现出明显 差异。随着d n a s el 酶切时间延长，d n a 片段长度不断缩短；酶切1 5 0 m i n ，降解 d n a 片段长度不超过1 0 0 b p 。 2 、对于片段长度不超过l o o b p 的人工降解d n a 样品，a m p f l s t r i d e n t i f i l e r p c ra m p l i f i c a t i o nk i t 中全部s t r 基因座均不能识别。采用l d r p c r 方法，进行单位点检测，单碱基置换变异( r s l 7 7 5 0 3 0 3 和r s l 7 2 5 0 9 9 2 ) 和三碱基 缺失插入变异( r s 2 3 0 7 6 4 7 和r s 2 3 0 7 5 5 7 ) 均能得到正确分型结果，多态性碱基的 变异类型不是l d r 反应忠实性的主要影响因素；短l d r 探针( r s l 7 7 5 0 3 0 3 和 r s 2 3 0 7 6 4 7 ) 与长探针( r s 2 3 0 7 5 5 7 和r s l 7 2 5 0 9 9 2 ) 均可得到准确分型结果，探针特 异性互补序列可短至1 0 个核苷酸而不影响l d r 反应。进行2 位点及4 位点复合 检测，均可获得准确分型结果，可有效避免探针间交互效应。 3 、使用a m p f ls t r i d e n t i f i l e r p c ra m p l i f i c a t i o nk i t ，p c r 循环数3 4 次， d n a 模板量 一1 0 0 n g ，全部s t r 基因座均能正确识别；d n a 模板量 一5 0 n g ，等位 基因丢失现象严重，长扩增子座位尤为显著。采用l d r h r c a 方法检测 r s l 7 7 5 0 3 0 3 纯合型样品( c c 型、a a 型) ，产物量随d n a 模板量降低而减少，2 0 p g 以上可获得正确的基因分型结果；c c 纯合型样品1 0 p g 组共1 0 份，c c 表型7 份， a c 表型2 份，无产物1 份；a a 纯合型样品1 0 p g 组共1 0 份，a a 表型6 份，a c 表型1 份，c c 表型1 份，无产物2 份。检测r s l 7 7 5 0 3 0 3 杂合型样品( a c 型) ， 产物量随d n a 模板量降低而减少，3 0p g 以上可获得讵确的基因分型结果；1 0 p g 组共1 0 份，a c 表型6 份，c c 表型1 份，a a 表型2 份，无产物1 份。所有样品 的检验过程中，均未发现影子带现象。 结论= 日，l 1 、采用d n a s ei 酶切法处理基因组d n a ，操作简单，d n a 降解程度易于控 3 制，结果稳定，可用于制备特定片段长度的降解d n a 标准样品。 2 、对于片段长度小于1 0 0 b p 的高度降解d n a 检材，l d r p c r 方法可准确 进行s n p s 基因座分型，并可进行4 个基因座复合分型检测。本方法对于高度降 解检材的法医学d n a 分析，具有较大的开发价值。 3 、对于l c n 检材，l d r h r c a 方法检测特异性好，灵敏度高于增强p c r s t r 技术，可能更适用于法医学微量d n a 分析。 4 、本研究总结的待测s n p s 位点筛选及相应l d r 探针构建原则，可保证高 度降解检材和微量检材s n p s 分型的特异性和灵敏性，并且能够满足高通量检测 的要求。 关键词 法医学d n a 分析；d n a 降解；人工降解d n a ；低拷贝数检材；单核苷酸 多态性；连接酶检测反应；多聚酶链反应；超分支滚环扩增；锁式探针 4 英文论著摘要 l d r - b a s e dm e t h o d sf o rs n p st y p i n go f d e g r a d e dd n a a n dt r a c ed n a b a c k g r o u n da n do b j e c t i v e s f o rt h ep a s td e c a d e s ，t h eu s eo fd n a a n a l y s i sm u s tb et h em o s ts i g n i f i c a n t r e f o r m a t i o ni nf o r e n s i cf i e l d s h o w e v e r , d n ad e g r a d a t i o na n dt r a c ed n ah a v ea l w a y s b e e ns p e c i a lc h a l l e n g e sf o rf o r e n s i cs c i e n t i s t so b t a i n i n gr e l i a b l ea n ds u f f i c i e n tg e n e t i c i n f o r m a t i o nf o rp e r s o n a li d e n t i f i c a t i o na n dp a r e n t a g e t e s t i n g t oi m p r o v ea n da s s e s st h ep e r f o r m a n c eo fd i f f e r e n tg e n o t y p i n gt e c h n o l o g i e si n t h o s ec a s e sw h e r ed n ai sd e g r a d e d ，i tw o u l db ed e s i r a b l et oh a v ear e f e r e n c es a m p l e o fd e g r a d e dd n aw i t hk n o w nf r a g m e n ts i z e s s e v e r a lm e t h o d st h a tm a yo b t a i na s o u r c eo fa r t i f i c i a l l yd e g r a d e dd n a , i n c l u d i n gu l t r a s o n i c a t i o n ，d n a s ed i g e s t i o na n d o t h e rp h y s i c a lm e t h o d s ( t e m p e r a t u r ea n dh u m i d i t y , e t c ) h a v eb e e nr e p o r t e ds of a r , b u t t h e r eh a sn o tb e e nam e t h o da c c e p t e de x t e n s i v e l y t h e r e f o r e ，w ep r o p o s e dt od e v e l o pa m e t h o dt op r e p a r ea r t i f i c i a l l yd e g r a d e dd n au n d e rc o n t r o l l e dc o n d i t i o n s f o rt h ep a s tf e wy e a r s ，t w on e wg e n e t i cm a r k e r sh a v eb e e nd e v e l o p e d ，i g m i n i s t ra n ds i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ( s n p ) f o rf o r e n s i c a n a l y s i s o f d e g r a d e dd n a , i th a sb e c o m et h ee s s e n t i a ls t r a t e g yt or e d u c et h ea m p l i c o nl e n g t ha s s h o r ta sp o s s i b l e t h et y p i c a lt e c h n o l o g i e sa r em i n i s t r - p c ra n dm i n i s e q u e n c i n g h o w e v e r ，t h ed n af r a g m e n ts i z es h o u l db em o r et h a n1 0 0 2 0 0 b pw h e nt h e s et w o a s s a y sa r eu s e d i ft h ea v e r a g ed n af r a g m e n tl e n g t hi sl e s st h a n1 0 0b p ，h o wc a nw e g e ts u f f i c i e n t ，r e l i a b l eg e n e t i ci n f o r m a t i o nf o rf o r e n s i cd n aa n a l y s i s ? i ti ss t i l lab i g p r o b l e mu n s o l v e d n o w a d a y s ，t w om a i ns t r a t e g i e sa r eu s e d i nf o r e n s i cd n aa n a l y s i so f l o w c o p y - n u m b e r ( l c n ) s a m p l e s ：( 1 ) e n h a n c i n gs t r - p c ra s s a y b yi n c r e a s i n gp c r c y c l en u m b e r , t h i sm e t h o dc a ng i v ei m p r o v e dr e s u l t s ( 2 ) n e s tp c ro rw h o l eg e n o m e 5 a m p l i f i c a t i o n ( w g a ) c o m b i n e dw i t hs t r p c r a f t e rt h eu s eo fw g a o rn e s tp c r ， t h eq u a n t i t yo ft h es t a r t i n gd n at e m p l a t ei n c r e a s e sg r e a t l ys ot h a t s u b s e q u e n t s t r p c ra s s a yd o e sn o tn e e dm u c hm o r ec y c l en u m b e r b e c a u s el c n s a m p l e so n l y c o n t a i nt r a c ea m o u n t so ft h es t a r t i n gd n a t e m p l a t e ，t h es t o c h a s t i ce f f e c t sw i l li n c r e a s e g r e a t l y , a n dr e s u l ti na l l e l ei m b a l a n c ea n ds t u t t e rp r o d u c tf o r m a t i o n i na d d i t i o n ，i ti s o f t e ni m p o s s i b l et oe x a m i n et h el c ns a m p l e sr e p e t i t i v e l ya n dd i f f i c u l tt oa s s e s si t s r e l i a b i l i t y t h e r e f o r e ，t h er e s u l t i n gp r o f i l e so fb o t hs t r a t e g i e sa b o v em a yb ec o m p l e x a n dd i f f i c u l tt oi n t e r p r e tf o rf o r e n s i ca p p l i c a t i o n s f o rt h ep a s td e c a d e s ，s n p s t y p i n gt e c h n o l o g i e sb a s e do nl i g a s ed e t e c t i o nr e a c t i o n ( l d r ) h a v ed e v e l o p e dq u i c k l y , a n dp r o p o s ean e wc h a n c ef o rf o r e n s i ca n a l y s i so f d e g r a d e dd n a a n dt r a c ed n a f i r s to fa l l ，l d rp r o b e so n l yn e e ds h o r tt a r g e t - s p e c i f i c s e q u e n c e st oh y b r i d i z et od n at e m p l a t e t h el e n g t ho ft a r g e t - s p e c i f i cs e q u e n c e s s h o u l d ( 1 ) b ea b l et or e c o g n i z et h et a r g e tl o c u st ob et e s t e d ，a n d ( 2 ) b es u i t a b l ef o r r e c o g n i t i o na n db i n d i n gb yd n al i g a s e t h e r e f o r e ，l d rp r o b e sc a nb ea ss h o r ta s s e v e r a ld o z e n so fn u c l e o t i d e s i na d d i t i o n ，l d rp o s s e s s e sh i 【g hf i d e l i t ya n ds t r i n g e n c y f o rb a s em a t c h i n ga tt h en i c k t h e o r e t i c a l l y , l d rc a nb eu s e df o rs n p st y p i n ga sl o n g a st h ed n a f r a g m e n ts i z ei sn o tl e s st h a n3 0 - 。5 0 b p t h u s ，l d ri ss u i t a b l ef o rs n p s t y p i n go fh i g h l yd e g r a d e dd n a a f t e r r e c o g n i z i n ga n dh y b r i d i z i n g t o t a r g e tl o c i ，p a d l o c kp r o b e s c a nb e t r a n s f o r m e dc i r c u l a rm o l e c u l e ss e a l e db yc o v a l e n tb o n d r e l i a b l ea l l e l i cd i s c r i m i n a t i o n a c h i e v e sb e c a u s eo fh i g hf i d e l i t ya n ds t r i n g e n c yo fl d r s u b s e q u e n t l y , c i r c u l a r i z e d p a d l o c kp r o b e sc a nb ea m p l i f i e df o rs i g n a le n h a n c e m e n tb yh y p e r - b r a n c h e dc i r c l e a m p l i f i c a t i o n ( h r c a ) t h ea m p l i f i c a t i o ne f f i c a c yo fh r c ai s s oe x c e e d i n gt h a ta g r e a tq u a n t i t yo fp r o d u c t sc a nb eo b t a i n e df r o mt r a c ed n at e m p l a t e t h e r e f o r e ， l d r h r c a m a y b ev a l u a b l ef o rs n p st y p i n go fl c nd n a m e t h o d s t w e l v eh u m a np e r i p h e r a lb l o o ds a m p l e s ( m a l e6 ，f e m a l e6 ) w e r ep r o v i d e db y d e p a r t m e n to ff o r e n s i cs e r o l o g y , f o r e n s i cc o l l e g e ，c h i n am e d i c a lu n i v e r s i t y g e n o m i c 6 d n aw a se x t r a c t e db yt h es t a n d a r dp h e n o l c h l o r o f o r mp r o c e d u r ea f t e rd i g e s t i o nw i t h p r o t e i n a s ek d u r i n gt h et r e a t m e n to fg e n o m i cd n ab yu l t r a s o n i c a t i o no rd n a s ed i g e s t i o n ， a l i q u o t sw e r et a k e na tac e r t a i nt i m e p o i n t ，a n dt h ed n aw a se l e c t r o p h o r e s e di n a g a r o s eg e la n da m p l i f i e dw i t ht h ep r i m e r sd e s i g n e db yo u r s e l v e s t h e r e f o r e ，t h es i z e s o fd n a f r a g m e n t sw e r ec l e a r l yd e t e r m i n e d a f t e rp r e p a r a t i o no ft h ea r t i f i c i a l l yd e g r a d e dd n a , m u l t i p l e xs t r sl o c iw e r e t y p e dw i t ha m p f ls t r i d e n t i f i l e r p c ra m p l i f i c a t i o nk i t a tt h es e c o n ds t e p ，f o u r s n p sl o c iw e r es e l e c t e d ( r s l 7 7 5 0 3 0 3 ，r s 2 3 0 7 6 4 7 ，r s 2 3 0 7 5 5 7 ，a n dm 1 7 2 5 0 9 9 2 ) ，a n d t h e i rl d r p r o b e sw e r ed e s i g n e d l d rp r o b e sw e r eu s e dt od i s c r i m i n a t ea l l e l e sb y t h e r m o s t a b l el i g a t i o nr e a c t i o n t h e n ，p c rw a su s e dt oa m p l i f yt h el i g a t e dl d r p r o b e s f o rs i g n a le n h a n c e m e n t t h eg e n o t y p e so fe a c hl o c u sw e r ei d e n t i f i e d a c c o r d i n gt o r e s u l t so f g e le l e c t r o p h o r e s i s as e r i e so fl c n s a m p l e sw e r ep r e p a r e db yd i l u t i n gt h es t a r t i n gd n a ( 5 0 0 ，1 0 0 ， 5 0 ，4 0 ，3 0 ，2 0 ，a n d1 0p g # l ，r e s p e c t i v e l y ) a tt h ef i r s ts t e p ，a m p f ls t r l d e n t i f i l e r p c ra m p l i f i c a t i o nk i tw a su s e dt o t e s tt h el c ns a m p l e s a tt h es e c o n d s t e p ， r s l 7 7 5 0 3 0 3l o c u sw a ss e l e c t e d ，a n da l l e l i c p a d l o c kp r o b e s ( c p pa n da p p , c o r r e s p o n d i n gt oc a l l e l ea n da a l l e l er e s p e c t i v e l y ) w e r ed e s i g n e d p a d l o c kp r o b e s w e r eu s e dt od i s c r i m i n a t ea l l e l e sb yt h e r m o s t a b l el i g a t i o nr e a c t i o n t h e n ，h r c aw a s u s e dt oa m p l i f yt h ec i r c u l i z e dp r o b e sf o rs i g n a le n h a n c e m e n t t h eg e n o t y p e so fe a c h l o c u sw e r ei d e n t i f i e da c c o r d i n gt or e s u l t so fg e le l e c t r o p h o r e s i s r e s u l t s 1 、a f t e rg e n o m i cd n aw a su l t r a s o n i c a t e d ，t h ea v e r a g es i z e so fd n a f r a g m e n t s v a r i e ds i g n i f i c a n t l y t h er e p e a t a b i l i t yo fu l t r a s o n i c a t i o nw a sp o o r a st h e d i g e s t i n gt i m e e x t e n d e d ，t h ea v e r a g es i z e so fd n af r a g m e n t sr e d u c e dg r a d u a l l y a f t e rl g gg e n o m i c d n aw a sd i g e s t e dw i t hd n a s eif o r15 0m i n ，t h ef r a g m e n ts i z e so fd e g r a d e dd n a w e r en o tm o r et h a n1 0 0b p 2 、u s i n ga m p f l s t r l d e n t i f i l e r p c ra m p l i f i c a t i o nk i t ，n os t ra l l e l e sc o u l d 7 b eo b t a i n e df r o mt h ed e g r a d e dd n aw i t hf r a g m e n ts i z e sl e s st h a n1 0 0 b p u s i n go u r l d r p c rm e t h o d ，c l e a ra l l e l i cd i s c r i m i n a t i o no fe a c ht a r g e tl o c u sw a sa c h i e v e da f t e r s t a i n i n go ft h ef i n a lr e a c t i o nm i x t u r e sw i t he ba n dv i s u a l i z a t i o nb yu v i l l u m i n a t i o n t h et y p e so fb a s ev a r i a n t sd i dn o ti n f l u e n c et h ef i d e l i t yo fd n al i g a s e t h e t a r g e t s p e c i f i cs e q u e n c eo fl d rp r o b e sc o u l db ea ss h o r ta s1 1n u c l e o t i d e s ，w h i c hd i d n o td i s t u r bt h el i g a t i o nr e a c t i o n 2o r4s n pl o c ic o u l db ec o r r e c t l yd i s c r i m i n a t e d s i m u l t a n e o u s l yi nt h es a m et u b e i n t e r a c t i o nb e t w e e np r o b e sc o u l db ea v o i d e de a s i l y w h e nm u l t i p l e xs n p st y p i n gw a sd o n e 3 、u s i n ga m p f ls t r l d e n t i f i l e r p c ra m p l i f i c a t i o nk i ta n do p t i m i z i n gp c r c o n d i t i o n sw i t h3 4c y c l e s ，a l ls t rl o c ic o u l db ed i s c r i m i n a t e dw h e nt h es t a r t i n gd n a w a sn o tl e s st h a n1 0 0 p g a l l e l e d r o po c c u r r e dw h e nt h es t a r t i n gd n aw a sn o tm o r e t h a n5 0 p g u s i n go u rl d r - h r c am e t h o d ，f i n a lr e a c t i o np r o d u c t sd e c r e a s e da st h e a m o u n to ft h es t a r t i n gg e n o m i cd n ad e c r e a s e d c l e a ra l l e l i cd i s c r i m i n a t i o nw a s a c h i e v e da sl o n ga st h eh o m o z y g o u sd n a ( a ao rc c ) w a sn o tl e s st h a n2 0p g 1 0 s a m p l e so fc ch o m o z y g o s i s ( 1 0 p go fe a c h ) w e r ed e t e c t e d a m o n gt h e m ，a c p h e n o t y p eo c c u r r e d i nt w o ，a n dn op r o d u c ti no n e w h e n1 0 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n c i p l e so fl d r p r o b e s a c c o r d i n gt ot h e s ep r i n c i p l e s ，t h es p e c i f i t y a n ds e n s i t i v i t yo fs n p st y p i n gw e r ea c h i e v e dw h e nh e a v i l yd e g r a d e dd n ao rt r a c e d n aw a st e s t e d i na d d i t i o n ，h i g ht h r o u g h p u ts n p s t y p i n gc o u l db ea c h i e v e dw i t ht h e m e t h o d sb a s e do nl d r k e yw o r d s f o r e n s i cd n aa n a l y s i s ；d n ad e g r a d a t i o n ；l o wc o p yn u m b e rd n a ；s i n g l e n u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m ；l i g a s ed e t e c t i o nr e a c t i o n ；p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ； h y p e r b r a n c h e dr o l l i n gc i r c l ea m p l i f i c a t i o n ；p a d l o c kp r o b e s 9 英文缩略语 英文缩写英文全称中文全称 s t rs h o r tt a n d e mr e p e a t m i n i - s t rm i