（分析化学专业论文）分子灯标pcr检测血清中乙型肝炎病毒的研究.pdf

南开大学硕士学位论文 膨 ab s t r a c t t h e t e c h n i q u e s o f n u c l e i c a c i d s h y b r i d i z a t i o n , w h i c h h a v e b e e n a p p l i e d in f o u n d a t i o n a l m e d i c i n e a n d c l i n i c a l d i a g n o s i s r e s e a r c h , r a p i d l y m a n i f o l d a l o n g w it h t h e d e v e l o p m e n t o f m o l e c u l e b i o l o g y a n d g e n e e n g i n e e r i n g t e c h n i q u e s . t h e p r o g r e s s o f h u m a n g e n o m e i t e m h a s g r e a t l y p r o m o t e d h u m a n m o r b i d d n a d i a g n o s i s a n d g e n e t h e r a p e u t i c a l r e s e a r c h . m o l e c u l a r b e a c o n s a r e n o v e l g e n e d e t e c t o r p r o b e s , w h i c h h a v e b e e n d e v e l o p e d i n t h e s e y e a r s . t h e y c a n r e p o rt t h e p r e s e n c e o f s p e c i f i c n u c l e i c a c i d s i n h o m o g e n e o u s s o l u t i o n s . mo l e c u l a r b e a c o n s a r e e x t r a o r d i n a r i l y t a r g e t - s p e c i f i c , i g n o r i n g n u c le i c a c i d t a r g e t s e q u e n c e s t h a t d i ff e r b y a s l itt l e a s a s i n g l e n u c l e o t i d e . t h e y c a n b e a p p l i e d i n d n a , r n a a n d p r o t e i n s t u d i e s . h e p a t i t i s b v i r u s ( h b v ) i n f e c t i o n i s a g l o b a l i n f e c t i o u s d i s e a s e . n o w t h e d e t e c t i o n o f h b v s e r o l o g i c a l m a r k e r s b y i m m u n o a s s a y i s s t i l l w i d e l y u s e d i n c l i n i c a l d i a g n o s i s o f h e p a t i t i s b , b u t l o w s e n s i t i v i t y i s t h e c o m m o n d r a w b a c k o f t h i s me t h o d . t h i s t h e s i s , c o m p o s e d o f 3 c h a p t e r s , m o s t l y i n v e s t i g a t e d t h e d e t e c t i o n o f h b v i n h u m a n s e r a b y a m o l e c u l a r b e a c o n / p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( p c r ) m e t h o d , a n d d i s c u s s e d t h e f e as i b i l i t y o f t h e t w o s i n g l e - l a b e l e d p r o b e s s y s t e m s i m u l a t i n g a m o l e c u l a r b e a c o n . 1 .t h e r e v i e w p r e s e n t e d t h e p r i n c i p le a n d c l a s s i f y o f t h e n u c l e i c a c i d s h y b r i d i z a t i o n , t h e c h a r a c t e r i s t i c s a n d a p p l i c a t i o n s o f m o l e c u l a r b e a c o n s . t h e c o rr e l a t i v e i n f o r m a t i o n o f h b v was a l s o s u mma r i z e d . 2 -a m o l e c u l a r b e a c o n c o m b i n i n g w i t h r o u t i n e p c r o r as y n n u e t ry p c r w a s u s e d f o r t h e d e t e c t i o n o f h b v i n h u m a n s e r a , a n d s a t i s f a c t o ry r e s u l t s w e r e o b t a i n e d . 3 -t w o s i n g l e - l a b e l e d p r o b e s s y s t e m s i m u l a t e d a m o l e c u l a r b e a c o n , a n d w a s u s e d f o r t h e d e t e c t i o n o f h b v i n h u m a n s e r a b y c o m b i n i n g w i t h r o u t i n e p c r . t h e m e t h o d a c h i e v e d a n a n t i c i p a t i v e e ff e c t . k e y w o r d s : m o l e c u l a r b e a c o n , p o l y m e r as e c h a i n r e a c t i o n ( p c r ) , h e p a t i t i s b v ir u s ( h b v ) . a s y m m e t ry p c r , t w o s i n g l e - l a b e l e d p r o b e s s y s t e m 南开大学硕士学位论文 绪论 第一章绪论 第一节核酸杂交的原理及分类 随着分子生 物学、 基因工程技术的 迅速发展， 核酸分子杂交技术在医学基础研究 和临床诊断与研究中的应用逐渐增多。该技术用于基因诊断和基因分离已经有2 0 多 年历史，己成为分子生物学、 分子遗传学、 肿瘤学、 病毒学和分子病理学研究的重要 手段之一。 1 . 1 . 1 核酸杂交的基本原理 自 从s o u t h e rn ( 1 9 7 5 ) 首次 进行d n a探针杂交后，至今核酸分子杂交己 成为分 子生 物学的 最基本方法。 双链的 核酸分子 在高 温或高ph 值条件下 变性分解为两条 单 链，当 温度或p h值逐渐恢复时， 根据碱基配对原则， 分开的两条单链会自 动地复性 成原来的双链结构， 这是核酸分子的一个基本生物化学特性。 即便是两条单链核酸分 子来自 不同的种属或品系， 只要它们的碱基序列是同源或部分同源， 也能全部或部分 复性形成新的杂种双链，这就是核酸分子杂交。 核酸分子杂交既可在d n a与d n a之间发生，也可在d n a与r n a之间发生。 我们主要研究的是d n a -d n a分子杂交。 这是一种很常用的、 十分敏感的检测技术 它的基本原理是利用了碱基互补原则和d n a变性、 复性特性。 d n a是一个互补的双 链 状分 子， 当 它 处于 一 定p h值 ( 高 于1 1 .5 或 低于2 .3 ) 或高 温 ( 9 0 0c - 1 0 0 之间) 的情况下，d n a双链之间的氢键断裂，使得 d n a分子以单链的形式存在，这就是 d n a的变性。 相反， 在去除变性因素之后，其单链的分子又遵循互补原则而重新相 互结合成双链，即 d n a的复性 ( 或称退火) 。如果在复性的过程中，加入带有标记 物 ( 如放射线同 位素)的能够与待测片段发生互补结合的单链d n a片段，即平常所 说的探针， 这种探针便可结合到单链d n a分子中与之互补的区段上。由于探针土带 有标记物， 故可通过一定的方式 ( 如放射自 显影) 检测其探针的结合情况。 这种用己 知的、 带有标记物的单链d n a片段 ( 探针) ，与被检的单链d n a互补结合的过程就 叫做d n a -d n a分子杂交。 由 于探针的碱基顺序是己 知的， 因 此， 通过d n a -d n a 分子杂交， 便可了 解到被检d n a中是否存在与探针同 源的序列d l 南开大学硕士学位论文 绪论 1 . 1 .2 核酸杂交的分类 m a t t h e w s和 k r i c k a 2 总结了各种杂交方法，将其归为两大类:异相杂交 ( h e t e r o g e n e o u s a s s a y ) 即固相 杂交和同 相杂交 ( h o m o g e n e o u s a s s a y ) 即 液相杂交。 所谓固相杂交， 是指将待测核酸结合在某种固相支持物上， 再与溶液中的标记 探 针进行杂交， 并通过一定的方法检测出杂交信号。由于核酸样品、 核酸的转移以及固 相支持物等的差异，固相杂交又可分为膜上印迹杂交和原位杂交两大类。 膜上印 迹杂交是通过印迹技术将待测核酸序列结合到一定的固相支持物上， 再与 标记探针进行杂交的过程，常用的方法有s o u t h e rn印迹、 n o r t h e rn印迹和点杂交等。 ( 1 ) s o u t h e rn印 迹杂交3 1 : 1 9 7 5 年s o u t h e rn首先建 立了 该方法。 基本 过程是: 用酚提法从待检组织中提取d n a ;限制性内切酶将d n a分子酶解;琼脂糖 凝胶电 泳使d n a按分子量大小分离;通过碱变性方法使凝胶中的d n a分子解链; 采用吸印法将变性的d n a从凝胶中转移到硝酸纤维滤膜上， 膜烘干后与同位素标 记的 特异性探针杂交;放射自 显影， 在x光片上观察结果。 该方法主要用于特异 性基因的检测和基因定位， 如病毒、 癌基因等。 其优点是可观察待测分子的分子量大 小，从而可以判断基因存在状态，如病毒基因是整合于细胞d n a之中，还是以游离 状态存在于细胞之中。 ( 2 ) n o rt h e rn印迹杂交:1 9 7 6 年a l w i n e 建立了该方法。 其检测过程与s o u t h e rn 印迹杂交基本相同， 所不同的是用d n a探针检测经凝胶电泳分开的r n a分r 。它 主要用于研究基因的转录活性及表达。 ( 3 ) 点 杂交 4 1 : 基 本 过 程是 将待 测 核 酸( d n a或r n a ) 或 含有 待测 核 酸的 血 清 点在硝酸纤维滤膜上， 经碱变性处理后按s o u t h e r n 印 迹杂交的方法杂交。 该方法主要 用于检测血清、 体液中的病毒核酸和特异性基因( 如癌基因) 及其表达。该 方法没有 转移这一步骤，因此较印迹杂交方法简单。 原位杂交:被检的d n a不需从组织、细胞或染色体中分离出来，而是在其本身 的位置上被变性为单链d n a ， 然后与单链探针d n a进行杂交反应和放射自 显影或其 他显色处理。分为光镜原位杂交和电 镜原位杂交。 ( 1 )光镜原位杂交:适用于冰冻切片，石蜡切片和组织培养细胞片。基本过程 是: 盐酸处理使d n a变性; 蛋白 酶消化; or n a酶消化( 防止r n a与探针d n a 非特异杂交) ;杂交: 反射性自 显影 ( 同位素标记探针) 或显色 ( 生物素标记 探 南开大学硕士学位论文 澎” 论 针) 。 其优点是: 敏感度高， 可检测到每个细胞中几个拷贝水平， 并且组织用量少; 定位准确， 可观察病毒或其它基因在组织中的分布特点及其病理变化的关系; 若 与免疫组化结合， 可在组织切片中同时观察病毒墓因及其表达产物的分布状态和相互 关系。 缺点是不能表明 在细胞核中检出的病毒基因的存在状态。 ( 2 )电镜原位杂交;把生物素标记的探针原位杂交与免疫电镜技术相结合，在 卵白 素上标记胶体金颗粒， 当 其与杂交体中的生物素结合后， 在电 镜下观察胶体金颗 粒 ( 杂交信号)的分布。可用于观察亚细胞结构中病毒基因的分布，其特异性很强。 在固相杂交中， 探针非特异性结合于支持物表面，降低了灵敏度。而且这种方法 操作复杂，费时费力。同 相杂交则不需支持物，减少了固定目 的d n a及除去未杂交 探 针 等 操 作。 h e l le : 和m o r ri s o n ( 1 9 8 2 ) 5 最 早 进 行了 同 相杂 交 试验。 他 们的 试 验中 使用了两个探针， 这两个探针分别与目 标d n a的两个相邻区域互补， 第1 探针在3 末端标记， 第2 探针在5 末端标记，根据标记物的光谱特性，使第 1 标记物为第2 标记物的能量供体。当探针与目 标d n a杂交时，两探针彼此靠近，光吸收或化学反 应激发供体标记物， 通过能量转移引起受体标记物的激发， 这样， 第1 标记 物发射光 的减少以及 ( 或)第2 标记物发射光的增加标志着目 标d n a的存在。 后来m o r r i s o n 等 6 1 扩展了 这一方 法， 他们使 用的 两 个探针互补且相应于目 标d n 人 上同一碱基序列，一个探针在 5 末端标记荧光素，另一互补探针在 3 末端标记 荧光 素 发 射的 碎 灭 剂 花 丁 酸 ( p y r e n e b u t y r a t e ) 或 磺基 若 丹明1 0 1 ( s u l f o r h o d a m i n e 1 0 1 ) 0 无目 标d n a时，两探针结合，荧光素的能量转移至碎灭剂，不产生荧光。存在目 标 d n a时，探针与目 标d n a之间竞争杂交，由于探针与目标d n a的结合，在4 9 4 - 4 9 6 n m光照下，产生荧光，目 标 d n a浓度越高，荧光信号越强，最低可检测到 4 p m m o l / l的目 标 d n a 。 此方法已 经得到了 一 些应用7 ,8 1 ， 但是 仍然不能 满足实时 监 测及在活体细胞中应用的要求。 人类基因组项目的发展， 已 迅速推动了 人类疾病的d n a诊断及荃因治疗的研究 现在， 对 疾病的 诊断已由 第二代的 免疫诊断 逐渐过渡到了 第三代的 基因 诊断 9 1并 发 现了 越来越多的 在人 类疾病中 扮演着重要 角色的 遗传突 变 1 0 , 1 1 作 用， 这些遗传突变， 在很多情况下都小到只有一个核营酸的 取代存在。 实现对这些突变作用的检测， 无疑 将有助于人类遗传疾病的诊断和防治。目 前， 人们对于这些突变体的检测主要集中在 核酸链向 补体的退火。 这是一类非常专一的分子识别现象， 它己 被广泛地应用于基础 研究。 为了 对核酸的 合成过程进行实时监测， 以 及在活体细胞内 标记核酸， 人们开发 南开大学硕士学位论文 嚼 绪论 了一系列无需分离的均相核酸探针。 这些探针与p c r联用所形成的实时基因检测技 术，是一种简便而快速的自 动化方法，己在临床检测中得到应用。 p c r( 聚合酶链反应) 技术又称体外基因 放大技术， 是一种模拟生物体内 天然基 因复制过程， 在体外通过d n a聚合酶将目 的墓因快速而可靠地进行多次反复合成的 技术， 被广泛地应用于获取特定基因或基因片段及临床诊断研究等领域。 下面简要介 绍几种实时定量 p c r技术，它们的主要区别在于所采用的均相探针的设计机理。 ( 1 ) a m p l i s e n s o r p c r : 是一种复合探针技术，一个探针上连接一种荧光物， 另 一探针连接一碎灭物。两探针长度不同， 其中碎灭物标记探针 5 端多出7 个碱基。 p c r扩增前需将荧光物标记探针与一个半套式p c r引物连接， p c r引物的5 末端应 有 一 段 与 长 探 针 互 补的 序 列， 以 便 连 接 酶 将 该引 物 与 短 探 针 连 接。 扩 增 时 该 探 针 一 引 物复合物作为半套式引物渗入到模板， 从而释放出碎灭探针部分， 产生荧光。 荧光的 强 度与 扩增时加入的 模板数成正l l 1 2 , 1 3 0 ( 2 ) t a g m a n p c r : 它 利 用了t a q 酶的5 外 切酶 活 性， 即t a q 酶 具有 天 然的5一 3 核酸外切酶活性，能够裂解双链d n a 5 端核昔酸，释放出单个或寡核昔酸，裂解 的最佳底物是被置换了的具有叉样结构的 单链 d n a ，水解作用发生于结合了 置换部 位 的 磷 酸 二 酷 键 处 p 4 1 。 基 于伽 酶 的 这 种 活 性， 设 计 合 成 一 个能 与p c r 产 物 杂 交的 探针， 该探针的5 端标记一个荧光分子， 3 端标记另一个荧光分子。 其中3 端荧光分 子能够吸收 5 端荧光分子发出的荧光，因此，正常情况下该探针检测不到 5 端荧光 分子发出的荧光， 只能检测到3 端荧光分子的荧光信号， 但当溶液中有p c r产物( 模 板) 时， 该探针与模板退火，即 产生了 适合于核酸外切酶活性的底物， 从而激活t a q 酶的 5 外切酶活性，将探针 5 端连接的荧光分子从探针上切割下来，破坏了两个荧 光分子间的荧光共振能量转移，从而发出 荧光。 切割的荧光分子数与p c r产物的数 量成比例，因此，根据p c r反应液的荧光强度即可算出初始模板的数量。 ( 3 ) l i g h t c y c l e r : 将荧光分子和碎灭分子分别标记在两个不同的 探针上， 产生发 光探针和碎灭探针，发光探针的5 端连接荧光分子;碎灭探针的3 端连接碎灭分子 由于两探针设计时可与模板同一条链相邻的序列杂交， 杂交时两探针的荧光分子和辞 灭分子便紧密相邻， 从而发生荧光共振能量转移而使荧光碎灭。 荧光碎灭的程度与起 始 模板的 量成反比 ，以 此可以 进行p c r定量 分析 5 一 ， 7 。 ( 4 )分子灯标:将在下一节详细介绍。 南开大学硕士学位论文 澎 绪论 第二节分子灯标 分子灯标( m o l e c u l a r b e a c o n ) 是近年来发展起来的一种新型基因 检测探针 i r 1 , 它可以在均相系统中精确地识别出 特定的靶标， 并具有极高的特异性， 准确到一个核 昔酸的 水平， 可用于d n a , r n a及蛋白 质的 研究 1 7 -3 1 操作简单安全， 检测方 便迅 速， 尤其适用于难以 将探针一靶杂交体从过量的杂交探针中分离出 来的 情况 3 2 1 ， 应用 前景十分广阔。 1 . 2 . 1 分子灯标的结构和作用机理 分子灯标是一类茎 一环结构的 单链寡核昔酸探针， 它的环部由 一段与靶基因 互补 的探针序列构成， 是分子灯标的基因识别部位。 探针序列的两端是两段与靶基因无关 的相互互补的臂序列， 它们之间退火形成发夹型的茎。 荧光基团和碎灭基团分别连接 在 两 条 臂 的 末 端 18 1 分子灯 标是在d n a杂交 技术 和荧光能 量转移原理3 3 ,3 4 的 基础上开发出 来的 一类 探针3 5 。 其 构象的 变化完全可以 通过自 身的荧光 直接反映出 来3 6 ， 在游离 状态f ， 分子灯标以茎一环结构存在， 发夹型的茎使荧光基团和碎灭基团相互接近， 致使荧光 基团的荧光通过能量转移而被v - 灭。 由于使用的碎灭墓团是非荧光的生色团， 它可以 把从荧光基团中获取的能量以热的形式释放出去， 因而无荧光现象， 换句话说， 整个 分子灯标是“ 黑” 的。 但当有与之完全匹配的靶基因存在时，分子灯标的探针序列 与靶基因 特异性结合， 形成探针一靶杂交体， 该杂交体要长于茎杂交体， 且具有更好 的稳定性。 同时， 探针一靶杂交体的刚性双螺旋结构排除了茎杂交体同时存在的可能 性。 这样， 分子灯标就经历了自 发的构象识别过程， 迫使茎部的发夹结构打开， 荧光 基团和碎灭基团相互远离， 荧光分子发出的荧光不能被碎灭分子吸收， 体系荧光复原 18 ( 图1 .2 . 1 ) 。 由 于 未 杂 交的 分子 灯 标 仍 保 持原 来的 发 夹结 构， 不 发 射 荧光， 在 观察 探针的杂交作用时无需将探针一靶杂交体与过量的分子灯标分离。 1 . 2 . 2 分子灯标的理化性质 由于存在发夹型的茎，分子灯标同样具有双股d n a的变性和复性性质，提高体 系 的 温 度、 改 变p h 值 或加 入 变性 剂 等 均可 使茎 杂 交 体 解 链3 7 。 其中 分子 灯 标的 热 不 - m 3 f)* k i * r c z一 一 一 一 一 臀m i 稳定性尤其引 人注目 。 单独存在时， 分子灯标在低温下表现为封闭的茎 一环构象， 荧 光基团和碎灭基团相互接近， 分子灯标不发射荧光。 然而， 当 温度升高到一定程度时， 分子灯标的构象发生变化， 茎部的螺旋结构让位给无规则的线团构象， 荧光基团和碎 灭 基团 相互远离， 体系荧光强度 增强3 8 1 ( 图1 .2 .2 : 轨 迹a ) 。 这两 种构象之间的 转变 温度称为分子灯标的 熔点。该熔点的高低与茎杂交体的长度、 g -c 碱基对的含量及 溶 液中 的 盐 ( m g z + ) 浓 度 有 关 1 8 e 靶基因 分子灯标 杂交体 荧光基团 碎灭基团 图1 .2 . 1 分子灯标的作用原理 游离状态下， 分子灯标为 封闭的茎 一环结构， 整个分子灯标是“ 黑” 的。 当它与 靶基 因形成杂交体时，荧光基团和碎灭基团相互远离，体系荧光复原 在靶基因 存在时， 分子灯标在不同 温度下主要表现为三种状态: 探针一靶杂交体、 游离的发夹构象、游离的无规则线团构象 ( 图1 . 2 .3 ) 。 在低温条件下，分子灯标与靶 基因形成稳定的杂交体， 杂交体中的分子灯标是打开的， 呈现出较强的荧光， 未杂交 的分子灯标则保持封闭构象而不发射荧光。 当温度升高时， 部分氢键遭到破坏， 探针 一靶杂交体的 稳定性降低， 分子灯标被释放出来并还原为封闭构象， 荧光降 低， 这两 种状态之间的转变温度称为探针 一靶杂交体的熔点。 随着温度的进一步升高， 封闭的 分子灯标熔解为无规则的线团构象， 这一转变温度即为分子灯标的 熔点3 8 图1 .2 .2 : 轨迹b ,c ， 图 1 .2 .3 ) . 南开大学硕士学位论文 叠 绪论 2. 5 c nlll匀 甲. 2月es工 1 . 0 熟一。u。lu一eoueosoonl卜 二d 0. oa一妇。-口巴 o l 二 图1 . 2 .2 分子灯标及其杂交体的 温度变性曲 线 a 为分子灯标单独存在时的温度变性曲 线，该例中分子灯标的熔点为5 4 0c ; b 为分子 灯标与完全匹配的靶形成的杂交体的温度变性曲线， 该完全匹配的探针一靶杂交体的 熔点为4 2 0c ; c 为分子灯标与单个核昔酸错配的靶形成的杂交体的温度变性曲线， 该 错配的探针一 靶杂交体的熔点为2 8 c . 了誉 状态 ， 状态2 状态3 图1 .2 .3 靶基因存在时分子灯标的状态 1 为稳定的探针一靶杂交体;2 为游离的发夹构象;3 为无规则的线团构象 月.心. ，j.口.口.、j.，月下. 南开大学硕士学位论文 澎 绪论 分子灯标的一个最吸引 人的 特点就是高度的识别专一性。 与具有相同 序列的线性 探针相比， 分子灯标与靶基因的结合有更加严格的专一性， 它可以很容易地区分出靶 序列中单个碱基的错配、 缺失或插入突变。 分子灯标的高度专一性与其固有的发夹结 构有关(3 8 ,3 4 1 ， 因为探针一靶杂交体的刚性双螺旋结构排除了与茎杂交体同时存在的可 能性， 所以在靶基因存在时， 探针一靶杂交体与茎杂交体相互竞争而存在。 当靶基因 与分子灯标的探针序列完全匹配时， 探针一靶杂交体的稳定性要优于茎杂交体， 分子 灯标主要以探针一靶杂交体的形式存在， 体系发出强烈的荧光; 而当靶基因与探针序 列不完全匹配， 甚至只有一个核普酸错配时， 探针一靶杂交体的稳定性都会明显降低， 此时分子灯标主要以 茎杂交体的形式存在， 体系不发射荧光。 研究表明， 专一性的增 加是构象受限 制的分子探针的共同 特征3 8 1 最 近， b o n n e t 及t y a g i 等 人 3 8 1 从 热 力 学 的 角 度 对 分 子 灯 标的 高 度 专 一 性 进 行了 研 究。 从分子灯标及其杂交体的 温度变性曲 线 ( 图 1 .2 .2 ) 我们不难看出，完全匹配的 探针一靶杂交体的 熔点明 显高于错配的探针一靶杂交体， 在这两个熔点之间， 分子灯 标可以与完全匹配的靶形成杂交体而发射荧光， 与错配的靶则不能形成杂交体而保持 原来的构象， 所以在这一温度范围内， 分子灯标可轻易地将匹配的与错配的靶区分开 来4 0 1 。 与线性探针相比， 分子灯标与匹配的靶能形成杂交体而与错配的靶不能形成杂 交体的温度范围要宽的多，因而分子灯标识别靶基因的能力也要强的多。 1 .2 . 3 分子灯标的设计及合成 在与靶的杂交作用中， 分子灯标从一种构象变化到另一种构象， 而影响这种构象 变化的主要设计参数有两个， 即臂序列的长度及探针序列的长度。 在分子灯标的设计 中既要保证臂序列足够长， 以 便能形成稳定的茎杂交体， 同时又要保证臂序列足够短， 以 便 在 探 针 与 靶 杂 交 时 ， 发 夹 型的 茎能 够 解 缔。 研 究 发 现， 在m g 2 + 的 存 在 下 ， 4 - 1 2 个核 昔酸长 度的 臂 序列一般 可以 满 足上述要求 1 8 1 。 探 针序列的长 度至少要 为臂序列长 度的两倍 ( 一般为 1 5 - 3 0个核昔酸) ，以 保证在杂交时能够发生构象的变化，同时又 能保证杂交后碎灭基团与荧光基团的距离足够远，它们之间不再发生荧光能量转移 18 1 。 另外， 还应对探针序列及臂序列上的 核昔酸进行仔细地检查， 既要防止探针 序列 参与 形 成发 夹型的 茎3 2 1 ， 又要尽量 避免臂 序列与探针序列 之间的 相互作 用p i t 。 对于 分子灯标是否真正体现了设计的 特征， 在实验中 还应结合温度变性曲 线进行具体的考 j日.，口口.，.叨.，“月月 南开大学硕士学位论文 绪论 察 3 2 1 对于分子灯标中的荧光一碎灭对来说， 最理想的情况是当它们相互接近时完全不 能发光。对荧光一碎灭对的选择，k r a m e r小组最初依据的是碎灭基团的吸收光谱与 荧光基团的发射光谱尽可能重叠的原理。 但随后他们发现， d a b c y l( 二甲氨基偶氮 苯甲 酸) 可以 作为 分子 灯标中 任何荧 光基团的 碎灭基团 4 2 1 ， 且碎灭效 率比 一般的 荧光 能 量 转 移都 要高 14 1 1 。 这 样， 以d a b c y l 及 不同 的 荧 光 基团 进 行 标记， 可以 得 到一 系 列不同颜色的分子灯标 ( 表1 .2 . 1 ) 。当这些分子灯标的探针序列各不相同时， 就可以 在同一溶液中同时检测多种靶基因的存在。 表1 .2 . 1 分子灯标中常用的荧光分子 荧光分子最大激发波长 ( nn) 最大发射波长 ( nn)荧光颜色 香豆素3 5 34 2 2 蓝色 e dans3 3 6 4 9 0蓝绿色 荧光黄4 9 55 1 5 绿色 四甲基罗丹明5 4 45 7 6 橙色 德克萨斯红5 8 36 0 3 红色 分子灯标合成的起始物为一段寡聚核昔酸链， 它的5 端为一个用三苯甲游基保护 起来的疏基基团，3 端则为一个伯氨基基团。首先利用d a b c y l的一种可以与氨基 反应的衍生物形式 ( 如d a b c y l的唬拍酞亚胺酷) 将d a b c y l共价地连接在伯氨 基上， 并将偶联有d a 13 c y l的寡聚核昔酸进行h p l c纯化。 然后从5 琉基上移走保 护性的三苯甲 游基，并与荧光基团的碘乙酞胺衍生物反应在该位置上引 入荧光基团。 最 后 经h p l c 纯 化 得 到 预 期 的 分 矛 灯 标。 目 前 ， 由 于 有 了 一 种 能 在 寡 聚 核 昔 酸 链 的3 端引入d a b c y l的控制性微孔柱，使分子灯标的合成可以 完全在一个d n a合成仪 上 进行。 最 近， m u l l a h 等人4 3 1 利用d a b c y l 标记的c p g支撑 物及荧光素的亚 磷酞 胺成功地进行了分子灯标的高效自 动合成。 1 . 2 . 4 1 . 2 . 4 . 分子灯标的应用 1 对特定核酸的 合成进行实时 ( r e a l - t i m e ) 监测 利用与预定放大区 域中某一段序列互补的分子灯标探针， 可对特定核酸的合成进 行实时监测【4 4 1 。 分子灯标的温度变性特征使其尤其适用于p c r的实时监测。 在高 温 ，一 3ft.0k t it iyc - 一-一叠m it 变性阶段， 分子灯标以 无规则线团 构象存在。 而在体系温度降 低到引 物的退火温度时 ( 该温度低于分子灯标及探针一靶杂交体的熔点) ，分子灯标又会迅速地复原为茎一 环构象。 分子内发夹结构的形成可在不到1 微秒的时间内完成， 这一时间远远低于改 变体系温度所需的时间 1 8 1 。 若溶液中 有靶基因 存在， 分子灯标在此温度下会自 发地与 靶基因作用形成杂交体而发出荧光， 多余的分子灯标则仍保持原来的构象， 不会发光。 当温度上升到引物的扩增温度时， 分子灯标就会从靶基因上解缔下来而不会对聚合作 用产生干扰。由 此可见， 在每一轮温度循环的退火阶段都会发生新的杂交作用， 而得 到的荧光强度又与体系中靶基因的浓度成正比， 因此可以通过对这一阶段的荧光测定 而达到对扩增过程进行实时监测的目的。 分 子 灯 标 在 等 温 条 件下 也 有广阔 的 应 用前 景 0 5 0 8 1 , l e o n e 等 人 将分 子 灯 标 探 针与 n a s b a( 一种核酸的等温放大方法) 的放大作用相结合， 建立了一种对r n a进行实 时测定的均相分析方法。 他们将该方法用于马铃薯块茎提取物的研究中， 轻易而明确 地将p l r v感染的块茎与未感染的块茎区分开来。 该方法除了 在样品的诊断分析上有 广阔的应用前景外， 还有望应用于基因表达及细胞活性等生理活动的研究。 同时，由 于荧光信号的增长与产物的增加是同步进行的， 分子灯标在等温放大过程中的应用在 对序列专一性信息 进行联 机测定上显示了 极大的 优势4 5 1 无论是在p c r中， 还是在等温条件下， 用分子灯标进行产物的测定都具有快速、 灵敏、操作简单等优势。另外，由于分子灯标具有 “ 无需分离而进行测定”的特点， 产物的放大和测定都可以 在一个封闭的容器内 进行， 这样就极大地降低了交叉污染的 危险性。 1 . 2 . 4 . 2 临床样品中 病毒粒子及特定基因的 测定 4 9 - 5 8 1 鉴于分子灯标的高度识别专一性，可将其应用于复杂体系中 特定靶基因的 测定， 而不受其它组分的干扰。 由于被测样品中靶基因的含量一般都很少， 所以通常将p c r 反应与分子灯标结合使用。 根据放大过程中是否有荧光信号的产生来判断被测样品中 有无靶基因的存在。 在将不同拷贝数的样品模板分别加至含有分子灯标的p c r管内， 分别进行扩增循环一荧光曲线的实时测定时发现， 随着模板拷贝数的增多， 扩增过程 中在背景基础上产生可测荧光信号时 所需的临界循环数 ( c 7 ) 减少， 且c 值与模板 分子初始量的对数值成反比 1 8 1 ， 据此可以 对样品中原有的靶基因拷贝数进行定量测 * f k * a t * it il y 一 一 臀一 竺一 罗丹明 标记的 分子灯标能 够与产生的放大区域结合，在放大过程中只产生红色荧光; 如果以杂合个体的d n a样品为模板，则绿色和红色荧光在放大过程中同时产生。 如果测定区域内突变的可能性增多， 使用的分子灯标的种类也要随之增加， m a r r a s 6 5 和k o s t r ms 6 6 1 都曾 使 用四 种 不同 颜色的 分子 灯 标 进行了 单 核 昔酸 突 变作 用的 测定。 但是，当突变可能性过多时 ( n 4 ) ， 继续使用上述方法进行测定显然是不实际的。 它 不仅会因为使用的探针的量过多而造成背景信号偏高等问题， 而且实验费用也过于昂 贵 。 为 此， 最 近v o g e ls t e n 6 7 1及z h o u 6 8 各自 设 计出了 将 数字 化p c r ( d i g - p c r ) 与 分子灯标联用的方法， 他们仅使用了两种不同颜色的分子灯标， 一种与靶基因上可能 发生突变作用的某一区 域的 野生序列互补，以 绿色荧光团标记 ( 灯标 1 ) ;另一种则 与该靶基因上不存在突变作用的另一区域互补，以 红色荧光团标记 ( 灯标 2 ) , 根据 p c r产物存在时两种分子灯标所产生的荧光强度的比值，确定是否存在突变作用。 就灯标2 来说，无论靶基因中是否存在突变作用，它都可以与放大产物有效地结合， 产生较强的红色荧光。 而灯标 1 产生的荧光的强弱则取决于靶基因中是否存在突变作 用。 实验表明， 当靶基因中存在突变作用时， 红色荧光与绿色荧光的比 值要明显高于 不 存在 突变作 用时的比 值。 v o g e l s t e n 及k i n z l e r 使用 这种方法成功地对存在1 2 种突 变可能 性的某一区域进行了 检测。 该方法极大地减少了 所需要的分子灯标的种类， 但 它只能判断突变作用存在与否，而不能具体确定突变的类型。 当然， 也可以 用同一荧光团标记的带有不同 探针序列的分子灯标进行等位基因的 检测6 9 1 ， 这需要将检测试样平均分成若干份， 每份中加入一种分子灯标探针， 根据加 入何种分子灯标时可以 观察到可测的荧光信号来具体判断存在何种等位基因。 另外，需要说明的是:作为寡核昔酸探针，分子灯标具有极佳的识别专一性，但 如果探针序列过长，则分子灯标探测单核昔酸错配的能力就会下降。 一般来说， 2 5 个核普酸的探针序列可以容纳一个错配的碱基对，而3 3 个核昔酸的探针序列则可以 容纳两个碱基对的错配。 如果要以 单碱基对的准确性对中等长度的d n a序列进行突 变分析，则要将这段d n a序列分成若干段， 分别构建相应的分子灯标。临床研究发 现， % % 的 结 核 菌 对 利 福霉 素的 抗 药 性与r p o 13 基因中 一 个8 1 b p 区 域内 的 核酸 突 变 有 关。 p i a t e k 等人 7 o 将 这段区 域分为5 段 ( 相邻两段间 有1 - 3 个碱基的 重叠) ， 分别 构 建相应的分子灯标( 1 5 - 2 0 n t ) ， 借助于分子灯标p c r法对结核菌耐药性进行了目 测测 定。 在检测的7 5 个结核菌临床样品中， 5 2 个样品在这段区域内存在突变体， 为利福 霉素抗性菌株:另2 3 个不存在突变作用，为利福霉素敏感菌株。该结果与d n a指 南开大学硕士学位论文 澎 绪论 纹分析 和r p o b 基因 测序以 及细菌药敏实 验结果完全一致。 1 .2 .4 . 4 在活体细胞中的 应用7 4 -7 6 1 尽管人们早就意识到寡脱氧核昔酸可以 通过与互补性的 m r n a的杂交作用对基 因表达产生千扰，进而妨碍翻译过程的进行或对 m r n a造成物理性破坏，但由于在 活体细胞内验证反义寡脱氧核昔酸与m r n a靶的杂交作用非常困难，所以，到目 前 为止，能够对核昔酸与m r n a的体内杂交作用提供直接性物理证据的研究还很少。 分 子 灯标由 于 有荧 光基团 和碎灭 基团 的 保护， 可有效 地抵御细胞内 各种 酶的降 解 7 4 1 同时， 随着近年来激光共聚焦技术的发展， 可以 检测到几个分子的荧光素。 所以 可用 微注射技术将分子灯标注入单个活细胞中，对细胞内 特定的m r n a的起源、活动以 及 存在进行 特异 性追踪3 5 ,7 5 1 ， 而无 需杀 死细胞。 s o k o l 等人7 6 在对 用分子 灯标进 行活 体细胞中d n a - r n a杂交作用的实时测定上做了成功的尝试， 他们发现用分子灯标 进行细胞内r n a的测定具有极高的灵敏度， 可以 测出2 0 -2 0 0 p m o l 的r n a ， 完全可 以 用于 在活体细胞内 直接 验证杂 交体的 形成。 m a t s u o 7 4 1 则借助于 分子 灯标， 对活体细 胞内 碱性成纤维细胞成长因 子的m r n a的代谢转运过程进行了 研究，从而为测量活 体细胞内 特定m r n a水平的变化开辟了一个新途径。 分子灯标在活体细胞中有着广阔的应用前景， 它除了可以 对细胞内寡聚核昔酸的 分类机理进行研究、 对易形成杂交体的 位置进行准确定位外， 还可以 找出r n a分子 中易接近的区域， 从而指导反义寡脱氧核昔酸对其进行破坏， 以便从基因的角度对疾 病进行治疗， 推动基因药物的开发研制。 另外， 分子灯标在报道病毒的入侵及突变性 m r n a转录作用的存在上也有广阔的应用前景。 “ 分子灯标” 的 概念是t y a g i 和k r a m e r 在1 9 %年首先提出 的， 在其出 现后的 短 短几年间， 人们对分子灯标的研究已经获得了迅猛的发展， 它已 经成为遗传学、 微生 物生态学、 致病机理及分子间相互作用等研究的有力工具， 同时在疾病的诊断及新药 的开发上也有着广阔的 应用前景。 最近， t a n 等人7 7 又设计了一类新型的分子灯标， 他借助于生物素一亲和素之间的相互作用， 对固定在固体表面的d n a杂交作用进行 了 研究， 从而 将分子灯 标的 应用扩展到了 体内 生 物学研究 及d n a传感器开发， -8 2 1 等 领域。 鉴于分子灯标在基因检测上的巨大优势， 国内的一些实验室也己开展了分子灯 标的 研究， 并取得了 丰硕的 成果， 如军事医学 科学院 放射医学研究所陈忠斌等人18 3 1 、日，皿皿月1，月1门.j泣口 南开大学硕士 学位论文 肇一绪 论 已成功设计合成了应用于病毒性疾病 ( h b v , h c v)和肿瘤检测的分子灯标，为这 一新技术在国内医学基础和临床应用研究奠定了基础。 马立人教授在新近出版的 生 物 芯片 8 4 1 中 也对分子 灯标 进行了 介绍。 分子灯 标检测技术是核酸检测方法上的 一 个 重要突破， 我们认为， 迅速开展分子灯标的研究， 无疑对发展我国基因检测和疾病诊 断领域具有重大意义和应用前景。 第三节乙型肝炎病毒的检测 乙型肝炎病毒感染是一种世界性传染病，我国是高流行区。 我国有 5 0 -7 0 % 的人 群受过乙型肝炎病毒的感染， 其中约有1 亿人口( 8 - 1 0 %) 为乙型肝炎表面抗原携带 者。 根据1 9 8 0 年全国 调查表明， 我国现有肝炎患者约2 0 0 0 万人， 其中6 0 %以 上为慢 性肝炎患者。 乙型肝炎病毒又与肝硬化以及原发性肝细胞癌密切相关， 我国同时也是 肝癌的高发国 家， 因此研究乙型肝炎病毒的分子生物学特点， 采用现代分子生物学技 术探讨诊断和防治方法，是十分必要的。 完 整 的 乙 型 肝 炎 病 毒( h a p a t iti s b v ir u s , h b v ) 即d a n e 颗 粒 8 5 ， 直 径4 2 n m ， 山 外膜和 核壳组 成， 后者含有一个 环状d n a分子、 d n a多 聚酶、 d n a结合蛋白 【8 6 并具 有蛋白 激酶活 性。 外膜 携带乙 型 肝炎 病毒表面抗原 ( h b s a g ) ， 核壳携带乙 型 肝 炎 病 毒 核 心 抗 原 ( h b c a g ) ; 当 血 清中 存 在 病毒 颗 粒时， 血清中 还 可发 现一 种与 核壳 有关的可溶性抗原， 称为乙 型肝炎病毒e 抗原( h b e a g ) a 现已 证实h b v有 许多亚型， 它主 要是 根据外