（果树学专业论文）龙眼胚胎发育相关基因F3H和FRK的克隆与分析.pdf

福建农林大学硕士学位论文摘要 摘要 本研究以“立冬本”龙眼合子胚为材料，采用r t - p c r 和r a c e 技术，克隆了 龙眼胚胎f 3 h 基因c d n a 全长和f r k 基因c d n a 片段，并对f 3 h 基因进行了 原核表达的研究和序列分析，对揭示龙眼胚胎发育与分化的分子本质，对进一步 利用基因工程技术培育优质果奠定实验基础。主要实验结果如下： l 采用r t - p c r 和r a c e 技术克隆了龙眼胚胎f 3 h 基因c d n a 全长 龙眼胚胎丹日基因e d n a 全长为1 4 0 4 b p ，其中包含l1 9b p 的5 非编码区 和1 8 7b p 的3 非编码区，编码3 6 5 个氨基酸，等电点为5 5 5 ，分子量为4 1 1 1 2 k d a 。对龙眼胚胎f 3 h 基因c d n a 编码产物进行分析，推断龙眼胚胎乃h 基因 为亲水性多肽。将该f 3 h 基因c d n a 序列与其它植物f 3 h 基因c d n a 进行比较， 结果表明，龙眼胚胎f 3 h 基因e d n a 序列与许多植物的f 3 h 基因具有很高的同 源性，与棉花乃日的同源性达8 4 ，与柑橘f 3 h 的同源性达8 2 ，与草莓f 3 h 的相似系数达8 3 ，对其所推导的氨基酸序列进行分析发现，龙眼f 3 h 的氨基 酸序列与棉花f 3 h 同源性最高，达9 0 7 6 ，与葡萄的同源性达8 9 0 4 ，与柑橘 的同源性达8 8 4 9 。该基因在g e n b a n k 中登录号为e f 4 6 8 1 0 4 。 2 龙眼胚胎f 3 h 基因e d n a 的原核表达 将分离出来的龙眼胚胎f 3 h 基因e d n a 的编码区序列插入p e t - 2 9 a 载体上 构建原核表达载体，在细菌b l 2 1 细胞中进行原核表达。试验结果显示，该编码 区片段在原核细胞中不表达。推测是由于表达质粒和表达宿主菌选择不当，不适 合龙眼胚胎f 3 h 基因的表达。 3 采用r t - p c r 和r a c e 技术克隆了龙眼胚胎f r k 基因c d n a 片段 试验获得了一个长8 5 0b p 的f r k 基因c d n a 片段。经b l a s t 分析，龙眼 胚胎f r k 基因c d n a 片段序列与许多植物的f r k 基因具有很高的同源性。与 柑橘f r k 的同源性达8 7 ，与番茄f r k 的同源性达8 1 ，与拟南芥f r k 的同 源性达7 5 。该c d n a 片段在g e n b a n k 中登录号为e u 6 0 0 0 9 3 。 关键词：龙眼( d i m d c a r p u sl o n g a n al o u r ) ；黄烷酮一3 一羟化酶；果糖激酶；基因克 隆；原核表达 福建农林大学硕士学位论文 a b s t r a c t c l o n i n ga n da n a l y s i so ff 3 h a n df r k g e n e si n v o l v e di nd e v e l o p m e n t o f l o n g a n ( d i m d c a r p u s 励n g a n al o u r 0e m b r y o a b s t r a c t i nt h ep r e s e n ts t u d y , t h ef u l ll e n g t he d n ao ff l a v a n o n e3 - h y d r o x y l a s e ( f 3 h ) a n d c d n af r a g m e n to ff r u c t o k i n a s e ( f r k ) f r o ml o n g a n ( d i m d c a r p u sl o n g a n al o u t ) e m b r y ow e r ec l o n e db yr t - p c ra n d r a c e 1 1 1 er e c o m b i n a n tp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n v e c t o rp e t - 2 9 ai n s e r t e df 3 hg e n ew a sc o n s t r u c t e da n da t t e m p t e dt oe x p r e s si ne c o l i b l 21 i ts e tu paf o u n d a t i o nf o rd i s c o v e r i n gt h em o l e c u l a ri n b e i n go fd e v e l o p m e n t a n dd i f f e r e n t i a t i o ni nl o n g a ne m b r y o 嬲w e l la sa d o p t i n gg e n ee n g i n e e r i n gt e c h n o l o g y t oc u l t i v a t eh i g hq u a l i t yf r u i t lc l o n i n go ft h ef u l ll e n g t he d n ao ff l a v a n o n e3 一h y d r o x y l a s e ( f 3 h ) b yr t - p c r a n dr a c e t h ef u l l l e n g t he d n ao fl o n g a nf 3hi s14 0 4n u c l e o t i d e sl o n g ，i n c l u d i n ga t l o r fe n c o d i n g3 6 5a m i n oa c i d s ( m w - - - 4 1 11 2k d a , p i = 5 5 5 ) ，a5 u n t r a n s l a t e dr e g i o n o f1 1 9b pa n da3 f l a n k i n gs e q u e n c eo f1 1 8b p i tw a sc o n c l u d e dt h a tl o n g a nf 3 h i sa h y d r o p h i l i cp r o t e i n w h e nt h en u c l e o t i d es e q u e n c ec o m p a r e d 、航t hg o s s y p i u m h i r s u t u mf 3 hg e n ea n dc i t r u ss i n e n s i sf 3 h g e n ea n df r a g a r i ax a n a n a s s af 3 hg e n e ， i ts h o w e dt h a ti d e n t i t yw e r e8 4 a n d8 2 a n d8 3 r e s p e c t i v e l y ，n l ec o m p a r i s o n b e t w e e nt h ep u t a t i v ea m i n oa c i ds e q u e n c ew i t l lg o s s y p i u mh i r s u t u mf 3 ha n dc i t r u s s i n e n s i sf 3 ha n dv i t i sv i n i f e r af 3 hs h o w e dt h a ti d e n t i t yw e r e9 0 7 6 a n d8 9 0 4 a n d8 8 4 9 ，r e s p e c t i v e l y t h i sc d n ah a sb e e nr e g i s t e r e di ng e n b a n k 谢t ha c c e s s i o n n u m b e re f 4 6 810 4 2e x p r e s s i o no fl o n g a nf 3 h p r o t e i n si ne c o l i t h el o n g a nf 3 hg e n ee d n aw a si n s e r t e di n t ot h ev e c t o rp e t - 2 9 a 飞k e x p r e s s i o nc o n s t r u c tw a st r a n s f o r m e di n t ob l 2 1a n dw a si n d u c e d 啊1 er e s u l ts h o w e d t h a tl o n g a nf 3 hg e n eh a sf a i l e dt oe x p r e s s i tw a sc o n c l u d e dt h a tt h ee x p r e s s i o n v e c t o ra n dh o s tw e r en o ts u i t a b l ef o re x p r e s s i o no fl o n g a nf 3 h 3c l o n i n go fc d n af r a g m e n to ff r u c t o k i n a s e ( f r k ) b yr t - p c ra n dr a c e a8 5 0b pe d n af r a g m e n tw a so b t a i n e d c o m p a r e dv v i mf r k so fo t h e rp l a n t s ， l o n g a nf r kg e n ee d n ah a d8 7 ，81 ，7 5 i d e n t i t yw i t l lm a to fc i t r u ss i n e n s i s ， l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u ma n da r a b i d o p s i st h a l i a n af r kg e n e s ，r e s p e c t i v e l y t i l i se d n as e q u e n c eh a sb e e nr e g i s t e r e di ng e n b a n k 、 行t ha c c e s s i o nn u m b e r e i j 6 0 0 0 9 3 福建农林大学硕士学位论文a b s t r a c t k e y w o r d s ：l o n g a n ( d i m d c a r p u sl o n g a n al o u r ) ；f l a v a n o n e3 - h y d r o x y l a s e ； f r u c t o k i n a s e ；g e n ec l o n i n g ；e x p r e s s i o ni ne c o l i i i i 福建农林大学硕士学位论文缩写词 英文缩写 a m p b p c d n a d e p c d n l l p d e b e d t a f 3 h f r k h i p t g l b m m n a a c n u p o d p c r p v p p r a c e r n a r n a s e r p m r r - p c r s s d s t r i s u p m x g a l 缩写词 英文全称 a m p i c i l i n b a s ep a i r s c o m p l e m e n t a r yd n a d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d i o x yn u e l e i o t i d et r i p h o s p h a t e s d a y e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ea c i d f l a v a n o n e3 - h y d r o x y l a s e f r u c t o k i n a s e h o u r i s o p r o p y t h i o 1 3 - d - g a l a c t o s i d e l u r i 手b e r t a n im e d i a m i n u t e s o d i u ma c e t a t e n e s t e du n i v e r s a lp r i m e r o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o l y v i n y lp o l y p y r r o l i d o n e r a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d s r i b o n u e l e i da c i d r n a a s e r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e r e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r s e c o n d s o d i u md o d e c y is u l f a t e t r i - h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e u n i v e r s a lp r i m e rm i x 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 i n d o l y l p d - g a l a c t o s i d e i v 中文全称 氨苄青霉素 碱基对 互补d n a 焦碳酸二乙脂 脱氧核苷三磷酸 天 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 荧烷酮3 羟化酶 果糖激酶 小时 异丙基硫代1 3d 半乳糖苷 l b 培养基 分钟 醋酸钠 巢式通用引物 光密度 多聚酶链式反应 聚乙烯聚吡咯烷酮 c d n a 末端的快速扩增 核糖核酸 核糖核酸酶 每分转 反转录p c r 秒 十二烷基磺酸钠 三羟甲基氨基甲烷 通用引物 5 溴4 氯- 3 吲哚1 3d 半乳糖 苷 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学纵毕必论文作者亲笔签名：魂带诵 日期：m f 加 彳 i n 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。忆厂 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：日期： 指导教师亲笔签名：1 啪锄 日期：彤多矿 福建农林大学硕士学位论文 引言 引言 l 研究背景 龙眼( d i m d c a r p u s 肠n g a n al o u r ) 是原产于我国南部及西南部热带亚热带地区 的名贵水果，果实营养丰富，风味独特，具有很高的食用价值及医疗保健价值， 历来深受人们的喜爱。在龙眼生产上，果核大小是影响果实品质的一个重要因素。 因此，培育胚胎中途败育的焦( 小) 核优良品种，在生产上有重要价值。荔枝已 有许多大面积种植的焦( 小) 核生产品种，而在龙眼中缺乏具有焦核性状的生产 品种，且传统的育种方法难以转移焦核性状。龙眼的果核( 种子) 大小与胚胎发 育状况直接相关，胚胎早期或中途败育是小( 细) 核果形成的原因【l 】。因此开展 龙眼胚胎发育相关基因的研究具有重要理论和生产意义。从分子生物学角度看， 植物胚胎的分化发育过程是基因在机体内外因素协同作用下，在时间和空间上顺 序表达的过程。本研究是在对龙眼胚胎发育不同时期蛋白质组研究的基础上，研 究胚胎发育相关基因，分析其功能与胚胎发育的关系，从分子水平上揭示龙眼胚 胎发育与分化的本质，为最终实现胚胎发育的基因调控奠定基础。 李燕对“立冬本”和“红核子”龙眼合子胚发育不同时期的蛋白质组进行分离 比较，得到清晰的电泳图谱。结果显示龙眼胚胎不同发育时期蛋白质组存在差异， 分离到上调和下调差异蛋白质3 6 个，并通过m a l d i t o f 僦a i ，d i j o f - t o f 初步 鉴定了“立冬本”龙眼胚胎中的1 2 个蛋白质。包括黄烷酮一3 一羟化酶( f l a v a n o n e 3 - h y d r o x y l a s e ，f 3 m 、果糖激酶( f r u c t o k i n a s e ，f r k ) ，其中f 3 h 为差异蛋白， f r k 为持家蛋白。初步推测乃聪因、豫踺因在龙眼胚胎发育过程中起着重要 作用【2 l 。 2 植物胚胎发育相关基因的研究进展 2 1 概述 植物胚胎发生是指单细胞的受精卵经过一系列受控的细胞分裂和分化，发育 为成熟的多细胞种胚的过程，也是一个基因有序的选择性表达调控的过程。植物 胚胎发育首先是形态发生阶段，产生组织和器官的原基，然后是种子后熟阶段。 传统的植物胚胎学研究如形态学、细胞胚胎学以及生理生化的研究，为目前胚胎 发育的分子生物学研究奠定了坚实的基础。合子胚的发生是在胚囊中进行的，对 福建农林大学硕士学位论文引言 早期合子胚直接进行操作几乎是不可能的。上世纪5 0 年代末证实植物体细胞全能 性，使培养体细胞胚变成可能，为研究植物胚胎发生提供了替代系统。近年来， 对体细胞胚，特别是在一些模式植物如拟南芥、水稻、胡萝卜、烟草的体细胞胚 的研究使人们对胚胎发生的基因调控了解深入了许多。许多基因的基本功能已被 阐明。 l e c l ( l e a f y c o t y l e d o n l ) 基因是子叶特化以及胚胎成熟所必需的，活化 胚胎发生以及胚胎分化所必需基因的表达。胚胎发生早期，l e c l 是决定胚柄形 成和子叶分化必须的。在胚胎发育后期，l e c l 是种子成熟中许多程序必需的， 包括干燥耐受性的获得和储藏物的积累 3 1 。l e c 2 ( l e a f y c o t y l e d o n 2 ) 编码一 个含b 3 区域( 植物特有的一种d n a 结合基序) 的转录调控因子，它控制胚发 育的正确启动，在胚发育早期和后期均大量表达 4 1 。l i l ( l e c l - l i k e ) 基因与l e c l 同源性很高。抑制三皿和l e c l 基因的表达产生不同的胚胎表型。皿的反义r n a 能抑制引起胚胎停止在球型胚期，且突变胚不能被拯救，而l e c l 基因突变体停 止在胚胎发育的较后期，突变体在干燥前可被拯救成为有活力的幼苗1 5 】。 g n ( g n d m e m b 3 0 ) 基因与建立极性有关。罐因在胚胎发育过程中持续表 达，编码的蛋白质可能参与囊泡的定向运输，从而影响细胞的分裂、延伸和粘连， 稳定胚体顶端基部轴的功能，促进合子的非对称分裂，最终形成顶端和基部的 区域。该基因的突变体造成胚胎失去根部和下胚轴 6 1 。g k ( g u r k e ) 基因的突变 特异性影响胚胎顶部区域的产生，胚胎的顶端区域和中部区域都需要罐因r 7 1 。 玉米k n o t t e d ( k n i ) 基因是第一个从植物中克隆出的同源异形盒基因( h o m e o b o x g e n e ) 。在胚胎发生中的器官分化之前表达，原位杂交显示玉州表达的位置对顶端 分生组织形成起重要作用i s l 。r s h 俾d d 煳d 互明伊d n z d e f e c t w e ) 是 发育期胚胎细胞中胞浆移动时细胞板的正确定位所必需的。尉日对合子的第一次 不对称分裂产生影响。该基因编码一个富含h y p 的糖蛋白型的细胞壁蛋白，分布 在整个细胞壁 9 1 。f k ( f a c k e l ) 基因的产物是参与脂类生物合成的一种固醇还原 酶( s t e r o lc 1 4r e d u c t a s e ) ，它影响发育中胚细胞的分裂、扩展和有序排列。f k 基因突变特异地减少了下胚轴形成，在外观表现为子叶直接与根相连【1 0 1 。 b b m ( b a b y b o o m ) 与转录因子的a p 2 e r f 家族相似。其在发育的种子中的表 达模式和b b m j 醴_ 表达的表型说明这个基因促进细胞增殖和胚胎发生时的形态发 2 福建农林大学硕士学位论文引言 生【u 】。m p ( m o n o p t e r o s ) 基因编码一种含d n a 结合域的蛋白质，它影响胚中维 管组织和胚体模式的建立【1 2 1 。s t m 0 r 彪欧四z e 尬e 镕) 【1 3 】、g 蛋白的b 亚基【1 4 1 、p g a 61 1 5 】、热激蛋白基因( h s p s ) 【1 6 1 、转录因子、种子贮藏蛋白等等 和胚胎发育相关基因也已被分离克隆( g e n b a n k ，2 0 0 8 ) 。 木本果树胚胎发育的研究正由胚胎发育的生理生化基础研究过渡到分子生 物学的研究。王风华采用m r n a 差别显示技术对龙眼体细胞胚胎发生整个过程中 的m r n a 变化进行分析，获得3 0 条差异e d n a 片段，经n o和反 杂交r t h e r a n o r t h e r n 获得阳性片段5 条。其d ? l o n g a n l 与番茄彳灌因具有较高的同源性，推钡t j l o n g a n l 可能是龙眼体细胞胚胎中存在的彳剧睡因，其余4 条均没有在g e n b a n k 中发现同源 基因【1 7 】。郭志雄从龙眼体胚中分离出乙醇脱氢酶并对其c d n a 进行克隆1 8 1 。 2 2 植物黄烷酮- 3 羟化酶( f l a v a n o n e3 - h y d r o x y l a s e ，f 3 n ) 基因的研究 黄烷酮3 羟化酶( f 3 h ) 是黄酮类化合物合成途径中的一个关键酶，是花色 素苷合成途径中的结构基因。花色素苷的合成前体丙二酰c o a 和香豆酰c o a ， 在查耳酮合成酶( c h s ) 和查耳酮异构酶( c h i ) 催化下合成无色的4 ，5 ，7 三羟 基黄烷酮，f 3 h 催化4 ，5 ，7 三羟基黄烷酮c 3 位的羟化，生成二氢莰非醇( d h k ) ， d h k 是合成黄酮醇和花色素的重要中间产物【l 鄹。f 3 h 属于依赖2 酮戊二酸的双 加氧酶，反应需要2 酮戊二酸、分子氧、铁和抗坏血酸【2 0 】。f 3 h 的活性最初是 在紫罗兰的花中检测到的【2 l 】。1 9 9 1 年，m a r t i n 等利用鉴别筛选与基因图谱技术 首次从金鱼草中分离克隆到丹日基因 2 2 1 。接着b r i t s c h 等利用酶纯化法在矮牵牛 中分离出乃基因1 2 3 1 。在矮牵牛中，该酶的分子量大约4 2 k d a ，由3 6 9 个氨基 酸组成，其中h i s 2 2 0 ，h i s 2 7 8 ，a r 9 2 2 2 ，s e r 2 9 0 残基对酶的活性起至关重要的作用【2 4 1 。 目前拟南芥、矮牵牛、玉米、茄子、苜蓿、葡萄、苹果、柑橘、梨、康乃馨、翠 菊、日本牵牛等植物中也都克隆到f 3 h 基因( g e n b a n k2 0 0 8 ) 。研究表明，f 3 h 基因在一些植物中是独立表达的，如矮牵牛中的乃日基因，而在大多数情况下， 乃日是和其上游的c h s 、c h i 基因以及下游的d f r 基因协同表达的【2 2 】。在大多 数物种中丹h 基因仅以单拷贝形式存在【2 5 之7 】。对矮牵牛和金鱼草乃h 基因的调 控研究显示，f 3 h 基因突变失活可阻断花色素的合成通道，产生白花的矮牵牛或 金鱼草 2 2 , 2 3 1 。在金鱼草中，乃日基因已有3 个调节位点d e l 、e l u t a 和r o s e a 被 鉴定，这3 个位点的突变都导致向日基因表达量的下降瞄 2 引。木本果树中对乃日 3 福建农林大学硕士学位论文 引言 基因的研究远远落后于模式植物。 2 3 植物果糖激酶( f r u c t o k i n a s e ，f r k ) 基因的研究 在植物体内的代谢活动中，果糖和葡萄糖必须经过磷酸化才能进入糖酵解途 径。果糖由果糖激酶催化生成6 磷酸果糖，6 磷酸果糖转化成1 ，6 一二磷酸果糖， 接着由醛缩酶催化裂解形成磷酸二羟丙酮和3 磷酸甘油醛，磷酸二羟丙酮经过磷 酸三碳糖异构酶作用后生成3 一磷酸甘油醛后可进入糖酵解途径( e m p ) ，3 一磷酸 甘油醛经过一系列生化反应后被催化生成乙酰辅酶a ，最后进入三羧酸循环 ( t c a c ) 。e m p t c a 是植物有氧呼吸的主要途径，是植物体中物质代谢和能量 代谢的枢纽，己糖的磷酸化对维持植物合成淀粉的碳流和呼吸作用是必不可少 的。磷酸化的己糖进入糖酵解途径后，为植物的生理活动提供能量和中间代谢产 物。催化己糖磷酸化的酶统称为己糖激酶。广义的已糖激酶根据底物特异性和功 能的不同又分为已糖激酶( h e x o k i n a s e ，舣k ) 、葡萄糖激酶( g l u c o l ( i n a s e ，g l k ) 和果糖激酶( f r u c t o k i n a s e ，f r k ) 。对果糖特异的己糖激酶同工酶被命名为果糖激 酶。果糖激酶对果糖的亲和性远大于己糖激酶，目前普遍认为在果糖分解代谢中， 果糖激酶起主要作用【2 9 1 。同时还有研究表明，己糖激酶( 包括果糖激酶) 也参 与植物的糖感受和信号转导过程，己糖激酶的信号转导途径调节着植物生长发育 和基因表达【3 0 。2 1 。f r k 磷酸化果糖的k m 值从4 1 p m 到2 2 0 p m ，从酵母细胞中提取 并表达的植物f r k 的k m 高达1 2 m m ，它对果糖特异，并在果糖生理浓度( o 5 r a m ) 时大多表现为底物抑制作用 3 3 , 3 4 。目前已从拟南芥、马铃薯、番茄、柑 橘、水稻、玉米、甜菜等植物的组织中克隆出果糖激酶【3 5 , 3 6 1 ( g e n b a n k2 0 0 8 ) ， 这些基因之间具有较高的同源性。 3r a c e 的研究及其在植物基因克隆上的应用 3 1r a c e 原理 基因表达水平和模式的变化驱动着生物体内主要的生物学过程。分离和克隆 基因是研究基因结构、功能以及表达的基础。r a c e ( r a p i d a m p l i f i c a t i o no f c d n a e n d s ) 是基于p c r 技术基础上由已知的一段e d n a 序列来得到完整的e d n a 的 5 端和3 端，又被称为单边p c r ( o n e s i d e dp c r ) 和锚定p c r ( a 1 1 c h o r e dp c r ) 【3 7 】 o 3 - r a c e 利用m r n a3 末端天然存在的p o l y ( a ) 尾作为p c r 扩增的通用 4 福建农林大学硕士学位论文引言 引发点。首先用反转录酶和o l i g o d t 接头引物对m r n a s 进行反转录，得到 e d n a 第一链。然后，用一个能与已知外显子序列区退火的基因特异引物( g s p ) 和定位在p o l y ( a ) 尾部的接头引物直接进行p c r ，扩增特异e d n a 。这样，就能 捕获位于外显子和p o l y ( a ) 尾之间的未知3 - m r n a 序列【3 引。 同样的原理可用来获得e d n a5 末端。用一个反向的g s p 在反转录酶 ( r e v e r s et r a n s c f i p t a s e ，蛐作用下反转录总r n a 得到第一链e d n a ，再用脱氧 核糖核苷酸末端转移酶( t d t ) 给e d n a 的57 末端进行同聚物加尾反应，从而在 未知的e d n a 的5 端加上一个接头，然后再用g s p 和接头引物经p c r 扩增出 未知m r n a 的5 端。若第一轮扩增有非特异条带的产生，可以进行第二轮扩增 ( 巢式p c r ) 。扩增得到的双链e d n a 用限制性内切酶酶切和s o u t h e r nb l o t 分析 并克隆。最终，从2 个有相互重叠序列的3 和5 r a c e 产物中获得全长e d n a ， 或者通过分析r a c e 产物的3 和57 端序列，合成相应引物扩增出全长 e d n a 3 s 】。 3 2r a c e 技术的优点 近年来随着生物技术的发展，出现许多克隆基因的方法和手段，如图谱克隆 技术、转座子标签技术、m r n a 差异显示技术、基因组减法技术以及e d n a 文库 筛选技术等。但这些方法大多具有实验周期长，技术步骤繁琐且工作量大等特点， e d n a 文库筛选技术是一种经典的克隆基因的方法，但也常出现扩增效率低和特 异性差的问题，不易得到完整的全长基因，特别是基因的5 端。r a c e 技术是一 种从低丰度的转录本中快速扩增e d n a5 和3 的简单有效的方法。相比上述方 法，其具有以下优点：1 ) 费用相对较廉价，实验周期短，操作步骤也比较简便快 速和有效；2 ) 只需要少量的起始物，可从低丰度的转录本中快速扩增c d n a 的5 和3 端；3 ) r a c e 能产生大量的独立克隆，并有可能获得特殊的转录物如选择 性剪接物等【3 9 j 。 3 3r a c e 在植物基因克隆上的应用 r a c e 技术已经被大量应用于植物的分子生物学研究中。主要应用是在获得 全长c d n a 序列上，例如李明等利用r a c e 技术从苹果果实中克隆出细胞质型苹 果酸酶基因e d n a 全长【4 0 1 。r a c e 还可以应用于筛选e d n a 文库，克隆已知序列的 邻近内部序列，分离调控元件或被选择性剪接等特殊转录物p 9 1 。 5 福建农林大学硕士学位论文 引言 4 研究展望 综上所述，开展龙眼胚胎发育相关基因的克隆研究，并分析其功能与胚胎发 育的关系，对揭示龙眼胚胎发育与分化的分子本质有重要的意义。胚胎发育相关 基因常常是其生命过程中必不可少的，因此胚胎发育相关基因的突变将导致胚 胎败育。本研究为进一步实现基因调控，利用基因工程技术培育优质果( 小核或 焦核) 奠定实验基础，使培育胚胎中途败育的焦( 小) 核优良品种在龙眼生产上 的重要价值成为可能。除了在龙眼生产上的意义，它也将为其他果树植物胚胎发 育的研究提供一些参考，无论在学术还是生产应用中都具有一定的价值。 6 福建农林大学硕士学位论文第一章龙眼胚胎f 3 h 基因c d n a 全长的克隆 第一章龙眼胚胎f 3 h 基因c d n a 全长的克隆 李燕对“立冬本龙眼合子胚发育不同时期的蛋白质组进行分离比较，得到 上调和下调差异蛋白质3 6 个，并通过m a l d i t o f m a l d i t o f t o f 初步鉴定 了“立冬本龙眼胚胎中的1 2 个蛋白质，其中之一经串联质谱分析为黄烷酮3 羟化酶( f l a v a n o n e3 - h y d r o x y l a s e ，f 3 h ) 1 2 。初步研究显示f 3 h 在龙眼合子胚发育 过程中呈显著上调表达，但其参与胚胎发育的机制不明。为了进一步开展f 3 h 基因与龙眼胚胎发育关系的探讨，本研究对龙眼胚胎f 3 h 基因进行了克隆。 1 材料与方法 1 1 材料 试材龙眼“立冬本”采自福建省农科院果树研究所。分别选取生长发育正常 的植株3 株，于谢花后3 l 、3 8 、4 5 、5 2 、5 9d 采集发育正常的幼果，剥离胚胎， 用液n 2 速冻，保存在7 0 冰箱备用。 1 2 仪器与试剂 台式高速冷冻离心机a v a n t i3 0 为b e c k m a n 公司产品，梯度p c r 仪tg r a d i e n t 为 b i o m e t r a 公司产品，水平电泳槽d y c p 3 1 b m ，d y c p 3 l d 以及电泳仪d y y - 6 c 为 北京市六一仪器厂产品，超净工作台，台式冷冻恒温振荡器。 用于r n a 提取的研钵、药匙、镊子、5 0m l 离心管、试剂瓶等器具用0 i d e p c 处理过夜，无r n a 酶的专用枪头、p c r 管、1 m l 离心管等耗材，购习：i n v i t r o g e n 公司。 p v p p 、s d s 为s i g m a 分装试剂；t r i s h c l 、e d t a 、l i c l 、b 巯基乙醇、d e p c 、 氨苄青霉素、x g a l 为a m r e s c o 分装试剂；t r i s 饱和酚( p h 8 0 ) 试剂购- 于：i l 京索莱 宝科技有限公司；r e v e r t a i d t mf i r s ts t r a n de d n as y n t h e s i s 试剂盒购于f e r m e n t a s 公司；s m a r r a c ee d n aa m p l i f i c a t i o n 试剂盒购于c l o n t e c h 公司；r n a f r e e d n a s e 、d n a l i g a t i o nk i t 购于p r o m e g a 公司；t a q 酶、m a r k e rd l 2 0 0 0 购于大 连宝生物有限公司( t a k a r a ) ；b 型小量d n a 片段快速回收试剂盒购于北京博 大泰克基因技术有限责任公司；e z n a 质粒提取& 纯化试剂盒购于o m e g a 7 福建农林大学硕士学位论文第一章龙眼胚胎f 3 h 基因c d n a 全长的克隆 公司；胰蛋白胨、酵母提取物购于o x o i d 公司；琼脂糖购于m d b i o 公司；i p t g 为m e r c k 公司产品。其他常规试剂均为国产分析纯和超纯试剂。 1 3 引物合成与测序 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司英骏生物技术有限公司合成； 测序由上海生工生物工程技术服务有限公司，英骏生物技术有限公司和t a k a r a 生物工程( 大连) 有限公司完成。 1 4 龙眼胚胎总r n a 的提取与纯化 1 4 1 龙眼胚胎总r n a 的提取 龙眼胚胎总r n a 的提取方法参考郭志雄龙眼胚胎乙醇脱氢酶的分离纯化、 鉴定及其c d n a 克隆f 1 8 1 。 ( 1 ) 取龙眼胚胎2 0g 、p v p p0 4g 用液氮研磨成粉末，加入1 6m l 的裂解液 ( o 1m o l lt r i s - h c lp h 8 0 、o 1m o l ln a c i 、2 0m m o l le d t a 、i s d s ) 和4 8 0w e 的p 巯基乙醇，强力涡旋震荡。 ( 2 ) 6 5 水浴裂解3 0m i n ，间或震荡。 ( 3 ) 加入等体积的t r i s 饱和酚( p h 8 o ) ，强力涡旋震荡，4 下1 2 0 0 0r p m 离心 1 0 m i n 。 ( 4 ) 取上相，加入等体积的氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) ，强力涡旋震荡，4 下1 2 0 0 0r p m 离心1 0 m i n 。 ( 5 ) 取上相，加入1 3 体积的8m o l l 的l i c l 溶液，置于2 0 沉淀lh 以上。 ( 6 ) 4 下1 5 0 0 0r p m 离心3 0m i n ，弃上清，加入5 0 0 此的d e p c - h 2 0 溶解 沉淀，转移至1 5m l 的离心管。 ( 7 ) 加入1 1 0 体积3 0m o l l n a a c ( p h 5 2 ) ，2 体积无水乙醇，2 0 沉淀3 0r a i n 。 ( 8 ) 4 下1 5 0 0 0r p m 离心3 0m i n ，弃上清，7 5 乙醇漂洗两次，遗弃乙醇溶 液，放置1 0r a i n ，使残余的乙醇挥发。 ( 9 ) 加入3 0w ed e p c h 2 0 溶解r n a 。取5 此用于电泳检测，其余冻存备用。 1 4 2 龙眼胚胎总r n a 的纯化 电泳检测结果显示所提取的r n a 有d n a 污染，需对r n a 进行纯化。 ( 1 ) 将r n a 溶解至2 0 0w e ，加入0 5 1w e 的r n a f r e ed n a s e ，3 7 保温 3 0m i n 。 8 福建农林大学硕士学位论文第一章龙眼胚胎f 3 h 基因e d n a 全长的克隆 ( 2 ) 6 5 灭活d n a s e l 0m i n 。 ( 3 ) 加入等体积的氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) ，强力震荡，4 下1 2 0 0 0r p m 离心1 0 m i n 。 ( 4 ) 加入1 1 0 体积3 0m o l ln a a c ( p h 5 2 ) ，2 体积无水乙醇，2 0 沉淀 3 0 m i n 。 ( 5 ) 4 下1 5 0 0 0r p m 离心3 0m i n ，弃上清，7 5 乙醇漂洗两次，遗弃乙醇溶 液，放置1 0m i l l ，使残余的乙醇挥发。 ( 6 ) 加入3 0 此d e p c h 2 0 溶解r n a ，取5 此用于1 琼脂糖电泳检测，2 此 测定o d 2 砷、o d 2 s o 、o i ) 2 6 0 o d 2 8 0 ，其余冻存备用。 1 5 龙眼胚胎f 3 h 保守区的克隆 1 5 1 引物设计 根据山茶、柑橘、苹果、梨等f 3 h 基因的c d n a 序列设计一对核苷酸引物 p l 、p 2 。引物序列如下： 上游引物p 1 ：57 c a a g a c t g g c g t g a a a t a g t g a c 3 下游引物p 2 ：57 一c 1 广r g c t c a t c t t c c t c c t g l a c 3 1 5 2c d n a 的合成 c d n a 的合成采用f e r m e n t a s 公司的r e v e r t a i d t mf i r s ts t r a n dc d n a s y n t h e s i s 试剂盒进行。 ( 1 ) 将1 5m l 的离心管置于冰上，加入 总r n a 3 “l o l i g o ( d t ) 1 8p r i m e r ( 0 5p g p l ) lp l d e p c - t r e a t e dw a t e r 加至1 2 肛l ，混匀，离心3 5s ； ( 2 ) 7 0 温浴5m i n ，置冰上冷却，离心； ( 3 ) 将离心管置于冰上，依次加入： 5x r e a c t i o nb u f f e r 4i t l r i b o l o c k t mr i b o n u c l e a s ei n h i b i t o r ( 2 0u p l ) 1 “l 1 0m m o l l d n t pm i x 2 “l 混匀，离心； ( 4 ) 3 7 保温5m i n ，冰上冷却1 2m i n ，加入ll a lr e v e r ta i d t mm m u l v r e v e r s et r a n s c r i p t a s e ( 2 0 0u p l ) ，混匀，离心3 , - - 5s ： 9 福建农林大学硕上学位论文第一章龙眼胚胎f 3 h 基因c d n a 全长的克隆 ( 5 ) 4 2 保温6 0m i r a ( 6 ) 7 0 保温1 0m i n ，冰上冷却l - 2m i n ，离心3 - 5s ； 取5p l 逆转录产物电泳检测，其余置- - 2 0 保存备用。 1 5 3r 1 、- p c r 在p c r 管中配置以下反应体系： 1 0 e xt a qb u f f e r 5p l 2 5m m o l l d n t p 4 l p 1 ( 1 0i - t m o l l ) 2g l p 2 ( 1 0i _ t m o l l ) 2g l c d n a2g l h 2 0 3 4 7 5p l e xt a q ( 5u i _ t l )0 2 5p l p c r 扩增条件： 9 4 5m i n ；9 4 lm i n ，5 5 4 0s ，7 2 4 0s ，3 5 个循 环扩增；4 保存。反应结束，经1 的琼脂糖电泳检测后，回收纯化目的片段。 1 5 4 目的片段的回收纯化 采用北京博大泰克基因技术有限责任公司b 型小量d n a 片段快速回收试剂 盒进行胶回收。 ( 1 ) 上样电泳，在紫外灯下用干净的手术刀切下目的条带，胶块尽量小，放入 1 5m le p 管中，加入7 0 0g l 溶胶液，室温或5 5 水浴溶胶，期间偶尔摇 动，至胶完全溶解；