蛋白质结构与功能的NMR研究.ppt

蛋白质分子溶液结构与功能的nmr研究部分,蛋白质的nmr研究内容,蛋白质溶液三级结构的测定蛋白质的构象变化蛋白质与靶分子（靶蛋白、核酸、配体小分子、药物）的相互作用蛋白质的动态特性蛋白质的折叠机制和折叠路径,一.确定生物分子的溶液三维结构,蛋白质分子：天然态蛋白质、突变体蛋白质、部分折叠态蛋白质、非天然态蛋白质。核酸分子：dna、rna蛋白质复合物：蛋白质与蛋白质复合物、蛋白质与dna或rna复合物，蛋白质与药物小分子复合物、蛋白质与拮抗剂小分子复合物。,蛋白质溶液三维结构确定的技术基础,高场核磁共振波谱仪的发展500mhz600mhz750mhz800mhz900mhz多维（二维、三维、四维）核磁共振实验技术的发展梯度场多维nmr脉冲程序trosy类型多维nmr脉冲程序取向介质中蛋白质残余偶极相互作用检测方法处理和解析多维核磁共振数据的软件开发研究,蛋白质溶液三维结构确定的重要性,蛋白质结构与功能关系研究的重要部分蛋白质一级结构决定三级结构研究的基础可在结构基础上研究蛋白质发挥生理功能的活性部位可在结构基础上研究蛋白质内运动与功能特性的关系蛋白质动态特性与结构特性密切相关,二.天然态蛋白质结构功能研究,蛋白质与药物小分子、拮抗剂等结合的活性部位确定蛋白质发挥生理功能时活性部位的构象变化蛋白质动态特性与功能的关系蛋白质折叠/去折叠蛋白质稳定性蛋白质在水溶液中多构象的平衡蛋白质肽键的顺反异构与功能关系蛋白质中的水分子,research:3dsolutionstructurenoe,3jn,3j,hydrogen-bondbindingsitenoe,3jn,3j,hydrogen-bondconformationalchangenoe,3jn,3j,hydrogen-bondfolding/unfoldingnoe,h,3jnbackbonedynamics15n-t1,15n-t2,15n-noe,h/dexchangeprotein-proteininteractionnoe,hprotein-nucleicacidinteractionnoe,h,三.蛋白质复合物相互作用的研究,蛋白质与蛋白质相互作用研究蛋白质与核酸相互作用研究蛋白质与拮抗剂和底物小分子相互作用靶蛋白质与药物小分子相互作用,research:conformationofthecomplexconformationofproteinconformationofsubstrate,peptide,-bindingsiteonproteinbindinginterfacemethodology:isotopelabelingofproteinisotopelabelingofnucleicacidisotopelabelingofpeptidehetero-nuclearfilteringnmrexperimentsdockingbyusingsoftwarepackage,四.非天然态蛋白质的研究蛋白质片段的溶液构象变性剂作用下蛋白质的动态特性变化脲变性、酸变性蛋白质的特性与残存结构五.膜蛋白质分子的研究膜蛋白质与膜脂分子相互作用,studyofnon-nativeprotein,research:refoldingprocessofproteindynamicpropertiesofnon-nativeproteinresidualstructuresofproteinproblems:extensiveoverlapofpeaksreducingthenoesaveragedoveranensembleofconformationsbroadlinewidthsmethodology:isotopelabelingofproteinsite-directedmutagenesishydrogen-exchangepulselabeling,多维nmr研究蛋白质溶液三维空间结构及功能关系,nmr方法是确定蛋白质溶液三维结构的唯一有效手段,确定蛋白质溶液三维结构的重要性：蛋白质结构与功能关系研究的重要部分蛋白质一级结构决定三级结构研究的基础是研究蛋白质发挥生理功能的活性部位的必要条件可在结构基础上研究蛋白质内运动与功能特性的关系蛋白质动态特性与结构特性密切相关,(1)多维nmr确定蛋白质分子溶液三维结构的基础,蛋白质的结构信息20种氨基酸：氨基酸由h、c、n、o、s等元素组成，提供链长和键角信息。蛋白质的一级结构：多肽链中氨基酸残基序列。提供蛋白质的氨基酸组分，排列顺序以及各类原子数。蛋白质的二级结构：蛋白质分子不同肽段主链原子在三维空间中不同的排列规律性，表现为-螺旋，-片层、转角和环等基本结构单元。在不同二级结构单元的肽段中，肽键的二面角不同，主链氢原子间的相对位置或距离不同。蛋白质的三级结构：蛋白质的二级结构单元在三维空间中的相对排列，提供原子间的远程距离信息。,核磁共振波谱信息化学位移：氨基酸的h、c原子的核磁共振峰在-螺旋与链中的化学位移分布呈现规律性的差异。j-偶合：反映了肽键的二面角(，)大小。-螺旋和片层二级结构单元中的j-偶合数值范围不同。noe：核自旋之间的偶极偶极相互作用产生的交叉驰豫导致noe现象，在两个核之间的距离小于5时可以观察到noe信号。,波谱信息与结构信息的对应化学位移可以直接用作判别形成螺旋、片层的氨基酸残基肽段的实验依据。j耦合可用以直接确定肽键的二面角，。noe信号强度与两个核之间的距离六次方成反比。由noe强度可以确定两个原子之间的距离，在螺旋与片层中氢原子之间的noe强度呈现不同的特征。可用以精确地测定螺旋与片层。由主链原子间远程相互作用提供的noe可以精确地测定蛋白质分子的三级折叠。,多维nmr确定蛋白质分子溶液三维结构的流程图,nmr研究蛋白质中存在的问题,同核(1h-1h)nmr在确定蛋白质溶液的结构方面，可以获得小于100个残基的小蛋白的溶液结构，在准确度方面类似于2.0-2.5分辨率的晶体结构随着蛋白质分子量的进一步提高，由于化学位移的重叠或简并，使得在(1h-1h)nmr方法中所使用的自旋系统识别和序列识别方法不再完全有效其次是随着分子量增加，谱线变宽，因而使得较难利用建立在小的同核耦合(耦合常数12hz)之上的一些位移相关实验,金黄色葡萄球菌核酸酶9201hresonancesin10ppm72213cresonancesin185ppm14315nresonancesin220ppm,小蛋白和大蛋白二维同核nmr谱的比较,bmp02(28个残基)adr6(115个残基)部分noesy谱,增加nmr波谱的维数,从二维扩展到四维可提高谱图分辨率,二维三维四维,1h/13c/15n多维核磁共振波谱示意图,单键异核耦合用于磁化强度传递,磁化矢量之间的传递是建立不同自旋之间联系的方式，也是多维核磁共振方法的基础。溶液核磁共振方法中常见的传递方式，一是通过跨键连接，也就是标量耦合进行传递，如同核传递，异核传递；二是通过跨空间相互作用。对于1h的同核传递通过3jhh，一般取1/(2*3jhh)，约3080ms。对于脂肪链13c同核传递通过1jcc传递，一般取3/(4*1jcc)，约1020ms。对于1h-13c的异核传递通过1jch，一般取0.8/1jch，约6.7ms。,蛋白质分子稳定同位素(13c,15n)标记,(2)蛋白质样品的准备,需要对白质分子进行稳定同位素(13c,15n)标记forproteinofm.w.upto20kda50%2hlabeling95%ul15nlabeling98%ul13clabeling95%ul15n,98%ul13clabelingforproteinofm.w.40kdaorhigher50%2h,95%ul15n,98%ul13clabeling,(3)基本的多维nmr实验,multi-dimensionalnmrpulseprogram:forbackboneresonanceassignmentsforside-chainresonanceassignmentsfornoemeasurementsforj-couplingconstantmeasurementsforh/dexchangeexperimentsfor15nrelaxationexperiments,三维异核实验脉冲程序：用于氨基酸残基序列(主链)指认的脉冲程序3d1h-15n-13chnca,hnco,hn(ca)co,hn(co)ca,hn(ca)ha,hcaco,hca(co)n用于氨基酸残基的侧链指认的脉冲程序3d1h-15n-13ccbca(co)nh,hncacb,hbha(cbcaco)nh,cc(co)nh3d1h-13chcch-cosy,hcch-tocsy,cbca(co)nh脉冲程序:顶部是磁化矢量传递路径，紧挨其下的i3,i2等对应于不同的磁性核。=10；=y；1=y；2=x,-x频率分辨（tppi或者states-tppi）；3=x；4=x；5=2(x),2(-x)；rec=x,2(-x),x。,(4)三维nmr波谱分析,共振峰指认共振谱峰分布范围1h：10ppm；13c：185ppm；15n：220ppm两种指认策略：,三维异核波谱谱峰指认(基于j耦合的共振峰指认):首先完成氨基酸序列(主链)指认然后进行氨基酸残基的侧链(自旋系统)指认,snase的hnca谱,snase的hnca和hnco波谱,ssh10bcbca(co)nh/hncacb谱k64-k68条带图。从左到右，每个残基的cbca(co)nh和hncacb谱图依次相邻。hncacb谱上浅色的峰是负峰。,ssh10bhnco/hn(ca)co谱k64-k68条带图。从左到右，每个残基的hnco谱和hn(ca)co谱依次相邻。,ssh10b的hbha(co)nh和hbhanh实验，s79g82条带图。从左到右，每个残基的hbha(co)nh和hbhanh谱图依次相邻。标的是1h，标的是1h。在谱上，1h和1h符号相反。,ssh10b残基i76的cc(co)nh和hcch-tocsy谱。（a）cc(co)nh实验的15n平面；（b）hcch-tocsy实验i76的侧链13c各个对应的1h-1h平面。,noe共振峰指认1h-15nnoesy-hsqc,蛋白质中常见二级结构单元典型的noe相关性,characteristicsofsecondarystructuralelements,(1)-helixstrongdnn(i,i+1)noes(continuousstretch)strongdn(i,i)anddn(i+1,i)noesmediumdn(i,i+3)noesdnn(i,i+2)noesd(i,i+3)noesweakorabsentdn(i,i+1)noes,(2)anti-parallelpleatedsheetstrongnoes:dn(i,i+1)mediumnoes:dnn(i-1,j+1)dnn(i+1,j-1)dn(i,j+1)dn(j,i+1)d(i,j)weakorabsentnoes:dnn(i,i+1),anti-parallelpleatedsheet图例,(3)parallelpleatedsheetstrongnoes:dn(i,i+1)mediumnoes:dn(i,j)ordn(j,i)weakorabsentnoes:dnn(i,i+1)nod(i,j);dnn(i-1,j+1);dnn(i+1,j-1)noes,(4)turnsreverseturnii:strongnoes:dn(2,3)2.segmentallabelling:discretesegmentsofthepolypeptidechainareuniformlylabelled;3.chemical-shiftmappingordifferentialchemical-shiftmapping检测底物小分子：basedont2andt1enhancement:thelargedifferencesintheratesofrotationalandtranslationalmotionsofasmallmoleculeinthefreestaterelativetowhenitisboundtoamacromolecule新的脉冲方法：sea-trosy:selectssolvent-exposedamideprotonsinuniformlydeuterated15n-labelledproteinsdissolvedinh2obymagnetizationtransferfromh2o.,二氢叶酸还原酶(dhpr),met-13ch3resonanceregiona.chemical-shiftmapping方法：绿色表示没有底物存在，蓝色表示存在底物类似物pyridine-2,6-dicarboxylate(pdc)b.differentialchemical-shiftmapping方法：蓝色表示结合pdc，红色表示结合4-chloro-pdc.,sea-trosy脉冲方法,conventional15n,1h-hsqc,15n,1h-trosy,sea-trosyselectssolvent-exposed1hn,methodsbasedont2andt1enhancement,1.t2(小分子)t2(蛋白质)theresonancelinesinthenmrspectraofsmallmoleculesaremuchnarrowerthanthoseinthespectraofmacromolecules.2.t1(小分子)transferrednoes:smallpositivenoesforfreesmallli